돼지 난포란 유래 체외수정란 생산에 대한 제요인의 영향 I. 체외성숙, 체외수정, 체외발달에 대한 체외성숙 배양액의 영향 Effects of Some Factors on In Vitro Production of Embryos from Antral Follicle-Derived Porcine Oocytes I. Effects of Maturation Media on In Vitro Maturation, Fertilization and Development원문보기
본 연구는 보다 안정된 돼지 체외수정란 생산시스템 확립을 목적으로 체외성숙배양액 mNCSU-37, mNCSU-23 및 TCM-199 가 각각 미성숙 난포란의 체외성숙, 체외수정, 체외발달에 미치는 영향을 구명하기 위하여 수행하였다. 도축돼지의 난소에서 채취한 COCs를 10% pFF가 포함된 각각의 성숙배양액에서 최종동도가 1${\times}10^5/m{\ell}$ 의 농도로 체외수정 시킨 다음, NCSU-23 에서 체외발달을 유도한 결과는 다음과 같다. 1. TCM-199에서 성숙시킨 난자가 mNCSU-37 이나 mNCSU-23에서 성숙시킨 것보다 난핵포 붕괴율과 핵 성숙율에서 다소 낮은 경향을 보였으나 유의적인 차이는 아니었다. 2. 정자 침투율은 성숙배양액간 유의적인 차이를 나타내지 않았으나 웅성정핵 형성율은 mNCSU-37 에서 성숙시킨 난자가 88.0%로 TCM-199 에서 성숙시킨 것의 71.1%보다 유의적으로 높았다.(p<0.05). 3. 난분할율은 mNCSU-37(52.3%)이나 mNCSU-23(53.7%)에서 성숙시킨 난자가 TCM-199(43.1%)에서 성숙시킨 난자보다 유의적으로 높았다(p<0.05). 배반포발달율도 mNCSU-37이나 mNCSU-23에서 성숙시킨 것이 TCM-199에서 성숙시킨 것보다 다소 높았지만 유의적인 차이는 아니었다. 이상의 결과로 보아 돼지 미성숙 난포란 유래의 체외수정란 생산을 위한 체외성숙배양액으로 TCM-199보다 mNCSU-37이나 mNCSU-23이 적합한 것으로 사료된다.
본 연구는 보다 안정된 돼지 체외수정란 생산시스템 확립을 목적으로 체외성숙배양액 mNCSU-37, mNCSU-23 및 TCM-199 가 각각 미성숙 난포란의 체외성숙, 체외수정, 체외발달에 미치는 영향을 구명하기 위하여 수행하였다. 도축돼지의 난소에서 채취한 COCs를 10% pFF가 포함된 각각의 성숙배양액에서 최종동도가 1${\times}10^5/m{\ell}$ 의 농도로 체외수정 시킨 다음, NCSU-23 에서 체외발달을 유도한 결과는 다음과 같다. 1. TCM-199에서 성숙시킨 난자가 mNCSU-37 이나 mNCSU-23에서 성숙시킨 것보다 난핵포 붕괴율과 핵 성숙율에서 다소 낮은 경향을 보였으나 유의적인 차이는 아니었다. 2. 정자 침투율은 성숙배양액간 유의적인 차이를 나타내지 않았으나 웅성정핵 형성율은 mNCSU-37 에서 성숙시킨 난자가 88.0%로 TCM-199 에서 성숙시킨 것의 71.1%보다 유의적으로 높았다.(p<0.05). 3. 난분할율은 mNCSU-37(52.3%)이나 mNCSU-23(53.7%)에서 성숙시킨 난자가 TCM-199(43.1%)에서 성숙시킨 난자보다 유의적으로 높았다(p<0.05). 배반포발달율도 mNCSU-37이나 mNCSU-23에서 성숙시킨 것이 TCM-199에서 성숙시킨 것보다 다소 높았지만 유의적인 차이는 아니었다. 이상의 결과로 보아 돼지 미성숙 난포란 유래의 체외수정란 생산을 위한 체외성숙배양액으로 TCM-199보다 mNCSU-37이나 mNCSU-23이 적합한 것으로 사료된다.
