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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 동, 서양에서 널리 사용되고 있는 후추, 겨자, 고추냉이, 계피, 정향을 대상으로각 향신료의 항산화 효과가 어느 정도인지 측정해보고, 각 향신료들 간의 항산화 효과를 비교해보고자 하였다. 향신료 에탄올 추출물의 MDA(malondialdehyde)에 대한 단백질의 보호효과와 지 질과산화(lipid peroxidation) 저해효과, DPPH( 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 라디칼 소거효과를 측정하여 단백질의 산화 및 유지류의 자동산화 반응에 대한 항산화효과를 비교함으로서, 항산화 기능을 갖는 식품개발을 위한 기초 자료로 사용하고자 하였다.
- 비교해보고자 하였다. 향신료 에탄올 추출물의 MDA(malondialdehyde)에 대한 단백질의 보호효과와 지 질과산화(lipid peroxidation) 저해효과, DPPH( 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 라디칼 소거효과를 측정하여 단백질의 산화 및 유지류의 자동산화 반응에 대한 항산화효과를 비교함으로서, 항산화 기능을 갖는 식품개발을 위한 기초 자료로 사용하고자 하였다.
가설 설정
- 1)Values are mean ± SE.
제안 방법
- 냉각된 용액에 n-buth-anol 1,120 μL를 가하고 잘 섞은 다음 250×g로 20분 동안 원심 분리하여(Hanil, Union 5KR) buthanol phase를 취한 후 535 nm에서 흡광도를 측정 (Molecular Devices, SpecraMAX 340 pc)하였다. Fe2+에 의해 유도된 linoleic acid의 과산화물을 TBA로 발색시킨 것을 100%로 가정하였을 때, 채소류 에탄올 추출물을 첨가하여 그 흡광도를 50%로 감소시킬 수 있는 농도를 IC50으로 나타내었고, 저해율(inhibition rate, %)을 산출하였다.
- Devices, SpectraMAX 340pc). 대조군에 대해 시료를 넣었을 때의 흡광도의 감소 정도를 측정하여 저해율(inhibition rate, %)을 구하였다. 대조군의 흡광도를 100%로 하여 향신료 에탄올 추출물을 첨가하여 DPPH 라디칼을 50% 소거하는 시료의 농도(IC50)와 50% 억제효과를 보이는 dry weight를산출하였다.
- 대조군에 대해 시료를 넣었을 때의 흡광도의 감소 정도를 측정하여 저해율(inhibition rate, %)을 구하였다. 대조군의 흡광도를 100%로 하여 향신료 에탄올 추출물을 첨가하여 DPPH 라디칼을 50% 소거하는 시료의 농도(IC50)와 50% 억제효과를 보이는 dry weight를산출하였다.
- 동, 서양에서 널리 사용되고 항균효과가 있는 것으로 알려진 후추, 겨자, 고추냉이, 계피, 정향을 대상으로 DPPH 라디칼 소거 활성, linoleic acid를 이용한 지질과산화억제, MDA에 대한 단백질 보호효과를 측정하여 각 향신료의 항산화효과가 어느 정도인지 측정해보고, 각 향신료들 간의 항산화 효과를 비교한 결과는 다음과 같다. 각 향신료 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, 정향(92.
- 항산화효과를 알아본 결과는 Table 1과 같다. 모든 결과는 각 농도별 저해율(inhibition rate, %)을 구하고 50%를 억제시키는 IC50값(μg/assay)과 dry weight(mg)를 산출하였다. 각 향신료 에탄올 추출물의 저해율(%)은 정향(92.
- 1과 같고, 이를 대조군의 저해율(inhibition rate, %)로 표시한 결과는 Table 5와 같다. 모든 결과는 각 농도별 저해율을 구하고 50%를 억제 시키는 IC50값과 dry weight(mg)를 산출하였다. MDA는 지질과산화과정에서 생성되는 알데히드들 중에서 가장 많이 생성되는 물질로 두 개의 친전자성 알데히드기를 가진 분자이다.
- 세척은 동일한 방법으로 3회 실시하였다. 세척한 시료를 분리하여 12% SDS-PAGE (polyacryl-amide gel electrophoresis)를 사용하여 120 V, 3시간 동안 전기영동을 실시한 후, gel을 Coomassie로 염색하여 MDA-BSA 결합물의 band를 densitometer (Vilber Lourmat, BIO-ID Image Analysis)로 정량함으로서 지 질과 산화물과 단백질의 결합 저해율(inhibition rate, %)을 산출하였다. 이들의 결합을 억제하는 시료의 농도(ICso)과 dry weight를 산출하였다.
