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문제 정의
- PSS 유전인자 보유 돼지의 90% 이상은 PSE 돈육을 생산하는 것으로 알려져 있어 물돼지 발생과 생산성 하락으로 경제적 손실을 초래하는 유전적 원인의 PSS 유전자를 검사하여 제거하는 것은 고품질 돼지고기 생산 및 국내 양돈산업의 경쟁력 향상에 매우 중요한 과제라고 할 수 있다. 따라서, 본 연구는 PCR-RFLP 및 PCR-SSCP 기법을 이용하여 PSE 돈육을 생산하는 PSS 돼지 유전자 진단기술을 개발하고 이를 이용한 국내 종돈 및 교잡 비육돈의 PSS 유전자형 출현빈도를 파악하고자 수행하였다. 돼지 PSS의 원인이 되는 RYR 유전자의 단일염기 돌연변이 (RYR1 CI843T)를 포함하는 DNA 영역을 PCR로 증폭한 후 RFLP 및 SSCP 기법을 이용하여 분석한 결과 동형접합체의 정상 개체(N/N), 이형접합체의 잠재성 개체 (N/n) 그리고 열성의 돌연변이 유전자를 동형접합체 상태로 갖는 PSS 감수성 개체 (n/n)에 각각 특이적인 RFLP 및 SSCP 유전자형이 검출되어 PSS 저항성, 잠재성 및 감수성 개체의 정확한 판별이 가능하였다.
- 즉, DNA 검사기법은 종래의 할로탄 검정법으로는 확인 불가능한 이형접합체의 잠재성 개체에 대한 검출이 가능하여 스트레스 감수성 돼지즉, PSE 육 생산돼지의 새로운 진단 방법으로 PSE 돈육 발생율 감소를 위한 PSS 유전인자의 검색에 이용할 수 있다. 본 연구는 기존의 halothane 검정법을 대체할 수 있는 새로운 돼지 PSS 유전자 진단기술로서 PCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism) 및 PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism) 두 종류의 DNA 검사 기법을 이용하여 PSE 돈육을 생산하는 PSS 돼지의 조기 진단 및 검출에 활용하고자 수행하였다.
제안 방법
- 659와 81 bp 두 종류의 증폭산물을 제한효소로 각각 절단하여 얻어진 DNA 단편은 TBE buffer(90mM tris-borate, 2mM EDTA, pH 8.0)을 이용하여 659 bp는 4% NuSieve GTG agarose gel 그리고 81 bp는 15% polyacrylamide gel로 으로 3~4시간 정도 전기영동하여 분리하고 영동 후 gel은 ethidium bromide 용액으로 염색하여 UV 상에 발현된 DNA band 양상을 관찰하고 각 검정 개체별 PSS 유전자형을 판정하였다.
- 합성하여 이용하였다. PCR-RFLP 분석을 위한 primer로서 659 bp 크기의 단편을 증폭하기 위하여 RYR-F 5'-TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACCAGT-3' 및 RYR-R5'-A TTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG-3' 그리고 81 bp 단편을 증폭하기 위하여 RYR1-F 5'-GTTCCCTGTGTGTGTGCAA TGGTG-3' 및 RYR1-R 5-'ATCTCTAGAGCCAGGGAGCAAG TTCTCTCAGTAAT-3, 를 각각 설계 합성하였다. 한편, PCR-SSCP 분석을 위한 primer는 1795번째부터 1928번째까지의 134 bp 단편을 증폭하기 위하여 RYR1-F 5'-GTGCTGGATG TCCTGTGTTCCCT-3' 및 RYR1-R 5'-CTGGTGACATAGTTG ATGAGGTTTG-3을 설계 합성하였다(Fig.
- SSCP 분석은 PCR 증폭 산물 3 μL에 5~6배의 formamide dye (98% formamide, 20mM EDTA, 0.05% bromophenol blue, 0.05% xylen cyanol)를 첨가하고 95℃에서 5분간 변성시킨 후즉시 ice 에 5분간 보관하여 reanriealing을 방지한 다음 10~12% 비변성 polyacylamide gel을 이용하여 전기영동을 실시한 후 silver staining으로 SSCP의 DNA band를 검출하고 각 banding pattern에 따른 PSS 유전자형을 판정하였다.
