뽕잎과 누에가루 혼합환의 Streptozotocin유발 당뇨쥐에서의 혈당강하 효과 Hypoglycemic Effects of Pills Made of Mulberry Leaves and Silkworm Powder in Streptozotocin-Induced Diabetic Rats원문보기
본 연구에서 는 뽕잎과 누에가루의 함량 비를 달리 하여 제조한 환의 혈당강하 효과를 in vitro및 동물실험을 통해 검정 하고자 하였다. 실험 동물은 체중 100 g내외 의 Sprague-Dawley종 수컷 흰쥐를 이용하였으며, 제조환은 식이 내에 0.4%(4 ghg)씩 공급하였다. 실험군은 제조환의 종류에 따라 제조환을 공급하지 않은 당뇨 대조군(DM group), 뽕잎 100%로 제조한 군(M group), 뽕잎에 누에가루를 각각 25%(25SM group), 50%(50SM group), 75%(75SM group) 및 100%(100S group)씩 혼합하여 제조한 군으로 나누었다. 식이와 식수는 자유섭식시켰으며,3주 간 사육한 후 STZ로 당뇨를 유발시켰으며, 9일 만에 희생시켰다 제조된 혼합 환의 DNJ의 함량은 누에가루의 혼합 비율이 높을수록 증가되었다. GABA및 rutin의 함량은 뽕잎의 혼합 비율이 증가함에 따라 함유량이 증가되었다. in uitro에서 소장 점막의 $\alpha$-glucosidase의 활성 저해 효과도 뽕잎 에 누에가루를 50% 이상 혼합시켰을 때 혼합하지 않은 환과 2SSM 환보다 유의적으로 증가되었다. 혈당강하 효과는 DM군과 M군에 비해 누에가루를 혼합한 군에서 더 높았으며 특히 50%, 75% 및 100% 혼합한 군들에서는 유의적 인 혈당강하 효과를 나타내었다. 소장 점막 maltase 활성은 proximal 부분에서 DM군에 비하여 제조환 공급군 모두가 유의적으로 감소되었으며, 제조환 공급군 간에는 유의적인 차이는 없었다. Middle부분에서는 실험군 간에 유의적인 차이가 없었다. Distal 부분에서는 DM군에 비하여 제조환 공급군에서 감소되었으며, 특히 50SM군,75SM군 및 100S군에서 현저하게 감소하였다. Sucrase와 lactase의 경우에는 prorimal부분에서 DM군에 비하여 제조환 공급군에서 유의적으로 감소되었으며, middle 및 distal부분에서는 실험군 간에 유의적인 차이가 없었다. 결론적으로 뽕잎과 누에가루를 혼합하여 제조한 환은 in vitro실험 에서 $\alpha$-glucosidase 활성 저해효과를 증가시켰으며, STZ 유발 당뇨 쥐의 소장 proximal 부분의 이 당류분해 효소 활성을 억제함으로써 급속한 혈당상승을 억제하는 효과가 있었다. 이러한 효과는 뽕잎과 누에가루를 50 : 50의 동량으로 혼합시켰을 때 가장 좋은 것으로 관찰되었다.