- 세척한 시료를 분리하여 12% SDS-PAGE (polyacryl-amide gel electrophoresis)를 사용하여 120 V, 3시간 동안 전기영동을 실시한 후, gel을 Coomassie로 염색하여 MDA-BSA 결합물의 band를 densitometer (Vilber Lourmat, BIO-ID Image Analysis)로 정량함으로서 지 질과 산화물과 단백질의 결합 저해율(inhibition rate, %)을 산출하였다. 이들의 결합을 억제하는 시료의 농도(ICso)과 dry weight를 산출하였다.
대상 데이터
- 4)에 녹여 MDA(malondialdehyde)-BSA(Sigma, Bovine serum albumin) conjugation 반응을 위한 시료로 사용하였다. 95% 에탄올 추출 시료는 DMSO(sigma, dimethyl sulfoxide)에 용해시켜 DPPH 라디칼 소거활성과 지질과산화억제 활성을 위한 시료로 사용하였다.
- 이때 얻은 에탄올 추출물은 rotary vacuum evaporator(EYELA, Rotary vacuum evaporator N-N series)로 농축한 후 동결건조(BioTron, Vacuum freeze dryer)하였다. 동결 건조된 시료 중 80% 에탄올 동결건조 시료는 최소량의 0.1 M PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)에 녹여 MDA(malondialdehyde)-BSA(Sigma, Bovine serum albumin) conjugation 반응을 위한 시료로 사용하였다. 95% 에탄올 추출 시료는 DMSO(sigma, dimethyl sulfoxide)에 용해시켜 DPPH 라디칼 소거활성과 지질과산화억제 활성을 위한 시료로 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 후추(black pepper, Piper nigrum), 겨자(mustard, Brassica juncea), 고추냉이(wasabi, Wasabia japonica)는 시중에 판매되는 오뚜기 회사 제품을 사용하였고, 계피 (cinnamon, Cinnamommum zeylanicum)는 중앙 종합 식품 제품을 사용하였으며, 정향(clove, Syzigium aromaticum)은 수입 상가에서 구입하여 실험 전까지 -20℃에서 냉동 보관하였다.
이론/모형
- DPPH 라디칼 소거효과 측정 : Chen 등(25)의 방법에 따라, DMSO 10μL를 대조군으로 하고, DMSO에 녹여 농도별로 희석한 시료 10μL에 200μM DPPH(l,l-diphenyl-2-picryl hydrazyl/ethanol) 190 μL를 가한 후, 37℃ 에서 30분 동안 반응시킨 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다(Molecular Devices, SpectraMAX 340pc). 대조군에 대해 시료를 넣었을 때의 흡광도의 감소 정도를 측정하여 저해율(inhibition rate, %)을 구하였다.
- MDA-BSA conjugation 반응 억제효과 측정 : Park(28)의 방법에 따라 bovine serum albumin(BSA, mg/mL), malondialdehyde(MDA, 20 mM) 100 μL, 향신료 에탄올 추출물, 0.1 M PBS를 혼합하여 37℃에서 24시간 반응시켰다. 이 때 BSA 단백질정량은 Bradford법(29)을 사용하였고, MDA는 Gomez-Sanchez 등(30)의 방법에 따라 제조하였다.
- 1 M PBS를 혼합하여 37℃에서 24시간 반응시켰다. 이 때 BSA 단백질정량은 Bradford법(29)을 사용하였고, MDA는 Gomez-Sanchez 등(30)의 방법에 따라 제조하였다. 반응시킨 시료 500μL를 Centricon(Amicon, Centricon YM-10)에 넣고, 1,400×g에서 2시간 동안 원심 분리하여(Beckman, Model J2-21 centrifuge), MDA와 BSA의 결합물을 분리한 후 증류수 700 μL를 넣고 1,400×g에서 2시간 동안 원심 분리하여 여분의 염 등을 세척하였다.