- 각 검정대상 공시돈으로부터 채취한 모근의 genomic DNA 추출은 Trommelen 등(1993)의 방법을 일부 변경하여 수행하였다. 즉, 두당 5~10개의 모근을 100% ethanol에 10초간 담근 후 3차 증류수로 수세하고 1.
- 돼지 RYR1 유전자의 PCR 증폭을 위한 반응 조건은 GeneAmp PCR System 9600(Perkin - Elmer Cetus, USA)을 이용하여 다음과 같은 조건하에서 실시하였다. 즉, PCR 반응액은 template DNA 50 ng, primer 각 0.
- 돼지의 RYR1 유전자 돌연변이를 검출하기 위하여 ryano-dine receptor cDNA의 염기서열상에서 염기치환 부분인 1843번째를 포함하는 영역을 증폭하기 위하여 3종류의 서로 다른 primer를 합성하여 이용하였다. PCR-RFLP 분석을 위한 primer로서 659 bp 크기의 단편을 증폭하기 위하여 RYR-F 5'-TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACCAGT-3' 및 RYR-R5'-A TTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG-3' 그리고 81 bp 단편을 증폭하기 위하여 RYR1-F 5'-GTTCCCTGTGTGTGTGCAA TGGTG-3' 및 RYR1-R 5-'ATCTCTAGAGCCAGGGAGCAAG TTCTCTCAGTAAT-3, 를 각각 설계 합성하였다.
- 즉, RYR1 유전자의 cDNA의 염기배열은 614번째 아미노산인 Vai의 codon으로서 GTG가 해당되고 615번째 아미노산으로 Arg는 CGC의 배열로서 이들 2개의 아미노산을 code하고 있는 부위 (GTGCGC)에 GCC▼C의 Hha I 제한효소의 인지 부위가 존재한다. 본 실험에서 PCR-RFLP 방법으로 PSS를 유발하는 RYR1 유전자의 단일 염기 돌연변이(C→T;Arg165→Cys)를 포함하는 659bp 부위를 PCR로 증폭한 다음 증폭산물을 Hha I 제한효소로 처 리하여 2% agarose gel 전기 영동법으로 검출한 DNA 유전자형은 Fig. 2와 같다. 즉, 돌연변이 유전자가 존재하지 않는 정상의 동형접 합체인 PSS 저 항성 개체(N/N)는 493 과 166 bp 2개의 band가 검출되었다.
- 돼지 RYR1 유전자의 PCR 증폭을 위한 반응 조건은 GeneAmp PCR System 9600(Perkin - Elmer Cetus, USA)을 이용하여 다음과 같은 조건하에서 실시하였다. 즉, PCR 반응액은 template DNA 50 ng, primer 각 0.5 μM, dNTP 각 200 μM, 10 X PCR buffer 5 μL 그리고 Taq DNA polymerase 1 unit를 첨가하여 PCR 반응액을 총 20 μL로 조정 하였다. PCR cycle은 최초 94℃에서 5분간 예비가열한 후 94℃에서 1분, 67℃에서 1분 그리고 72℃에서 1분간의 cycle을 총 35회 반복한 다음 마지막으로 72℃에서 5분간 가열하고 DNA 증폭과정을 종료하였다.
- 상등액에 phenol: chloroform: isoamylalco-hol(25: 24: 1)을 동량으로 첨가한 후 다시 12,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 spectrophotometer를 이 용하여 DNA 농도를 정 량한 후 PCR 증폭을 위한 template DNA 시료로 이용하였다.
