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문제 정의
- 수질 및 저질 개선제로서의 활용 가능성은 간이 테스트 시험에서 1차 확인하였으며 이를 규명하여 상품의 용도를 확대하려 하였다 (한국과학재단 2001). 본 연구는 환경친화적이고 안전한 해산물을 생산할 수 있는 생장 촉진제를 개발하려는 추세에 맞추어 이미 개발되어 양돈 및 농산물 재배에서 효과가 검증된 본 제품을 양식 장에적용함으로서 제품의 용도를 확대하는 근거자료를 마련하는데 목적이 있다. 더블어, 생리활성물질인 "블루민” 상품을 해양오염으로 파생되는 문제- 적조생물 방제와 생장 억제, 양어장의 적조피해 경감.
- 양어장 보조사료화, 해양 저질토의 오염 개량개선 -등 문제에 그 효과를 검정하고 새로운 용도를 개발하고 보급을 확대하여 상품화 근거자료를 마련하고자 하였다. 본 연구에서는 주로 적조생물의 제거능과 생장 저해 정도를 검정하고, 먹이생물의 지방산 조성 등에 미치는 영향을 측정하였다.
- 더블어, 생리활성물질인 "블루민” 상품을 해양오염으로 파생되는 문제- 적조생물 방제와 생장 억제, 양어장의 적조피해 경감. 양어장 보조사료화, 해양 저질토의 오염 개량개선 -등 문제에 그 효과를 검정하고 새로운 용도를 개발하고 보급을 확대하여 상품화 근거자료를 마련하고자 하였다. 본 연구에서는 주로 적조생물의 제거능과 생장 저해 정도를 검정하고, 먹이생물의 지방산 조성 등에 미치는 영향을 측정하였다.
제안 방법
- Hexane층만 수거하여 Nzgas로 휘발시키고, 여기에 hexane 100 ㎕를 가하여 녹였다. 1 pd를 gas chromatography (HP 6890)에 injection하여 지방산을 분석하였으며 지방산의 동정은 GC mass와 표준지방산 methyl ester mixture (Sigma 189-19)를 이용하여 식별하였다.
- 블루민 원액의 500, 1,000, 2,000, 4, 000, 8, 000, 16, 000배 희석액과 대조구를 각각 준비하였다. 2일 간격으로 적조생물의 세포를 계수하였다. 한편 Alexandrium catenella 등 7종적조생물의 생장에 대한블루민의 영향을 측정하기 위하여 블루민 L000배 희석액에서 각각 배 양하였다.
- GC(HP 6890, HP-INNOWax30m x 0.25 mm x 0.25 m 칼럼)로 지방산을 분석하였다. Chloroform층을 egas로 휘발시 킨 후, BF3 methanol 500 heptadecanoic add(C17:0) 50㎕ 가하여 70℃에서 5분간 반응시킨 후 실온에서 냉각시켰다.
- 4와 같다. MA 배지에 블루민 500배 (pH 7.4), 1, 000배, 10, 000배 및 100,000배(pH8.5) 희석한 실험구와 0.1 NNaOH 용액을 사용하여 배지의 초기 pH 8.6으로 조정한실험구로 구별하여 측정하였다. pH를 조정한 10, 000배와 100, 000배 희석처리구에서는 각각 9%와 12%가 생장이 증가한 반면 500배 희석구에서는 52%, 1,000배에서는 31% 감소하었다.
- 국내에서 어류 및 패류 먹이로 이용되는 먹이 생물의 영양가를 파악하기 위하여 I. galbana 이외 4종의 먹이생물 (Chaetoceros calcitrans, Monochrysis sp., Nannochloropsis oculata, Phaeodactylimi tricomutimi) 을 분석하였다. 총지질 (total fatty add, TFA) 정량은 Bligh and Dyer(1959) 방법에 따랐다.
- 민간 종묘장에서 먹이생물의 배지는 전량 비료를 사용하였다. 농업용 비료는 배양액톤당 요소 60g 복합비료 20g을 투여하였다.