- 지질과산화 억제효과 측정 : Saija 등(26)과 Haase와 Dunkley(27)의 방법에 따라 Fe2+에 의해 유도된 linoleic acid의 과산화에 대한 억제 활성을 TBA(thiobarbituric acid, Sigma)로 발색시켜 측정하였다. 10 mL의 10 mM linoleic acid solution에 시료 20 μL를 가하고 37℃ shaking incubator에서 1시간 동안 교반시킨 후, 0.
성능/효과
- 8%로 강한 linoleic acid의 과산화화 억제 활성을 보인 것으로 나타났고, 고추냉이, 겨자, 정향은 에탄올 추출물의 농도가 증가할수록 지질과산화 저해율이 상승하였으나, 후추와 계피는 1000 μg/assay의 고농도에서는 저 해율이 다소 감소하는 경향을 보여 최고의 효과를 보인 농도는 300 μg/assay 수준임을 알 수 있었다. MDA에 대한 단백질 보호효과를 검색한 결과, 겨자와 고추냉이가 각각 73.2%와 72.2%로 MDA-BSA의 교차결합을 효과적으로 차단하였고, 후추도 61.6%의 저해율을 보였다. 이상에서 살펴 본 바와 같이, 각 측정법에 따라 항산화 효과에 차이가 있었으나 이들 향신료를 상용함으로서 생체 산화와 관련된 질병 및 노화의 예방과 억제효과가 있을 것으로 사료된다.
- 6%)는 농도 의존적으로 상승하였다. 가수 분해되는 과정에서 형성되는 정유성분인 isothiocyanate와 allylisothiocyanate에 의해 각각 매운맛과 강한 항균 활성을 나타내는 것으로 보고(21,23)된 겨자 고추냉이의 항산화 활성은 유사한 경향을 보였는데 , DPPH 라디칼 소거능은 겨자와 고추냉이가 81.1%와 89.9%, MDA에 대한 단백질 보호 효과는 73.2%, 72.2%로 우수하였으나, 지질과산화억제 활성은 최대 농도에서 46.1%, 40.9%로 비교적 낮게 나타났다. Hur 등(31)은 고추냉이에서 추출한 플라보노이드 배당체가 지질과산화 억제 효과가 있음을 보고하였고, Han 등(32)의 연구에서 겨자가 비슷한 지질과산화 억제 효과를 보여 본 연구 결과와 비슷한 경향을 보였다.
- 각 향신료 에탄올 추출물들의 저해율을 살펴보면, 겨자와 고추냉이가 각각 73.2%와 72.2%로 MDA-BSA의 교차 결합을 효과적으로 차단하였다. 후추도 61.
- 동, 서양에서 널리 사용되고 항균효과가 있는 것으로 알려진 후추, 겨자, 고추냉이, 계피, 정향을 대상으로 DPPH 라디칼 소거 활성, linoleic acid를 이용한 지질과산화억제, MDA에 대한 단백질 보호효과를 측정하여 각 향신료의 항산화효과가 어느 정도인지 측정해보고, 각 향신료들 간의 항산화 효과를 비교한 결과는 다음과 같다. 각 향신료 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, 정향(92.9%)과 계피(89.9%)가 높은 저해활성을 보였다. 각 향신료의 에탄올 추출물의 지질과산화억제 활성은 정향만이 55.
- 각 향신료 에탄올 추출물의 농도에 따른 저해율은 후추, 겨자, 고추냉이는 농도가 증가할수록 DPPH 라디칼 소거 활성이 증가하였으나, 계피와 정향은 높은 농도에서 오히려 DPPH 라디칼 소거활성이 감소하였다. 이들 향신료들의 IC50 값(μg/assay)을 비교해보면, 계피와 정향이 4.
- 모든 결과는 각 농도별 저해율(inhibition rate, %)을 구하고 50%를 억제시키는 IC50값(μg/assay)과 dry weight(mg)를 산출하였다. 각 향신료 에탄올 추출물의 저해율(%)은 정향(92.9%), 계피(89.9%), 겨자(81.1%), 후추(77.6%), 고추냉이(66.0%)로, 모든 시료의 저해율이 50%를 상회하여 DPPH 라디칼 소거 활성이 우수한 것으로 나타났다.