- PCR-RFLP 분석을 위한 primer로서 659 bp 크기의 단편을 증폭하기 위하여 RYR-F 5'-TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACCAGT-3' 및 RYR-R5'-A TTCACCGGAGTGGAGTCTCTGAG-3' 그리고 81 bp 단편을 증폭하기 위하여 RYR1-F 5'-GTTCCCTGTGTGTGTGCAA TGGTG-3' 및 RYR1-R 5-'ATCTCTAGAGCCAGGGAGCAAG TTCTCTCAGTAAT-3, 를 각각 설계 합성하였다. 한편, PCR-SSCP 분석을 위한 primer는 1795번째부터 1928번째까지의 134 bp 단편을 증폭하기 위하여 RYR1-F 5'-GTGCTGGATG TCCTGTGTTCCCT-3' 및 RYR1-R 5'-CTGGTGACATAGTTG ATGAGGTTTG-3을 설계 합성하였다(Fig. 1).
대상 데이터
- 강원도 및 경기도 일대에 위치하고 있는 종돈장에서 종돈 120두(Large Yokshire 57두, Landrace 42, Duroc 21)와 일반 양돈장에서 사육 관리되고 있는 식육용 교잡종 돼지 150두로부터 각각 채취한 모근을 공시재료로 이용하였다.
이론/모형
- 4. DNA banding patterns of RYR1 genotypes in 12% polyacrylamide gel using PCR-SSCP technique. La nes 1, 3, 6 and 7, homozygous normal genotype (N/N); lanes 2 and 4, homozygous recessive genotype (n/n); lanes 5 and 8~10, heterozygous genotype (N/n).
- 3. DNA banding patterns of RYR1 genotypes in 15% polyacrylamide gel following digestion with Hha I enzyme using PCR-RFLP technique. Lanes 2~4, 6, 8, 11, 13 and 14, homozygous normal genotype (N/N); lane 5, homozygous recessive genotype (n/n); lanes 1, 7, 9, 10 and 12, heterozygous genotype (N/n).
- 2. DNA banding patterns of RYR1 genotypes in 2% agarose gel following digestion with Hha I enzyme using PCR-RFLP technique. Lanes 1, 3~4, 9, 11, 13 and 14, homozygous normal genotype (N/N); lanes 2 and 6, homozygous recessive genotype (n/n); lanes 5, 7~8, 10 and 12, heterozygous genotype(N/n).
성능/효과
- 같다. Landrace는 조사한 42두 가운데 정상의 동형접 합체 유전자형을 갖는 PSS 저항성 개체가 57.1%, 이형접합체의 잠재성 개체가 35.7% 그리고 열성의 동형접 합체 유전자형을 갖는 PSS 감수성 개체의 출현비율은 7.1%로 각각 분석되었다. 그리고 L.
- 1%로 각각 분석되었다. 그리고 L. Yorkshire는 57두 가운데 PSS 저항성 개체가 82.5%, 이형접합체의 잠재성 개체가 15.8% 그리고 PSS 감수성 개체의 출현비율은 1.7%로 나타났으며, Duroc은 21두 가운데 PSS 저항성 개체가 95.2%, 이형접합체의 잠재성 개체가 4.8% 그리고 PSS 감수성 개체의 출현비율은 0%로 나타났다. 국내 비육용 교잡돈(crossbreed)의 경우에는 총 150두 가운데 정상 개체가 72.
- 그러나, 돌연변이 유전자를 동형(homo) 접합체 상태로 보유하고 있는 열성의 PSS 감수성 개체(n/n)는 C→T의 단일 염기치환으로 제한효소의 인지 부위가 소실되어 절단되지 않는 659 bp의 단일 band만이 검출되었다. 그리고 돌연변이 유전자를 이형(hetero)접합체상태로 보유하고 있는 잠재성 개체 (carrier; N/n)는 정상 유전자와 돌연변이 유전자를 절반씩 보유함으로 659, 493 및 166 bp 3개 band가 모두 발현되었다. 또한, 659 bp 보다 증폭산물의 크기가 훨씬 작은 81 bp의 증폭산물을 동일한 Hha I 제한효소로 처리하고 15% polyacrylamide gel을 이용하여 검출한 DNA 유전자형은 Fig.