This study was carried out to examine the effects of maturation media on in vitro maturation (IVM) of porcine immature oocytes, and on subsequent in vitro fertilization (IVF) and development (IVD). Cumulus-oocyte complexes (COCs) were collected from antral follicles of porcine ovaries collected from...
This study was carried out to examine the effects of maturation media on in vitro maturation (IVM) of porcine immature oocytes, and on subsequent in vitro fertilization (IVF) and development (IVD). Cumulus-oocyte complexes (COCs) were collected from antral follicles of porcine ovaries collected from abattoir, and were matured in vitro in modified NCSU-37 (mNCSU-37), modified NCSU-23 (mNCSU-23), or TCM-199 supplemented with 10% porcine follicular fluid (pFF). Oocytes matured in vitro, were fertilized in vitro in modified Tris-buffered medium(mTBM) with the final motile sperm concentration of 1${\times}$105 sperm/mL, and subsequently putative embryos were developed in vitro in NCSU-23. The results are as follows. 1. In the result of IVM, the rate of germinal vesicle breakdown (GVBD) and of nuclear maturation were not significantly different among the media, though numeric value of them were slightly lower in TCM-199 than in mNCSU-37 or in mNCSU-23. 2. In the result of IVF, though the rate of sperm penetration was not significantly different among the maturation media, the percentage of oocytes with male pronucleus (MPN) of ones matured in mNCSU-37 (88.0%) was significantly higher than in TCM-199 (71.1%) (p<0.05). 3. In the result of IVD, the percentage of cleaved oocytes of ones matured in mNCSU-37 (52.3%) or in mNCSU-23 (53.7%) was significantly higher than in TCM-199 (43.1%) (p<0.05), but the rate of blastocysts at day 6 was not significantly different among the maturation media, though putative embryos from oocytes matured in mNCSU-37 or in mNCSU-23 were developed more than in TCM-199. These results suggested that mNCSU-37 or mNCSU-23 was more appropriate than TCM-199 as IVM medium for porcine immature oocytes.
This study was carried out to examine the effects of maturation media on in vitro maturation (IVM) of porcine immature oocytes, and on subsequent in vitro fertilization (IVF) and development (IVD). Cumulus-oocyte complexes (COCs) were collected from antral follicles of porcine ovaries collected from abattoir, and were matured in vitro in modified NCSU-37 (mNCSU-37), modified NCSU-23 (mNCSU-23), or TCM-199 supplemented with 10% porcine follicular fluid (pFF). Oocytes matured in vitro, were fertilized in vitro in modified Tris-buffered medium(mTBM) with the final motile sperm concentration of 1${\times}$105 sperm/mL, and subsequently putative embryos were developed in vitro in NCSU-23. The results are as follows. 1. In the result of IVM, the rate of germinal vesicle breakdown (GVBD) and of nuclear maturation were not significantly different among the media, though numeric value of them were slightly lower in TCM-199 than in mNCSU-37 or in mNCSU-23. 2. In the result of IVF, though the rate of sperm penetration was not significantly different among the maturation media, the percentage of oocytes with male pronucleus (MPN) of ones matured in mNCSU-37 (88.0%) was significantly higher than in TCM-199 (71.1%) (p<0.05). 3. In the result of IVD, the percentage of cleaved oocytes of ones matured in mNCSU-37 (52.3%) or in mNCSU-23 (53.7%) was significantly higher than in TCM-199 (43.1%) (p<0.05), but the rate of blastocysts at day 6 was not significantly different among the maturation media, though putative embryos from oocytes matured in mNCSU-37 or in mNCSU-23 were developed more than in TCM-199. These results suggested that mNCSU-37 or mNCSU-23 was more appropriate than TCM-199 as IVM medium for porcine immature oocytes.