- 한편 Alexandrium catenella 등 7종적조생물의 생장에 대한블루민의 영향을 측정하기 위하여 블루민 L000배 희석액에서 각각 배 양하였다. 담수 조류 M. aerugimsa의 배 양시 블루민을 처리하여 블루민이 담수 조류의 생장에 미치는 영향을 조사하였다.
- gykriSkl%를 접종하고 생장을 관찰하였다. 블루민 원액의 500, 1,000, 2,000, 4, 000, 8, 000, 16, 000배 희석액과 대조구를 각각 준비하였다. 2일 간격으로 적조생물의 세포를 계수하였다.
- ㎛ mesh net 로 여과하여 5, 비이커에 넣었다. 블루민, 제강슬래 그(slag), 황토 (yellow loess), 수처리제 (CaO, Ca(OH)2, Mg(OH)2, 응집제(PAC, polyacrylamide) 와 황산 gSQ)을 첨가한(블루 민과 황산은 500-5,000 mg-f1 농도, 다른 처리제는 1,000mg-r1) 후 180rpm 급속으로 5분, 40 rpm 완속으로 10분 동안 각각 교반하였다. 상등액을 시간대별로 채취하여 형광(TumerAU-10)을 측정하여 조류제거율을 측정하였다.
- 블루민의 적조생물 제거율을 측정하기 위하여 500 m/ 용기에 C. polykrikoides 1, 800 cells-m/-1 밀도로 넣은 후 블루민(액체)을 50, 100 , 200, 400, 800, 1, 600, 3, 200배 희석되도록 원액을 첨가하였다. 일정 시간 간격으로 시료를 취하여 세포를 계수하였다.
- 8이었다. 블루민의 효과를 황토와 비교하기 위하여 황토에 의한 적조생물의 제거율을 측정하였다. 해수 1Z 에 대하여 10g 비율로 황토를 입자 크기별로 처리하였다.
- 블루민이 적조생물의 생장에 미치는 영향을 측정하기 위하여 블루민의 1,000배 희석 배양액(f/2배지 100 ml)에 C. gykriSkl%를 접종하고 생장을 관찰하였다. 블루민 원액의 500, 1,000, 2,000, 4, 000, 8, 000, 16, 000배 희석액과 대조구를 각각 준비하였다.
- 블루민, 제강슬래 그(slag), 황토 (yellow loess), 수처리제 (CaO, Ca(OH)2, Mg(OH)2, 응집제(PAC, polyacrylamide) 와 황산 gSQ)을 첨가한(블루 민과 황산은 500-5,000 mg-f1 농도, 다른 처리제는 1,000mg-r1) 후 180rpm 급속으로 5분, 40 rpm 완속으로 10분 동안 각각 교반하였다. 상등액을 시간대별로 채취하여 형광(TumerAU-10)을 측정하여 조류제거율을 측정하였다.
- 이것을 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 chloroform충과 수층을 분리시키고 chloroform층만 수거하였다. 시료의 건중량은 GF/C로 여과한 여과지를 70℃에서 3일간 건조시켜 측정하였다.
- polykrikoides 1, 800 cells-m/-1 밀도로 넣은 후 블루민(액체)을 50, 100 , 200, 400, 800, 1, 600, 3, 200배 희석되도록 원액을 첨가하였다. 일정 시간 간격으로 시료를 취하여 세포를 계수하였다.
- Heterosigma akashiwo, Pseudonitzschia pungens'), 담수 조류 Microcystis aeruginosa 1종, 먹이 생물 Isochrysis galbana로서 총 10종류였다. 적조생물과 I. galbats는 f/2배지 (Guillard and Ryther 1962), M. aeruginosae MA 배지 (Ichimura 1978) 에서 각각 배양하였고, 적조생물과 L galbana는 130-150 eanol - m-2 - s-1, M. aeruginosa는 200 μmol m-2 s-1 광조건에서 14L:10D 광주기로 배양하였으며 25 ± 2℃ 온도를 유지하였다.
- 2일 간격으로 적조생물의 세포를 계수하였다. 한편 Alexandrium catenella 등 7종적조생물의 생장에 대한블루민의 영향을 측정하기 위하여 블루민 L000배 희석액에서 각각 배 양하였다. 담수 조류 M.