본 연구에서 는 뽕잎과 누에가루의 함량 비를 달리 하여 제조한 환의 혈당강하 효과를 in vitro및 동물실험을 통해 검정 하고자 하였다. 실험 동물은 체중 100 g내외 의 Sprague-Dawley종 수컷 흰쥐를 이용하였으며, 제조환은 식이 내에 0.4%(4 ghg)씩 공급하였다. 실험군은 제조환의 종류에 따라 제조환을 공급하지 않은 당뇨 대조군(DM group), 뽕잎 100%로 제조한 군(M group), 뽕잎에 누에가루를 각각 25%(25SM group), 50%(50SM group), 75%(75SM group) 및 100%(100S group)씩 혼합하여 제조한 군으로 나누었다. 식이와 식수는 자유섭식시켰으며,3주 간 사육한 후 STZ로 당뇨를 유발시켰으며, 9일 만에 희생시켰다 제조된 혼합 환의 DNJ의 함량은 누에가루의 혼합 비율이 높을수록 증가되었다. GABA및 rutin의 함량은 뽕잎의 혼합 비율이 증가함에 따라 함유량이 증가되었다. in uitro에서 소장 점막의 $\alpha$-glucosidase의 활성 저해 효과도 뽕잎 에 누에가루를 50% 이상 혼합시켰을 때 혼합하지 않은 환과 2SSM 환보다 유의적으로 증가되었다. 혈당강하 효과는 DM군과 M군에 비해 누에가루를 혼합한 군에서 더 높았으며 특히 50%, 75% 및 100% 혼합한 군들에서는 유의적 인 혈당강하 효과를 나타내었다. 소장 점막 maltase 활성은 proximal 부분에서 DM군에 비하여 제조환 공급군 모두가 유의적으로 감소되었으며, 제조환 공급군 간에는 유의적인 차이는 없었다. Middle부분에서는 실험군 간에 유의적인 차이가 없었다. Distal 부분에서는 DM군에 비하여 제조환 공급군에서 감소되었으며, 특히 50SM군,75SM군 및 100S군에서 현저하게 감소하였다. Sucrase와 lactase의 경우에는 prorimal부분에서 DM군에 비하여 제조환 공급군에서 유의적으로 감소되었으며, middle 및 distal부분에서는 실험군 간에 유의적인 차이가 없었다. 결론적으로 뽕잎과 누에가루를 혼합하여 제조한 환은 in vitro실험 에서 $\alpha$-glucosidase 활성 저해효과를 증가시켰으며, STZ 유발 당뇨 쥐의 소장 proximal 부분의 이 당류 분해 효소 활성을 억제함으로써 급속한 혈당상승을 억제하는 효과가 있었다. 이러한 효과는 뽕잎과 누에가루를 50 : 50의 동량으로 혼합시켰을 때 가장 좋은 것으로 관찰되었다.
This study was carried out to examine the effects of pills made of mulberry leaves and silkworm powder on lowering blood glucose level. Experimental animals were Sprague-Dawley male rat weighing 100$\pm$10 g and pills were supplemented with 0.4% (4 g/kg) diet. Experimental groups were ass...
This study was carried out to examine the effects of pills made of mulberry leaves and silkworm powder on lowering blood glucose level. Experimental animals were Sprague-Dawley male rat weighing 100$\pm$10 g and pills were supplemented with 0.4% (4 g/kg) diet. Experimental groups were assigned to diabetic group (DM group) and pill supplemented groups. Pill supplemented groups were classified 100% mulberry leaves (M group), mixing 25% silkworm powder to mulberry leaves (25SM group), mixing 50% silkworm powder to mulberry leaves (50SM group), mixing 70% silkworm powder to mulberry leaves (75SM group) and 100% silkworm powder (100S group). Experimental diets and water fed ad libitum, and streptozotocin was injected to induce diabetic state after 3rd weeks and sacrificed on the 9th day. The contents of 1-deoxynojirimycin(DNJ) were increased with adding the silkworm powder. The contents of GABA and rutin were increased with adding the mulberry leaves. In vitro, intestinal mucosa $\alpha$-glucosidase inhibitory activities were significantly increased in pills which mixed with silkworm powder by 50%. Blood glucose levels were high in groups which mixed with silkworm powder by 50% compared to DM group. Intestinal mucosa maltase activity in proximal part was significantly reduced in pill supplemented group compared to DM group and pill supplemented groups were no significant difference. Enzyme activity in middle part was no significant difference in experimental groups. Enzyme activity in distal part was decreased in pill supplemented groups, especially in 50SM, 75SM and 100S groups were significantly reduced compared to DM group. Sucrase and lactase activities in pill supplemented groups were significantly reduced at proximal part, and there was no significant difference in middle and distal parts. In conclusion, pills made of mulberry leaves and silkworm powder increased the $\alpha$-glucosidase inhibitory activity in vitro and reduced the blood glucose levels by controlling the disaccharidase activities of intestinal proximal part in STZ-induced diabetic rat. The synergistic effect was the highest when mulberry leaves was mixed with silkworm powder by the ratio of 50 : 50.