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문제 정의
본 연구는 보다 안정된 돼지체외수정란 생산시스템 확립을 목적으로 체외성숙 배양액 mNCSU- 37, mNCSU-23 및 TCM-199가 각각 미성숙 난포란의 체외성숙, 체외수정, 체외 발달에 미치는 영향을 구명하기 위하여 수행하였다. 도축돼지의 난소에서 채취한 COCs를 10% pFF가 포함된 각각의 성숙 배양액에서 체외성숙시키고, mTBM에서 운동정자의 최종 동도가 lxl05 의 농도로 체외수정시킨 다음, NCSU-23에서 체외 발달을 유도한 결과는 다음과 같다.
본 연구는 보다 안정된 돼지체외수정란 생산시스템의 확립에 활용하기 위하여, 돼지미성숙 난포란을 같은 물질이 첨가된 몇 가지 배양액에서 체외성숙시킴으로써 이들 배양액이 체외성숙, 체외수정, 체외 발달에 미치는 영향을 밝히고자 실시했 다.
제안 방법
TL-Hepes-PVA와 체외성숙 배양액으로 각각 3회 세정한 COCs를 각 well당 40〜50개씩 미리 준비된 성숙배양액으로 옮겼다. 39℃, 5% CO2 및 포화습도의 CO2 배양 기에서 호르몬과 dbcAMP를 첨가하여 20〜22시간 배양한 다음, 호르몬과 dbcAMP를 첨가하지 않고 22〜24시간 배양하여 총 44〜46시간 동안 배양함으로써 체외성숙을 유도했다.
4-well dish(Nunc, Denmark) 에 각 well 당 500 μL 체외 성숙 배양액을 넣고 mineral oil로 덮은 다음 2시간 이상 전 배양을 실시했다. TL-Hepes-PVA와 체외성숙 배양액으로 각각 3회 세정한 COCs를 각 well당 40〜50개씩 미리 준비된 성숙배양액으로 옮겼다. 39℃, 5% CO2 및 포화습도의 CO2 배양 기에서 호르몬과 dbcAMP를 첨가하여 20〜22시간 배양한 다음, 호르몬과 dbcAMP를 첨가하지 않고 22〜24시간 배양하여 총 44〜46시간 동안 배양함으로써 체외성숙을 유도했다.
본 연구는 보다 안정된 돼지체외수정란 생산시스템 확립을 목적으로 체외성숙 배양액 mNCSU- 37, mNCSU-23 및 TCM-199가 각각 미성숙 난포란의 체외성숙, 체외수정, 체외 발달에 미치는 영향을 구명하기 위하여 수행하였다. 도축돼지의 난소에서 채취한 COCs를 10% pFF가 포함된 각각의 성숙 배양액에서 체외성숙시키고, mTBM에서 운동정자의 최종 동도가 lxl05 의 농도로 체외수정시킨 다음, NCSU-23에서 체외 발달을 유도한 결과는 다음과 같다.
도축장에서 체중 HO kg 전후의 미경산 돈 난소를 도축 직후 회수하여 35〜38℃의 멸균생리식염 수(0.9% NaCl)로 2회 세척한 다음, 같은 액으로 채 운 보온병에 침지하여 60분 이내에 실험실로 운반 하였고, 실험실에서 신선한 생리식염수로 다시 2〜3회 난소를 세척한 다음 COCs를 채취했다. COCs는 직경이 3~6 mm의 포상난포로부터 19게이지 주사침이 장착된 10 mL 주사기로 난포액과 함께 흡인한 다음, 37℃의 가온블록에 미리 준비해둔 15 mL 원심분리관(Coming, USA)으로 옮겼다.
또 체외수정이 종료된 추정수정란(putative em- bryos)을 반복 당 9개씩 취하여 잔류난구세포와 투명대에 부착된 정자를 제거하고 체외발달 배양액에 옮겨 10시간 동안 추가로 배양한 다음, Byun 등(1991)의 방법에 따라 난자급속염색법(Rapid Stai ning Method)으로 염색하고 위상차현미경 (Olym pus AX70, 400x) 하에서 정자의 침입, 다정자 수정, 웅성 전핵형성 등 수정 여부를 확인했다 (Fig. 1).