- 해양적조생물과 담수조류는 micromanipulator (Narishige Co.) 와 capillary glass tube# 이용하여 조류의 단세포를 분리하여 배지에서 각각 35일과 7일 동안 배양하였다. 특히, M.
대상 데이터
- 정체기 초기에 시료를 수확하였다. I.galbana는 한국해양미세류은행 (KMCC) 에서 KMCCH-2 strain (source는 DE-5 starin) 을 분양받아 배양하였다. 먹이 생물 (Isochrysis galbana, Chaetoceros calcitrans, Monochrysis sp.
- , Nannochloropsis oculata, Phaeodactylum tricomutum)의 대량 배양은 국립수산진흥원 산하 남해수산배양장과 민간종묘장에서 먹이생물을 공급받았다. 남해배양장에서는 0.5톤 이하 수조에서는 Conway 배지를 사용하였으며 그 이상 배양수조에서는 농업용 비료를 사용하였다. 민간 종묘장에서 먹이생물의 배지는 전량 비료를 사용하였다.
- galbana는 한국해양미세류은행 (KMCC) 에서 KMCCH-2 strain (source는 DE-5 starin) 을 분양받아 배양하였다. 먹이 생물 (Isochrysis galbana, Chaetoceros calcitrans, Monochrysis sp., Nannochloropsis oculata, Phaeodactylum tricomutum)의 대량 배양은 국립수산진흥원 산하 남해수산배양장과 민간종묘장에서 먹이생물을 공급받았다. 남해배양장에서는 0.
- 5톤 이하 수조에서는 Conway 배지를 사용하였으며 그 이상 배양수조에서는 농업용 비료를 사용하였다. 민간 종묘장에서 먹이생물의 배지는 전량 비료를 사용하였다. 농업용 비료는 배양액톤당 요소 60g 복합비료 20g을 투여하였다.
- 블루민(Blue-Min) 은 카렌(KA-LEN) 이라는 제품으로 1996년 11월에 유해가스 흡착 처리액으로 특허를 받아 1997년 2월부터 생산하였다. 이를 가축에 보조사료로 사용할 수 있도록 개량하여 2차 특허품으로 등록하였고, 초기에는 주로축산 특히 양돈의 보조사료로 보급되었다.
- 실험에 사용된 해양적조생물은 Cochlodinium polykrikoides 외 7^ {Alexandrium catenella, Gymnodinium sanguineum, Gyrodinium impudicum, Prorocentrum minimum, Scrippsiella trochoidea. Heterosigma akashiwo, Pseudonitzschia pungens'), 담수 조류 Microcystis aeruginosa 1종, 먹이 생물 Isochrysis galbana로서 총 10종류였다.
이론/모형
- , Nannochloropsis oculata, Phaeodactylimi tricomutimi) 을 분석하였다. 총지질 (total fatty add, TFA) 정량은 Bligh and Dyer(1959) 방법에 따랐다. 배양한 시 료는 원심분리 (4℃, 2000 rpm, 10mM) 하여 조체 만모은 pellet 상태로 추출 전까지 액체질소에서 보관하였다.
성능/효과
- 따라서 블루민첨가 후pH를 조정했을 때 생장이 증가하였다. 4종 먹이생물의 지방산을 분석한 결과, 먹이 생물의 종류에 따라 지방산 조성이 크게 달랐으며 같은 종이라 하더 라도 지방산의 함량에 다소 차이가 있었다(Table 1). 불포화지방산(PUFA)의 함량이 가장 많은 먹이 생물은 Nannochloropsis oMata와 I.
- 2와 같다. 500배 희석액에서는 접종 2일 후 세포가 모두 사멸하였으며, 1,000배에서는 생장율이 0.21 이었고 최대 세포밀도는 대조구의 8%에 불과하였다. 그러나 2, 000배 희석액에서 최종 세포밀도는 대조구의 56%에 달하였으며, 8, 000배 이상 희석액에서는 대조구와 큰 차이가 발견되지 않았다.