- 따라서, 본 연구는 PCR-RFLP 및 PCR-SSCP 기법을 이용하여 PSE 돈육을 생산하는 PSS 돼지 유전자 진단기술을 개발하고 이를 이용한 국내 종돈 및 교잡 비육돈의 PSS 유전자형 출현빈도를 파악하고자 수행하였다. 돼지 PSS의 원인이 되는 RYR 유전자의 단일염기 돌연변이 (RYR1 CI843T)를 포함하는 DNA 영역을 PCR로 증폭한 후 RFLP 및 SSCP 기법을 이용하여 분석한 결과 동형접합체의 정상 개체(N/N), 이형접합체의 잠재성 개체 (N/n) 그리고 열성의 돌연변이 유전자를 동형접합체 상태로 갖는 PSS 감수성 개체 (n/n)에 각각 특이적인 RFLP 및 SSCP 유전자형이 검출되어 PSS 저항성, 잠재성 및 감수성 개체의 정확한 판별이 가능하였다. 돼지 주요 품종 집단내 PSS 유전자형 출현빈도를 조사한 결과 Landrace는 PSS 저항성 개체가 57.
- 돼지 PSS의 원인이 되는 RYR 유전자의 단일염기 돌연변이 (RYR1 CI843T)를 포함하는 DNA 영역을 PCR로 증폭한 후 RFLP 및 SSCP 기법을 이용하여 분석한 결과 동형접합체의 정상 개체(N/N), 이형접합체의 잠재성 개체 (N/n) 그리고 열성의 돌연변이 유전자를 동형접합체 상태로 갖는 PSS 감수성 개체 (n/n)에 각각 특이적인 RFLP 및 SSCP 유전자형이 검출되어 PSS 저항성, 잠재성 및 감수성 개체의 정확한 판별이 가능하였다. 돼지 주요 품종 집단내 PSS 유전자형 출현빈도를 조사한 결과 Landrace는 PSS 저항성 개체가 57.1%, 잠재성 개체가 35.7% 그리고 PSS 감수성 개체의 출현비율은 7.1%로 분석되었고 L. Yorkshire는 82.5, 15.8 및 1.7%, Duroc은 95.2, 4.8 및 0.0%로 각각 조사되었다. 비 육용 교잡돈은 정상 개체가 72.
- PCR-SSCP 분석기법은 기존의 PCR-RFLP 방법과 비교하여 특정 제한효소 사용 없이 보다 신속 정확하고도 간편하게 유전자 돌연변이를 검출할 수 있어 PSS 유전자 및 PSE육 생산 돼지의 조기진단에 효율적이고 경제적인 방법이라고 할 수 있다. 따라서, PCR-SSCP 기법을 활용할 경우, 종래의 PCR-RFLP 방법으로 진단이 불확실한 시료에 대한 정확한 판정이 가능하여 검사결과의 정확도를 크게 향상시킬 수 있으며 특히, 대규모 집단이나 시료의 검색에 매우 효과적으로 이용할 수 있을 것으로 판단된다.
- 한편, PCR-SSCP 기법은 DNA의 물리적 성질을 이용한 새로운 DNA 염기변이 검출방법으로서 점 돌연변이(point mutation)의 단일 염기치환에 의한 염기서열 변화로 발생한 DNA 단일 가닥(single strand)의 형태 또는 구조변경에 따른 전기영동상의 이동능력 차이로 기인된 유전자 다형성(polymorphism)을 검출하는 방법이다 (Orita et al, 1989). 본 실험에서 PCR-SSCP 기술을 이용하여 돼지 RYR1 유전자내의 돌연변이에 의한 염기 치환으로 DNA 단일가닥의 형태 또는 구조변경에 따른 전기 영동상의 mobi lity shift를 비교 분석한 결과 Fig. 4에서 보는 바와 같이 PSS 저항성 개체와 감수성 개체 간 SSCP band의 이동거리에 차이가 인정되었다. 즉, PSS 항성 개체(N/N)는 이동도가 빠른 2개의 SSCP band를 나타냈으나 돌연변이 유전자를 갖는 PSS 감수성 개체(n/n)는 상대적으로 이동도가 느린 2개의 SSCP band를 가지고 있으며 이형접합체의 잠재성 개체(N/n)는 이들 4개의 band를 모두 갖는 것으로 나타났다.