체외수정이 완료된 추정 수정란은 체외발달배양액으로 3회 세척한 다음 4-well dish(Nunc, Denmark)의 500μL 체외발 달배양액에 well당 30〜40개씩 옮겨 넣은 다음, 39 ℃, 5% CO2 및 포화습도의 배양기내에서 배양하여 체외 발달시켰다. 체외 배양 개시 후 약 44시간에 난 할율, 약 144시간에 배반포발달율을 조사했다.
체외성숙 배양액은 BSA를 넣지 않은 NCSU-37 및 NCSU-23(Petters와 Wells, 1993) 즉, mNCSU- 37 및mNCSU-23 또는 TCM-199에 10% pFF, 0.6 mM cysteine, 50 /At j3-mercaptoethanol, 그리고 ImM dbcAMP를 첨가하여 사용했고, 호르몬은 lOIU/mL PMSG와 lOIU/mL hCG를 첨가했다.
체외성숙에 사용되는 배양액이 돼 지 난 포란의 체외성숙, 체외수정 및 체외 발달에 미치는 영향을 구명하기 위하여, 단순 배양액으로 sorbitol이 들어있는 NCSU-37과 taurine 및 hypotaurine이 들어있는 NCSU-23에서 각각 BSA를 제외시킨mNCSU- 37과mNCSU-23, 그리고 복합배양액으로 TCM-199를 사용하여 체외성숙을 유도한 다음, 정해진 절차와 방법으로 체외수정과 체외발달 배양을 실시하여 각 단계 별로 성숙배양액의 영향을 조사하였 다.
체외수정용 배양액은 2.0 mM caffeine sodium benzoate와 0.1% BSA(Sigma, Fraction V)를 첨가한 mTBM(Abeydeera와 Day, 1997a)을 사용했으며, 체외수정에 사용하기 전 48시간 이상 전 배 양을 실시하여 안정화시킨 다음 이용했다.
대상 데이터
이 원심분리관을 10분간 정치시켜 침전된 pellet을 회수하고 35x10 mm petri-dish(FALCON, USA) 에서 mTL-Hepes-PVA(Long 등, 1999)로 희석하였다. 실체현미경(Olympus SZH- 10, Japan)하에서 난구세포가 2〜3층 이상 치밀하게 붙고 난자의 세포질이 균일한 COCs만을 선별하여 실험에 공시했다.
정액은 수압법으로 채취하여 Modena 희석액(SGI, USA)으로 생존정자수로 3xl07 sperm/ml의 농도가 되도록 액상정액을 만들어 3일 이내에 사용했고, 정자세정액은 0.1% BSA와 75μg/mL penicillin G 및 50 /jgg/mL streptomycin sulfate를 첨가한 D-PBS를 사용했다.
체외성숙/체 외수정란의 발달배 양에는 0.4% BSA (Sigma, Fraction V)가 함유된 NCSU-23(Petters and Wells, 1993)을 사용했다. 체외수정이 완료된 추정 수정란은 체외발달배양액으로 3회 세척한 다음 4-well dish(Nunc, Denmark)의 500μL 체외발 달배양액에 well당 30〜40개씩 옮겨 넣은 다음, 39 ℃, 5% CO2 및 포화습도의 배양기내에서 배양하여 체외 발달시켰다.
데이터처리
본 연구에서는 각 실험별로 처리당 4회 이상 반복 시험을 수행했으며, 조사된 성적은 분산분석(AN0VA)을 실시한 다음 유의성이 인정된 것에 대해서는 LSD에 의하여 처리간 차이를 구분했다.
이론/모형
성숙배양이 끝난 난자의 일부(반복당 6개 또는 9개)를 Byun 등(1991)의 방법에 따라 난자급속염색법으로 염색하고 위상차현미경 (Olympus AX70, 400〜800x)하에서 Hunter와 Polge(1966)의 방법에 준하여 핵성숙 단계를 판정했다.