- 차이가 있음을 알 수 있었다. 각 향신료별로 살펴보면, 후추는 DPPH 라디칼 소거능(77.6%)과 MDA에 대한 단백질 보호 효과(61.6%)는 농도 의존적으로 상승하였다. 가수 분해되는 과정에서 형성되는 정유성분인 isothiocyanate와 allylisothiocyanate에 의해 각각 매운맛과 강한 항균 활성을 나타내는 것으로 보고(21,23)된 겨자 고추냉이의 항산화 활성은 유사한 경향을 보였는데 , DPPH 라디칼 소거능은 겨자와 고추냉이가 81.
- 9%)가 높은 저해활성을 보였다. 각 향신료의 에탄올 추출물의 지질과산화억제 활성은 정향만이 55.8%로 강한 linoleic acid의 과산화화 억제 활성을 보인 것으로 나타났고, 고추냉이, 겨자, 정향은 에탄올 추출물의 농도가 증가할수록 지질과산화 저해율이 상승하였으나, 후추와 계피는 1000 μg/assay의 고농도에서는 저 해율이 다소 감소하는 경향을 보여 최고의 효과를 보인 농도는 300 μg/assay 수준임을 알 수 있었다. MDA에 대한 단백질 보호효과를 검색한 결과, 겨자와 고추냉이가 각각 73.
- 이런 MDA는 단백질 내부의 아미노산 잔기들 사이에서 뿐만 아니라 외부 단백질분자의 잔기 사이에서도 교차결합(cross-linking)을 일으켜 단백질 변형, 세포막파괴, 조직 손상, 효소들의 기능 저하 등 광범위하게 영향을 미친다(28). 겨자와 고추냉이, 후추 에탄올 추출물을 처리하면 MDA-BSA 교차결합 형성이 차단되었고, 교차결합의 형성 차단정도를 비교한 상대 저해율은 각 향신료 추출물의 처리농도가 증가할수록 저해율이 높아짐을 알 수 있었다.
- 4 mg으로 나타나 IC50값과 다른 경향을 보였는데, 이는 추출 수득율의 차이에 기인한 것으로 보인다. 결과적으로 다섯 가지 향신료 중 겨자가 MDA-BSA 교차결합에 대한 차단을 가장 효과적으로 수행하는 것으로 나타났고, 고농도에서의 차단 효과도 우수한 것으로 보인다.
- 4%) 순이었다. 농도에 따른 향신료 에탄올 추출물의 저해율을 보면, 고추냉이, 겨자, 정향은 에탄올 추출물의 농도가 증가할수록 지질과 산화 저해율이 상승하였으나, 후추와 계피는 1000 μg/assay의 고농도에서는 저해율이 다소 감소하는 경향을 보여 최고의 효과를 보인 농도는 300 μg/assay 수준임을 알 수 있었다. 이들 향신료의 IC50값(μg/assay)을 비교해 보면, 정향은 415.
- 다섯 가지 향신료의 항산화효과를 탐색하기 위해 DPPH 라디칼 소거 활성, 지질과산화억제 활성, MDA-BSA 교차결합 반응 억제 효과를 측정한 결과, 각 측정법에 따라 항산화 효과에 차이가 있음을 알 수 있었다. 각 향신료별로 살펴보면, 후추는 DPPH 라디칼 소거능(77.
- 수분 햠량과 추출 수득율의 차이에 따른 50% 억제 효과를 보이는 dry weight(mg)를 살펴보면 (Table 2), 정향과 계피가 각각 0.01 mg으로 가장 효과가 좋은 것으로 나타났고, 후추, 겨자, 고추냉이가 0.6 mg, 0.2 mg, 0.2 mg으로 DPPH 라디칼 소거 활성을 보였다. 용매추출 조건에 따른 계피의 항산화성을 비교한 유사한 연구에서 본 실험에서와 동일 조건으로 추출한 시료의 DPPH 소거 활성이 가장 좋았고, 이는 추출 시료중에 함유된 페놀계 화합물의 함량이 높았던 것으로 보고하여(22) 계피의 항산화 활성은 페놀계 화합물에 의한 것임을 시사하였다.
- 시료의 에탄올 추출물은 건조시료 일정량(5 g)에 20배의 80% 에탄올이나 95% 에탄올을 가하여 실온에서 24시간 동안 추출한 후 여과하는 과정을 2회 반복하였다. 이때 얻은 에탄올 추출물은 rotary vacuum evaporator(EYELA, Rotary vacuum evaporator N-N series)로 농축한 후 동결건조(BioTron, Vacuum freeze dryer)하였다.