- 1, 600배, 3, 200배 희석액에서는 블루민을 처리를하지 않은 대조구와 비슷하였다. 800배 희석 처리시 60분 후에 적조생물을 98% 이상 제거하였으나, 1, 600배 희석액 이상에서는 적조생물 제거 효율이 15% 이하였다.
- 3과 같다. Alexandrium catenella, Scrippsiella trochoides, Gyrodinium impudicum, Prorocentrum minimum 와편모조류 4종과 Pseudonitzschia pungens 규조는 블루민의 생장 억제 효과가 뚜렷하였고 생장 곡선이 유사하였다. 그러나 블루민 처리구에서와편모조류 종생장은 대조구와 비교하여 증가하였고, 라피도조류인 Heterosigmaakashiuxt는 배양 초기에는 억제되었으나 후기에는증가곡선을 그렸다.
- sanguineum도 배양 초기에 약간의 억제효과가 있어 두 종의 블루민에 대한 반응에 유사한 점이있었다. G. sanguineume- H. akashiwo는 억제율로 본 결과, 블루민 1,000배 희석액에서 A. catenella 등 5종의 생장은 블루민을 처리하지 않은 대조구와 비교하면 0.3Y.6% 에 불과했다. 그러나 G.
- Heterosigma akashiwo, Pseudonitzschia pungens'), 담수 조류 Microcystis aeruginosa 1종, 먹이 생물 Isochrysis galbana로서 총 10종류였다. 적조생물과 I.
- 방산은 감소하였다. I. galbana의 지방산을 분석한 결과 PUFA인 20:5n-3 eicosapentaenoic acid (EPA)는 검출되지 않았으며 , 22:6n-3 decosahexaenoic acid(DHA) 의 함량은 미량이었다. 결과적으로 부르민을 처리하였을 때 IWA의 함량은 대조구 24.
- gaZbaw였다. N. oculata의 PUFA 함량은 약 55%였고, I.galbaw는 35-38% 범위였다.
- pH를 조정한 10, 000배와 100, 000배 희석처리구에서는 각각 9%와 12%가 생장이 증가한 반면 500배 희석구에서는 52%, 1,000배에서는 31% 감소하었다. pH를 조정하지 않은 500배 및 1,000배 희석구에서는 Microcystis의 생장은 대조구 대비 각각 57% 및 35% 감소한 반면 10, 000배 및 100,000배 희석구에서는 각각 6%와 9% 증가하였다. pH 비조정구가 조정구보다 생장이 다소 감소하였으나 그 차이는 4-5% 범위로 미미하였다.
- 6으로 조정한실험구로 구별하여 측정하였다. pH를 조정한 10, 000배와 100, 000배 희석처리구에서는 각각 9%와 12%가 생장이 증가한 반면 500배 희석구에서는 52%, 1,000배에서는 31% 감소하었다. pH를 조정하지 않은 500배 및 1,000배 희석구에서는 Microcystis의 생장은 대조구 대비 각각 57% 및 35% 감소한 반면 10, 000배 및 100,000배 희석구에서는 각각 6%와 9% 증가하였다.
- galbana의 지방산을 분석한 결과 PUFA인 20:5n-3 eicosapentaenoic acid (EPA)는 검출되지 않았으며 , 22:6n-3 decosahexaenoic acid(DHA) 의 함량은 미량이었다. 결과적으로 부르민을 처리하였을 때 IWA의 함량은 대조구 24.6%에 대하여 3% 내의 차이를 보였고, 총 지질의 함량도 미처리구의 0.32%에 비하여 0.05% 내 오차로서 증가가 미미하였다. 그러나 C.
- Alexandrium catenella, Scrippsiella trochoides, Gyrodinium impudicum, Prorocentrum minimum 와편모조류 4종과 Pseudonitzschia pungens 규조는 블루민의 생장 억제 효과가 뚜렷하였고 생장 곡선이 유사하였다. 그러나 블루민 처리구에서와편모조류 종생장은 대조구와 비교하여 증가하였고, 라피도조류인 Heterosigmaakashiuxt는 배양 초기에는 억제되었으나 후기에는증가곡선을 그렸다. G.