- 0%로 각각 조사되었다. 비 육용 교잡돈은 정상 개체가 72.0%, 잠재성 개체가 22.7% 그리고 PSS 감수성 개체는 5.3%였다. 특히, PCR-SSCP 기법을 이용한 RYR1 유전자 돌연변이 검출 방법은 보다 신속 간편하면서도 상대적으로 분석비용이 저렴한 정확성이 높은 PSS 돼지 진단기술로서 대규모 돼지집단 검색이나 RFLP 방법으로 판정이 불확실한 시료의 재검에 효율적으로 이용할 수 있을 것으로 판단된다.
- 4에서 보는 바와 같이 PSS 저항성 개체와 감수성 개체 간 SSCP band의 이동거리에 차이가 인정되었다. 즉, PSS 항성 개체(N/N)는 이동도가 빠른 2개의 SSCP band를 나타냈으나 돌연변이 유전자를 갖는 PSS 감수성 개체(n/n)는 상대적으로 이동도가 느린 2개의 SSCP band를 가지고 있으며 이형접합체의 잠재성 개체(N/n)는 이들 4개의 band를 모두 갖는 것으로 나타났다. PCR-SSCP 분석기법은 기존의 PCR-RFLP 방법과 비교하여 특정 제한효소 사용 없이 보다 신속 정확하고도 간편하게 유전자 돌연변이를 검출할 수 있어 PSS 유전자 및 PSE육 생산 돼지의 조기진단에 효율적이고 경제적인 방법이라고 할 수 있다.
- 2와 같다. 즉, 돌연변이 유전자가 존재하지 않는 정상의 동형접 합체인 PSS 저 항성 개체(N/N)는 493 과 166 bp 2개의 band가 검출되었다. 그러나, 돌연변이 유전자를 동형(homo) 접합체 상태로 보유하고 있는 열성의 PSS 감수성 개체(n/n)는 C→T의 단일 염기치환으로 제한효소의 인지 부위가 소실되어 절단되지 않는 659 bp의 단일 band만이 검출되었다.
- 3과 같다. 즉, 스트레스 저항성의 정상개체의 RYR1 유전자에는 Hha I 인지부위가 존재하여 81 bp 증폭산물이 절단됨으로써 49와 32 bp 2개의 band로 검출되었으나 스트레스 감수성의 PSS 개체는 돌연변이 발생으로 제한효소 절단부위가 소실되어 81 bp의 단일 band만이 확인되었다. 그리고 이형접합체의 잠재성 개체는 이들 81, 49 및 32 bp 3개의 band가 모두 검출되었다.
후속연구
- 특히, 국내에서 생산되는 수출용 돼지에서 PSE 돈육 발생율이 40%나 되어 미국 10%, 덴마크 3%, 영국 12% 및 일본 12%에 비해 상대적으로 높아 돈육수출에 커다란 장애요인으로 지적되고 있다(축산연구2002; 한국종축개량협회, 2002). 따라서 스트레스에 의한 돼지 폐사율을 크게 줄이고 고품질 돈육 생산을 통한 양돈 산업의 경쟁력을 제고하기 위해서는 물퇘지 생산과 밀접한 관련이 있는 PSS 불량 유전자 색출을 위한 신속 간편하고 정확성이 높은 진단 기술 개발과 이를 이용한 PSE 돈육 발생율 감소 방안이 확립되어야 한다.
- 국내산 돼지고기의 PSE 돈육 발생율은, '99년도 17%에 비하여, '01년에 45~70%로 해마다 증가하는 추세이다. 따라서, 각종 스트레스에 의한 돼지 폐사율 및 PSE 불량 돈육의 발생율을 크게 줄이고 고품질 돈육생산을 통한 양돈생산 농가의 경쟁력 제고를 위하여 스트레스 감수성 돼지에 대한 정확한 검색 기술 개발과 이를 이용한 PSE 돈육발생 방지는 우리나라 양돈 산업에 있어 매우 중요하고 반드시 해결해야 할 주요 과제라고 지적할 수 있다.