This study was carried out to examine the effects of pills made of mulberry leaves and silkworm powder on lowering blood glucose level. Experimental animals were Sprague-Dawley male rat weighing 100$\pm$10 g and pills were supplemented with 0.4% (4 g/kg) diet. Experimental groups were assigned to diabetic group (DM group) and pill supplemented groups. Pill supplemented groups were classified 100% mulberry leaves (M group), mixing 25% silkworm powder to mulberry leaves (25SM group), mixing 50% silkworm powder to mulberry leaves (50SM group), mixing 70% silkworm powder to mulberry leaves (75SM group) and 100% silkworm powder (100S group). Experimental diets and water fed ad libitum, and streptozotocin was injected to induce diabetic state after 3rd weeks and sacrificed on the 9th day. The contents of 1-deoxynojirimycin(DNJ) were increased with adding the silkworm powder. The contents of GABA and rutin were increased with adding the mulberry leaves. In vitro, intestinal mucosa $\alpha$-glucosidase inhibitory activities were significantly increased in pills which mixed with silkworm powder by 50%. Blood glucose levels were high in groups which mixed with silkworm powder by 50% compared to DM group. Intestinal mucosa maltase activity in proximal part was significantly reduced in pill supplemented group compared to DM group and pill supplemented groups were no significant difference. Enzyme activity in middle part was no significant difference in experimental groups. Enzyme activity in distal part was decreased in pill supplemented groups, especially in 50SM, 75SM and 100S groups were significantly reduced compared to DM group. Sucrase and lactase activities in pill supplemented groups were significantly reduced at proximal part, and there was no significant difference in middle and distal parts. In conclusion, pills made of mulberry leaves and silkworm powder increased the $\alpha$-glucosidase inhibitory activity in vitro and reduced the blood glucose levels by controlling the disaccharidase activities of intestinal proximal part in STZ-induced diabetic rat. The synergistic effect was the highest when mulberry leaves was mixed with silkworm powder by the ratio of 50 : 50.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 뽕잎과 누에가루의 혼합 비율을 달리하여 환의 형태로 만들고 제조된 환의 혈당저하 효과 및 이당류 분해효소의 활성에 미치는 영향을 조사하여 기능성 식품으로써의 활용방안을 모색하는데 기 초 자료를 제공하고자 한다.
제안 방법
방법으로 하였다. 먼저 절제한 소장의 십이지장 부분을 제거한 후 같은 길이로 세 등분하여 proximal, middle 및 distal로 구분하고 냉장시 킨 생리 식 염수로 깨끗하게 씻어 cheese cloth로 수분을 제거하였다. 냉각 판에서 microscopic glass를 이용하여 점 막을 긁어서 무게를 달고 4배의 증류수를 넣어 homogenizer로 균질화시켜 측정 시료로 사용하였다.
의해 다음의 여섯 군으로 나누었다. 식이 kg 내에 0.4%(4 g)씩 혼합되는 제조환의 종류에 따라 제조환을 공급하지 않은 당뇨대조군(DM group), 뽕잎 100%로 제조한 환공급군(M group), 뽕잎에 누에가루를 각각 25%, 50% 및 75% 혼합하여 제조한 환 공급군(25SM group, 50SM group and 75SM group) 및 누에가루 100%로 제조한 환 공급군(100 S group)으로 나누었다. 실험쥐는 각 그룹 당 10마리로 하였으며, 총 4주 간 사육하였다.
실험동물, 식이조성 및 사육 : 실험동물은 환경에 적응시키기 위해 일반 고형사료(바이오 제노믹스, 한국)로 일주일간 예비 사육한 후, 난괴 법 (randomized complete block design)에 의해 다음의 여섯 군으로 나누었다. 식이 kg 내에 0.
실험종료 후 가벼운 ether마취 하에서 복부대동맥으로부터 혈액을 채취한 후 즉시 소장을 채취하였다. 혈액은 실온에서 30분간 방치한 다음 3, 000 rpm에서 15분 간 원심분리하여 혈청을 분리하였다.