- polykrikoides 등 해양적조 생물의 생장이 거의 정지되거나 억제된 전 항의 실험 결과와는 대조적이었다. 그러나 적조생물의 생장 억제에 있어서 다른 것과는 달리 G. sanguineum, H. 까sshiwo는 초기에 블루민에 대하여 생장 억제 효과가 있었으나 곧 회복하여 무처리구 보다 높은 농도를 유지한 결과로 볼 때 블루민이 미세조류의 생장에 미치는 농도는 종에 따라 다른 것으로 추정된다. 블루민을 저농도로 처리하였을 때 생장이 크게 억제되는가 하면 고농도 처리에서도 무처리구와 유사한 생장을 하는 경우가 있기 때문이다.
- 녹조 제거제를 처리하였을 때 담수의 pH를 보면 대조구는 8.9, 슬래그와 황토처리구에서는 각각 8.7-9.3 및 7.2-8.1 범위로서 대조구와 큰 차이가 없었으나 블루민 200, 1,000 및 2, 000배 희석액에서 pH는 각각 6.1, 6.9 및 8.3이었다. CaO 처 리하였을 때 pH 평균값이 11.
- 담수 녹조를 일으키는 Microcystis 남조류의 제거율을 측정한 결과 블루민 200 및 1,000배 희석액에서는 대조구와 비교하여 각각 87% 및 64% 감소하였다. 입자 크기 120㎛ 이 상황토 처리구에서 형광값은 대조구와 비교하여 도리어 증가하였으나 120㎛ 이하 입자 크기의 황토를 처리하였을 때 형광값은 대조구와 비슷하였다.
- 14로서 블루민 희석배율이 낮을수록 생장율이 다소 감소하였다. 대조구에 대한 1, 000배, 10, 000배, 100.000배 블루민 희석액에서 세포 농도의 비율은 각각 67%, 82%, 88%였다 (Fig.4). 블루민 처리 후무처리 대조구와 pH를 같게 조정하였을 때 처리구의 I.
- 먹이 생물 생장과 지방산에 미치는 영향블루 민 희석액에 Isochrysisgalbana 1.45-1.87 x 106cells-mf-1 을 접종하여 9일 동안 배양한 결과 최종 농도는 8.97-9.12 X lecellsml-1로서 초기 농도의 4.9-6.0배였다. 대조구, 블루민의 1,000배, 10, 000배, 100,000배 희석액에서 I.
- 5배 증가하였다 (한국과학재단 2001).본 실험 결과블루민은 C.polykrikoides 적 조생물의 생장을 억제하고 제거하는 효과가 있었을 뿐 아니라 이미 양돈과 농작물에 대한 항균성과 생장 촉진, 해양 저질 개선제로서 기능을 갖는 것으로밝혀져 그 적용 범위가 매우 넓은 처리제로 입증되었다.
- polykrikoides의 생장을 억제시키는 효과는 나타났다. 본 실험에서는 블루민의 희석 배율을 2배씩 증가시켜 처리하였는데 1,000배 이하 희석액에서는 적조생물 억제 효과가 현저했으나, 2,000배 희석액에서는 그 효과가 1,000배와 비교하였을 때 크게 감소하였다.
- 4). 블루민 처리 후무처리 대조구와 pH를 같게 조정하였을 때 처리구의 I. galbana 세포농도는 대조구의 95%, 102%, 108%였다. 따라서 블루민첨가 후pH를 조정했을 때 생장이 증가하였다.
- 그러나 블루민의 수질개선 및 항균성의 기능을 고려하면 저농도로 천해 양식장에 직접 투입하거나 pellet 사료 첨가제등으로 사용함으로서 간접적이고 장기적인 효과를 기대할수 있다. 블루민 처리시 담수 조류 M. aerngitiosii와 먹이생물 I. galabana의 생장 억제 효과는 해양 적조생물 보다는 낮았고, I. galabana의 PUFA 증가 효과가 관찰되었다. 블루민은 양돈과농작물 뿐 아니라 해양 적조생물의 억제 등 해양환경 개선에도 일정한 효과를 가지는 것으로 나타나 광역처리제로서 기능이 입증되었다.