- 앞으로 이같은 DNA 진단기술을 이용하여 국내 종돈장 및 일반 양돈장에서 보다 정확하고 신속하게 PSS 유전인자의 보유돼지를 검출함으로써 생산성 향상 및 PSE 돈육의 발생을 효과적으로 예방할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, PSE 돈육 발생을 최소화함으로써 돈육 수출에 따른 불량 저급육 반송 비율을 크게 줄여 돼지고기 수출 확대에도 기여할 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 PCR- RFLP 및 SSCP 기법을 이용한 DNA 진단 기술은 돼지의 PSS 열성 불량유전자를 연령이나 성별에 관계없이 조기에 신속 정확하게 색출하고 제거할 수 있어 PSE의 불량 이상 돈육의 발생율을 근본적으로 감소시킴으로써 고품질 돈육 생산에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다. 특히, PCR-SSCP 기법은 PCR-RFLP 방법과 달리 제한효소 처리과정 없이 PCR 증폭 후 바로 전기 영동으로 PSS 유전자형을 판정할 수 있어 다수의 개체를 대상으로 한 PSE육 생산 돼지 진단에 효율적으로 이용할 수 있을 것이다.
- , 1994). 앞으로 국내 비육돈 집단에 있어 PSS 발생율을 줄이기 위해서는 특히, 종돈에 대한 PSS 유전자 검색을 실시하여 PSS 유전자의 확산을 방지하고 품종집단으로부터 이 열성의 불량 유전인자를 제거하기 위한 진단 프로그램의 개발과 도입이 이루어져야 한다. 또한 외국으로부터 도입되는 수입종돈에 대해서도 PSS 유전자 진단을 실시하여 불량형질의 국내 확산을 사전에 예방할 필요가 있다.
- 특히, PCR-SSCP 기법은 PCR-RFLP 방법과 달리 제한효소 처리과정 없이 PCR 증폭 후 바로 전기 영동으로 PSS 유전자형을 판정할 수 있어 다수의 개체를 대상으로 한 PSE육 생산 돼지 진단에 효율적으로 이용할 수 있을 것이다. 앞으로 이같은 DNA 진단기술을 이용하여 국내 종돈장 및 일반 양돈장에서 보다 정확하고 신속하게 PSS 유전인자의 보유돼지를 검출함으로써 생산성 향상 및 PSE 돈육의 발생을 효과적으로 예방할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, PSE 돈육 발생을 최소화함으로써 돈육 수출에 따른 불량 저급육 반송 비율을 크게 줄여 돼지고기 수출 확대에도 기여할 것으로 사료된다.
- 특히, PCR-SSCP 기법은 PCR-RFLP 방법과 달리 제한효소 처리과정 없이 PCR 증폭 후 바로 전기 영동으로 PSS 유전자형을 판정할 수 있어 다수의 개체를 대상으로 한 PSE육 생산 돼지 진단에 효율적으로 이용할 수 있을 것이다. 앞으로 이같은 DNA 진단기술을 이용하여 국내 종돈장 및 일반 양돈장에서 보다 정확하고 신속하게 PSS 유전인자의 보유돼지를 검출함으로써 생산성 향상 및 PSE 돈육의 발생을 효과적으로 예방할 수 있을 것으로 기대된다.
- 3%였다. 특히, PCR-SSCP 기법을 이용한 RYR1 유전자 돌연변이 검출 방법은 보다 신속 간편하면서도 상대적으로 분석비용이 저렴한 정확성이 높은 PSS 돼지 진단기술로서 대규모 돼지집단 검색이나 RFLP 방법으로 판정이 불확실한 시료의 재검에 효율적으로 이용할 수 있을 것으로 판단된다.
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