여기서 얻은 상등액과 동량의 Uriprep (contain lithium ion)을 혼합하여 실온에서 5분간 방치한 후 침전되는 단백질을 원심분리 (13, 000 rpm, 4℃, 5 min)하여 제거 하였다. 원심 분리 하여 얻은 상등액을 syringe filter (0.45 UM)로 여과하여 아미노한 자동분석기 (Pharmacia Biotech Co., Biochrom 20, Sweden)를 사용하여 GABA 함량을 측정하였다. 기기분석 조건으로는 칼럼은 Li-form을, retention timee 110 min, loading volumee 40 11L, 유속은 0.
완전한 환 모양으로 만들었다. 이때 뽕잎 100%를 이용하여 만든 환을 M 환, 뽕잎에 누에가루를 25%, 50% 및 75%의 비 율로 혼합하여 만든 환을 각각 25SM 환, 50SM 환 및 75SM 환, 누에가루 100%를 이용하여 만든 환을 100S 환이라 하였으며, 60℃에서 4시간 동안 건조기에서 열풍 건조 하여 수분 함량이 5~8%가 되도록 한 다음 병에 넣어서 밀봉하여 시료로 사용하였다.
혈당측정은 enzymatic kit AM 102K(아산제약, 한국)를 사용하여 enzymatic method에 의해 500 nm에서 비색 정량하였다.
0)로 희석하여 사용하였다. 효소활성 억제정도는 반응시간 동안의 흡광도의 변화를 대조군 흡광도 변화와의 비로부터 계산하였다.
대상 데이터
파쇄하여 이용하였다. 누에가루는 영천 양잠농업 협동조합에서 사육한 누에 중 5주령 3일된 것을 급속 동결 건조 , 파쇄하여 사용하였다.
)를 사용하여 분석하였다. 사용한 칼럼 은 Cis column(3.9 x 300 mm), 유속은 0.8 mL/min, detectione- 350 nm 그리고 이동상으로는 2.5% AcOH:MeOH: CH3CN(70:10:20, v/v/v)을 사용하였다.
HPLC (Spectra System HPLC ThermoQuest, USA)의 분석 조건은 다음과 같다. 사용한 칼럼 은 phenomenex Luna Cis column (4.6 x 250 mm), 측정 온도는 30℃, 유속은 1 mL/min, 형 광검출기 는 여 기 파장 254 nm 및 방사파장 322 run를 사용하였다. 그리 고 이 동상으로는 0.
소장 점 막으로부터 a-glucosidase 효소원의 분리 : 실험동물은 체중 200 g 내외의 Sprague-Dawley 종 수컷을 사용하였으며, Rhinehart 등(32)의 방법으로 12시간 절식 시 킨 후 가벼운 ether 마취 하에서 복부를 절개하여 소장을 적출하고 유리 판 위 에서 점 막을 긁어모았다. 점 막에 5배량(w/v) 의 0.
실험에 사용한 뽕잎은 'YK-209 뽕잎으로 2002년 5월 경북 영천에서 채취하여 수세한 후 60℃에서 열풍 건조 . 파쇄하여 이용하였다.
4%(4 g)씩 혼합되는 제조환의 종류에 따라 제조환을 공급하지 않은 당뇨대조군(DM group), 뽕잎 100%로 제조한 환공급군(M group), 뽕잎에 누에가루를 각각 25%, 50% 및 75% 혼합하여 제조한 환 공급군(25SM group, 50SM group and 75SM group) 및 누에가루 100%로 제조한 환 공급군(100 S group)으로 나누었다. 실험쥐는 각 그룹 당 10마리로 하였으며, 총 4주 간 사육하였다. 기본 실험 식이는 Table 1과 같다.
인슐린 의존성 당뇨병 과 유사한 실험 모델을 만들기 위 해서 streptozotocin(STZ)을 50 ㎎/㎏ body weight를 꼬리 정맥을 통하여 주사하여 당뇨를 유발시 킨 후 9일 만에 희 생 시켜 혈당량이 300 mg/dL이상인 동물만 실험에 사용하였다.
데이터처리
모든 실험결과에 대한 통계처리는 각 실험군별로 표준차이가 있는가를 검증하기 위해 분산분석을 수행하였으며 분산분석(ANOVA 검증)결과 유의성이 발견된 경우 Tukeys HSD test에 의해 군 간의 유의도를 분석하였다.