- 2 mg으로 DPPH 라디칼 소거 활성을 보였다. 용매추출 조건에 따른 계피의 항산화성을 비교한 유사한 연구에서 본 실험에서와 동일 조건으로 추출한 시료의 DPPH 소거 활성이 가장 좋았고, 이는 추출 시료중에 함유된 페놀계 화합물의 함량이 높았던 것으로 보고하여(22) 계피의 항산화 활성은 페놀계 화합물에 의한 것임을 시사하였다.
- 6%의 저해율을 보였으나, 계피와 정향은 측정할 수 없었다. 이들 향신료 에탄올 추출물의 IC50값(μg/assay)을 비교해보면 (Table 6), 겨자가 22.72 mg/assay으로 비교적 효과가 좋은 것으로 나타났고, 고추냉이와 후추는 각각 30.45 mg/assay와 38.20 mg/assay이었다. 추출물 수득율의 차이에 따른 50% 억제 효과를 보이는 dry weight(mg)를 살펴보면, 겨자가 29.
- 라디칼 소거활성이 감소하였다. 이들 향신료들의 IC50 값(μg/assay)을 비교해보면, 계피와 정향이 4.0 μg/assay, 5.9 μg/assay로 강한 소거 활성을 보였고, 후추, 겨자, 고추냉이는 147.3 μg/assay, 113.1 μg/assay, 231.4 μg/assay로 위의 두 향신료에 비해 낮으나 비교적 높은 소거 화성을 보였다.
- 농도에 따른 향신료 에탄올 추출물의 저해율을 보면, 고추냉이, 겨자, 정향은 에탄올 추출물의 농도가 증가할수록 지질과 산화 저해율이 상승하였으나, 후추와 계피는 1000 μg/assay의 고농도에서는 저해율이 다소 감소하는 경향을 보여 최고의 효과를 보인 농도는 300 μg/assay 수준임을 알 수 있었다. 이들 향신료의 IC50값(μg/assay)을 비교해 보면, 정향은 415.06 μg/assay으로 가장 좋은 효과를 가지는 것으로 나타났고, 후추, 겨자, 고추냉이, 계피는 각각 700.9 μg/assay, 745.2 μg/assay, 2892.4 μg/assay, 1946.6 μg/assay으로 비교적 낮은 활성을 보였다. 주줄물 수득율 차이에 따른 50% 억제 효과가 있는 dry weight(mg)를 살펴보면(Table4), 정향(0.
- 용매추출 조건에 따른 계피의 항산화성을 비교한 유사한 연구에서 본 실험에서와 동일 조건으로 추출한 시료의 DPPH 소거활성이 가장 좋았고, 이는 추출 시료 중에 함유된 페놀계 화합물의 함량이 높았던 것으로 보고하여(22) 계피의 항산화 활성은 페놀계 화합물에 의한 것임을 시사하였다. 정향의 DPPH 라디칼 소거 활성과 유지류의 자동산화 반응에 대한 항산화효과는 각각 저해율이 92.9%, 55.8%로 다른 향신료에 비해 우수했으나, MDA-BSA conjugation 반응은 측정할 수 없었는데, 이는 정향 처리에 의해 단백질 변형이 일어난 것으로 보여 정향은 MDA-BSA conjugation 반응을 억제하지는 못하는 것으로 보인다.
- 20 mg/assay이었다. 추출물 수득율의 차이에 따른 50% 억제 효과를 보이는 dry weight(mg)를 살펴보면, 겨자가 29.2 mg으로 가장 효과가 좋은 것으로 나타났고, 후추와 고추냉이가 각각 72.3 mg과 105.4 mg으로 나타나 IC50값과 다른 경향을 보였는데, 이는 추출 수득율의 차이에 기인한 것으로 보인다. 결과적으로 다섯 가지 향신료 중 겨자가 MDA-BSA 교차결합에 대한 차단을 가장 효과적으로 수행하는 것으로 나타났고, 고농도에서의 차단 효과도 우수한 것으로 보인다.
후속연구
- 6%의 저해율을 보였다. 이상에서 살펴 본 바와 같이, 각 측정법에 따라 항산화 효과에 차이가 있었으나 이들 향신료를 상용함으로서 생체 산화와 관련된 질병 및 노화의 예방과 억제효과가 있을 것으로 사료된다.
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