- 5mm 이상 황토 입자의 적조제거 효과는 50% 이하였으나 120/an 이하 입자에서는 78%까지 제거되었다. 블루민과 황토의 효과를 단순 비교하면 블루민이 황토보다 적조 제거 효과가 매우 신속하게 나타났고 그 효율도 높았다.
- galabana의 PUFA 증가 효과가 관찰되었다. 블루민은 양돈과농작물 뿐 아니라 해양 적조생물의 억제 등 해양환경 개선에도 일정한 효과를 가지는 것으로 나타나 광역처리제로서 기능이 입증되었다.
- 블루민의 적조생물 제거 및 생장 억제 효능을 검정한 결과, 블루민 1,000배희석액에서 C.polykrikoides 등 해양 적조원인생물 8종의 생장은 무처리구와 비교하여 10% 이하로 억제되었으며 적조생물을 응집제거하는 효율은 황토보다 높았다. 그러나 블루민의 수질개선 및 항균성의 기능을 고려하면 저농도로 천해 양식장에 직접 투입하거나 pellet 사료 첨가제등으로 사용함으로서 간접적이고 장기적인 효과를 기대할수 있다.
- 적조 퇴치제로 블루민을 직접 살포하는 방식도 유효하지만 양식장의 사료 보조제로 사용함으로서 양식장 내 적조 발생을 억제하고 양식 생물의 생산 증가를 가져올 수 있다. 비상시 에는 축양장이나 양식장에 100-500배 블루민 희석액을 투여함으로서 적조 피해를 줄일 수 있고 어류의 스트레스를 방지할 수 있었다. 그동안 블루민은 가두리 어류 양식장과 대하 새우양식 장에 적용하여 좋은 성 적 을 거 두었으며(한국과학재단 2001), 최근 새우 양식장에 사료 보조제로 보급이 확대되고 있으며 현장에서 좋은 성과를 거두고 있다.
- 이상의 결과를 종합하면 블루민은 적조생물을 제거하고 생장을 억제하는 기능이 우수하였다. 그러나 해양 적조생물에 대 한 블루민의 반응은 생장을 억제시키는 양성이었으나 생물의 종류에 따라 음성 반응이 나타나기도 하였다.
- 이상의 실험 결과로 볼 때 블루민을 고농도로 처리하였을때 먹이 생물 L galbana의 생장이 억제되지 않았으며 pH를 조정하였을 경우 도리어 생장이 향상되었다. 이런 결과는 적조생물에 블루민을 처리하였을 때 결과와는 대조적이었다.
- 블루민이 입자와 결합하여 침전시키는 응집력이 강하고 pH를 크게 떨어뜨림으로써 적조생물을효과적으로 제거시키는 것으로 추정된다. 특히 블루민을 처리하였을 때 블루민 동일 농도에서 담수보다도 해수의 pH가더 낮은 특이 현상이 나타났다. 블루민은 강한 산성물질로서 mineral이 주성분이나 일부 식물 추출 유기산을 함유하고 있다.
- 해양적 조생물에 블루민을 처리한 결과 500-1,000배 희석액에서 적조생물을 직접 제거하는 효과가 높았고, 적조생물의 생장도 억제시켰다. 블루민이 입자와 결합하여 침전시키는 응집력이 강하고 pH를 크게 떨어뜨림으로써 적조생물을효과적으로 제거시키는 것으로 추정된다.
- 대하 양식장에서 사료 톤당 블루민 31를 투여하고 수질개선제로서는 5-10 ppm 농도로 살포할 것을 권장하고 있다. 현장 투여 결과로 볼 때, 블루민 물질 자체의 금속 양이온과 응집력(coagulation), pH, 항균성 (antibacterial activity)이 복합적으로 작용하여 궁극적으로 수질 개선 효과를 가져오는 것으로주정된다. 대하 양식은 수질환경관리가 매우 중요하고 특히양식장의 자가 오염이 가장 심각한 문제이다(해양수산부 2000).
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