이론/모형
DNJ 함량 측정 은 Stead and Richards(29)의 방법으로 분석하였다. 즉, 제조한 환 0.
GABA는 Bang 등(30)의 방법으로 분석하였다. 제조한 환 1 g에 4% sulfosalicylic acid 용액 20 mL를 첨가하여 30。(3에서 1시간 동안 초음파 추출하였다.
Rutine Yun과 Lee(31)의 방법으로 분석하였다. 제조한 환을 100 mesh 이 하로 마쇄한 후 1 g에 80% 수용성 메탄올 100 mL를 가하여 상온에서 magnetic stirrer로 12시간 동안 2회 반복 추출하여 여 과지 (Whatman No.
a -Glucosidase 활성 억 제 정 도는 Kim(33)의 방법 으로 1.4 mU/mL a-glucosidase와 실험 sample을 pH 5.0, 37℃ 에서 10분간preincubation한 후, 기질인 6mMp-nitrophenyl-a-D-glucopyranoside를 가하여 37℃에서 30분 간 반응 시켜 100℃에서 3분 간 끓인 후 0.4 M glycine buffer(pH 10.4) 를 가하여 원심분리하여 상층액을 400 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 시 료는 dimethyl sulfoxide (DMS0)에 녹여 사용하였으며 , 이때 DMSO의 농도는 a-glucosidase의 저 해 활성에 영향을 주지 않는 농도인 10 uL/mL로 하였다.
각 시료의 단백질량은 Lowry 등(35)의 방법으로 하였으며, bovine serum albumin을 표준품으로 사용하였다.
소장점 막 중의 maltase, sucrase 및 lactase, 활성 은 Dahlqvist(34)의 방법으로 하였다. 먼저 절제한 소장의 십이지장 부분을 제거한 후 같은 길이로 세 등분하여 proximal, middle 및 distal로 구분하고 냉장시 킨 생리 식 염수로 깨끗하게 씻어 cheese cloth로 수분을 제거하였다.
성능/효과
1과 같다. M 환, 25SM 환, 50SM 환, 75SM 환 및 100S 환에서 각각 34.0%, 33.4%, 37.2%, 37.5% 및 36.1%로 뽕잎 에 누에 가루를 혼합함으로써 a -glucosidase 활성의 저 해 효과가 증가되 었으며 , 특히 누에가루를 50% 이상 혼합한 환부터 그 정도가 유의적으로 증가하였다. 이 러한 결과는 누에가루가 a -glucosidase활성 저 해 효과가 높은 DNJ 함량이 높기 때문에(Table 2) 당 분해효소의 작용을 억제하여 당의 흡수를 지 연시 킴 으로써 식 후 급격한 혈당상승을 방지 하는 효과가 있다는 보고(21-23)와 일치한다.
각 부분 간 효소활성이 높은 순서대로 비교해 본 결과 maltase의 경우 DM군은 distal > proximal > middle 순이 었으며 , 제조환 공급군에서 는 distal > middle > proximal 순으로 높았다. Sucrase의 경우에는 DM군은 proximal > distal > middle 순이었고, 제조환 공급군에서는 distal > middle> proximal 순으로 높았다.
이와 같이 잠상산물 가운데 뽕잎과 누에를 혼합하여 제조한 환이 뽕잎만으로 제조한 환에 비하여 in vitro 실험에서뿐만 아니라 및 STZ 유발 당뇨 쥐 에서 혈 당강하 상승효과를 관찰할 수 있었으며 특히 뽕잎 50%와 누에가루 50%를 혼합한 50SM 환이 가장 높은 혈당강하 작용이 있음을 관찰할 수 있었다. 또 이러한 혈당강하 효과는 소장 점막의 proximal 부분의 이당류 분해효소 활성을 조절함으로써 급격한 혈당 상승을 억제시키는 것을 알 수 있었다.