성능/효과
1. TCM-199에서 성숙시킨 난자가 mNCSU-37 이나mNCSU-23 에서 성숙시킨 것보다 난 핵 포붕괴율과 핵성숙율에서 다소 낮은 경향을 보였으나 유의적인 차이는 아니었다.
2.정자 침투율은 성숙배양액 간 유의적인 차이를 나타내지 않았으나 웅성 전핵 형성율은mNCSU-37에서 성숙시킨 난자가 88.0%로 TCM-199에서 성숙시킨 것의 71.1%보다 유의적으로 높았다S0.05).
3.난 분할율은 mNCSU-37(52.3%)이나 mNCSU- 23(53.7%)에서 성숙시킨 난자가 TCM-199 (43.1 %)에서 성숙시킨 난자보다 유의적으로 높았다8<0.05).배반포발달율도 mNCSU-37 이나mNCSU-23 에서 성숙시킨 것이 TCM- 199에서 성숙시킨 것보다 다소 높았지만 유의적인 차이는 아니었다.
mNCSU-37과 mNCSU-23 및 TCM-199를 사용하여 체외 성숙을 유도한 결과는 Table 1과 같다. TCM-199에서 성숙된 난자의 난핵 포 붕괴율이 88.8%로 다른 두 가지 배양액에서 성숙된 것(92. 4〜93.0%)보다 약간 낮았으나 배양액 간 유의적인 차이는 없었고, TCM-199에서 성숙된 난자의 핵성숙율도 75.6%로 다른 배양액에서의 8L1 〜82.9%보 다 다소 낮았지만 유의적인 것은 아니었다.
3%로 TCM-199에서 성숙시킨 것에서 다소 낮았으나 유의적인 차이는 아니었다. 그러나 웅성전 핵 형성율은 mNC SU-37에서 성숙시킨 난자(88.0%)가 mNCSU-23에 서 성숙시킨 것(81.8%)과는 차이가 없었지만 TCM-199에서 성숙시킨 것(71.1%)보다는 유의적으로 높았다 <P<0.05).
이어서 이들 난자를 NCSU-23에서 체외 발달시 킨 결과는 Table 3과 같다. 난분할율은mNCSU-37 이나 mNCSU-23 에서 성숙시킨 것(각각 52.3, 53.7%)이 TCM-199에서 성숙시킨 것(43.1%)보다 유의적으로 높았다 (p<0.05). 한편, 배반포 발 달율 은 분할란 및 추정 수정란 대비 모두mNCSU-23과 mNCSU-37이 TCM-199보다 다소 높은 경향을 나타냈으나 유의적인 차이는 없었다.
TCM-199 와 Way mouth medium 에 포함되어 있는 아미노산과 Waymouth medium에 포함되어 있는 cystein을 첨가해도 pFF를 첨가하지 않은 protein-free NCSU- 23은 체외성숙율과정자 침투율이 낮았다는 Abey- deera 등(1998a)의 보고로 미루어 볼 때, 이러한 결과는 성숙배양액의 어떤 성분이나 첨가물과의 상호작용에 의해 특정물질의 첨가가 난자의 발달에 이롭게 작용하거나 작용하지 못 하기 때문인 것 같다. 본 실험에서 Wang 등(1997)과 다르게 나타난 난 분할율의 유의적인 차이는 amercaptoethanol을 cysteine과 함께 첨가함으로써 웅성 전핵 형성율이 다소 개선된 결과로 보인다. Abeydeera 등(1998b)은 mNCSU-23 에 cysteine과 함께 f-mercaptoe-thanol을 첨가하면 난자 내 GSH 이 증가했다고 보고했으며, Bing 등(2001)과 Yamauchi와 Nagai (1999)는 TCM-199에 cysteamine을 첨가하면 난자 내 GSHo] 증가하여 웅성전 핵형성율이 개선된다고 보고한 바 있다.
이상의 결과로 보아 돼지 미성숙 난포란 유래의 체외수정란 생산을 위한 체외성숙 배양액으로 TCM- 199보다mNCSU-37이나 mNCSU-23 이 적합한 것으로 사료된다.
05). 한편, 배반포 발 달율 은 분할란 및 추정 수정란 대비 모두mNCSU-23과 mNCSU-37이 TCM-199보다 다소 높은 경향을 나타냈으나 유의적인 차이는 없었다.
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