소장을 동일하게 proximal, middle 및 distaL의 세 부분으로 나누어 소장 점 막의 maltase, sucrase 및 lactase 등의 disaccharidasee] 활성을 측정한 결과 maltase의 경우 proximal 부분에서 제조환 비공급군인 DM군에 비하여 제 조환 공급 군인 M구 25SM군, 50SM구 75SM군 및 100S 군에서 각각 8.7%, 12.7%, 13.7%, 16.3% 및 21.5%씩 감소되었다. Middle 부분은 실험군 간에 유의적인 차이가 없었다.
그리고 proximal 부분에서 억제된 이당류 분해효소의 활성은 middle 및 distal 부분에서 는 활성이 점차 증가되 었는데 이는 proximal 부분에서 미 처 다 분해되지 못한 다당류가 소장의 뒷부분으로 가면서 천천히 분해된 것으로 본다. 이와 같이 잠상산물 가운데 뽕잎과 누에를 혼합하여 제조한 환이 뽕잎만으로 제조한 환에 비하여 in vitro 실험에서뿐만 아니라 및 STZ 유발 당뇨 쥐 에서 혈 당강하 상승효과를 관찰할 수 있었으며 특히 뽕잎 50%와 누에가루 50%를 혼합한 50SM 환이 가장 높은 혈당강하 작용이 있음을 관찰할 수 있었다. 또 이러한 혈당강하 효과는 소장 점막의 proximal 부분의 이당류 분해효소 활성을 조절함으로써 급격한 혈당 상승을 억제시키는 것을 알 수 있었다.
2와 같다. 제조환 비공급 군인 DM군(582.29± 56.74 mg/dL)에 비하여 제 조환 공급 군인 M군(452.41 ±34.10 mg/dL), 25SM군 (432.92 ±47.26 mg/dL), 50SM군382.37 ±30.16 mg/dL), 75 SM군(357.42 ±32.13 mg/dL) 및 100S군(370.33 ±36.55 mg/ dL)에서 각각 DM군에 비하여 22%, 26%, 34%, 39% 및 36% 씩 유의적으로 혈당량이 감소되었으며, 특히 누에가루를50% 이상 혼합한 군들에서 혈당강하 정도가 더욱 현저하였다. 이러한 결과는 Lee(37)의 연구에서 STZ투여 고혈당 마우스에서 상엽추출물이 공복 시에 당뇨 대조군에 비하여 수층 투여군과 에탄올층 투여군에서 혈당강하 효과가 있었다는 결과와 비슷한 경향을 보였다, 이러한 혈당강하 작용은 뽕잎이나 누에가루의 DNJ 성분이 인슐린의 농도에는 영향을 주지 않으면서 a -glucosidase, a -mannosidase 및 p-galacto-sidase의 작용을 억제하는 효과가 있다는 Chung 등(20)의 보고에 기인하는 것으로 본다.
혈당강하 성분인 DNJ의 경우 M 환, 25SM 환, 50SM 환, 75SM 환 및 100S 환에서 100 g 당 각각 68±7.67 mg, 95±13.64 mg, 118+10.19 mg, 143±9.25mg 및 168±12.15 mg으로 누에가루를 혼합함으로써 함량이 증가되었다. 이 는 뽕잎보다 누에가루에 DNJ가 더 많이 함유되어 있기 때문으로 본다(11T3).
후속연구
결론적으로 당뇨병에서 잠상산물을 이용하여 혈당 강하 상승효과를 얻기 위해서는 뽕잎과 누에가루를 동량 혼합하였을 때 가장 높은 효과를 기대할 수 있으므로 이를 항당뇨 기능성 제품 제조에 응용하는 것이 가장 바람직 할 것으로 본다.
이와 같이 누에 가루는 DNJ 성 분 등으로 인한 혈 당강하 효과가 매우 우수하며, 뽕잎은 GABA 및 flavonoid 등의 성분이 골고루 포함되어 있어 중성지방이나 콜레스테롤 저하작용 및 항산화 작용 등을 비롯한 다양한 기능을 지니고 있다. 그러므로 이들을 적절한 비율로 혼합하여 각각 그 기능성의 우수한 점을 이용한다면 시너지 효과를 거둘 수 있을 것이다. 그러나 지금까지 뽕잎과 누에가루의 혼합비 율을 달리 하여 그 효능을 검정한 연구는 거의 없는 실정이다.
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