재래산양의 체내 및 체외유래 난자의 활성화 처리방법 및 배양조건이 단위발생란의 체외발달에 미치는 영향 Effects of Activation Treatments and Culture Condition on In Vitro Development of Caprine In Vivo and In Vitro Oocytes원문보기
본 연구는 동물복제 및 형질전환 동물생산 등의 연구에 기초자료를 제공하고자 재래산양의 oocyte를 단위발생을 유도하여 회수난자의 조건, 활성화방법, 배양조건 등이 단위발생란의 체외발달율에 미치는 영향을 조사하여 재래산 양의 최적의 배양조건을 확립하고자 실시하였다. 난자의 회수는 체중 15～25 Kg 전 ㆍ 후의 성숙한 미경산 재래산양에 FSH와 PMSG 를 사용하여 과배란을 유기하여 hCG 투여 후 제 35시간째에 외과적인 방법으로 in vivo (체내성숙) 난자는 난관을 관류하는 방법으로 회수하였고, in vitro (체외성숙) 난자는 난포로부터 흡입하여 난포란을 채취하여 약 22시간 체외성숙을 실시하였다. 활성화 처리는 전기자극법과 Ionomycin + 6-DMAP를 처리하여 단위발생을 유도하였다. 복제수정란의 배양은 M16, TCM-199 및 mSOF 배양액으로 6～7일 동안 체외배양을 실시하였다. 활성화를 유도하기 위하여 전기자극 및 ionomycin + 6-DMAP 처리를 하였을 때 분할율은 각각 64.1 및 76.5%로서 이들간에 차이는 없었다. 배반포기로의 발달율은 전기자극방법으로는 전혀 발달이 이루어지지 않았으나, ionomycin +6-DMAP 처리방법에서는 15.6%가 배반포로 발달하였다. In vivo 난자와 in vitro 난자를 활성화를 유도하였을 때 분할율은 86.8 및 69.0%로서 이들간에 유의적인 차이는 없었다. 4-세포기(93.9% vs 66.1%), 8-세포기(90.9% vs 37.0%) 및 상실배기(89.4% vs 23.6%)는 이들간에 유의적(P<0.05)인 차이가 있었으며, 배반포기로의 발달율은 체내성숙난자가 50.0%로서 체외성숙난자의 0.8%보다는 유의적으로 높았다. 활성화를 유도한 난자를 mSOF 배양액으로 체외배양을 실시하였을 때 분할율은 81.0%로서 TCM-199 +oviduct cell 의 64.3% 및 Ml6 배양액의 51.6%보다는 높게 나타났다. 배반포기로의 발달율은 mSOF 배양액에서는 3.4%가 발달하였으나, TCM-199+ oviduct cell 배양액과 M16 배양액에서는 전혀 발달이 이루어지지 않았다. 이상의 결과는 포유동물 난자의 단위발생의 유도 및 체외배양시 난자의 공급원, 난자의 활성화 방법 및 배양조건 등이 차후 단위발생란의 체외발생율에 크게 영향을 미칠 수 있는 근거를 제시해 준다.
본 연구는 동물복제 및 형질전환 동물생산 등의 연구에 기초자료를 제공하고자 재래산양의 oocyte를 단위발생을 유도하여 회수난자의 조건, 활성화방법, 배양조건 등이 단위발생란의 체외발달율에 미치는 영향을 조사하여 재래산 양의 최적의 배양조건을 확립하고자 실시하였다. 난자의 회수는 체중 15～25 Kg 전 ㆍ 후의 성숙한 미경산 재래산양에 FSH와 PMSG 를 사용하여 과배란을 유기하여 hCG 투여 후 제 35시간째에 외과적인 방법으로 in vivo (체내성숙) 난자는 난관을 관류하는 방법으로 회수하였고, in vitro (체외성숙) 난자는 난포로부터 흡입하여 난포란을 채취하여 약 22시간 체외성숙을 실시하였다. 활성화 처리는 전기자극법과 Ionomycin + 6-DMAP를 처리하여 단위발생을 유도하였다. 복제수정란의 배양은 M16, TCM-199 및 mSOF 배양액으로 6～7일 동안 체외배양을 실시하였다. 활성화를 유도하기 위하여 전기자극 및 ionomycin + 6-DMAP 처리를 하였을 때 분할율은 각각 64.1 및 76.5%로서 이들간에 차이는 없었다. 배반포기로의 발달율은 전기자극방법으로는 전혀 발달이 이루어지지 않았으나, ionomycin +6-DMAP 처리방법에서는 15.6%가 배반포로 발달하였다. In vivo 난자와 in vitro 난자를 활성화를 유도하였을 때 분할율은 86.8 및 69.0%로서 이들간에 유의적인 차이는 없었다. 4-세포기(93.9% vs 66.1%), 8-세포기(90.9% vs 37.0%) 및 상실배기(89.4% vs 23.6%)는 이들간에 유의적(P<0.05)인 차이가 있었으며, 배반포기로의 발달율은 체내성숙난자가 50.0%로서 체외성숙난자의 0.8%보다는 유의적으로 높았다. 활성화를 유도한 난자를 mSOF 배양액으로 체외배양을 실시하였을 때 분할율은 81.0%로서 TCM-199 +oviduct cell 의 64.3% 및 Ml6 배양액의 51.6%보다는 높게 나타났다. 배반포기로의 발달율은 mSOF 배양액에서는 3.4%가 발달하였으나, TCM-199+ oviduct cell 배양액과 M16 배양액에서는 전혀 발달이 이루어지지 않았다. 이상의 결과는 포유동물 난자의 단위발생의 유도 및 체외배양시 난자의 공급원, 난자의 활성화 방법 및 배양조건 등이 차후 단위발생란의 체외발생율에 크게 영향을 미칠 수 있는 근거를 제시해 준다.
This study was conducted to examine whether activation treatments, source of oocytes and culture conditions affect in vitro developmental ability of caprine oocytes. Mature Korean native goats were pretreated with intravaginal CIDR for 10 days. The goats were then treated with a single intramuscular...
This study was conducted to examine whether activation treatments, source of oocytes and culture conditions affect in vitro developmental ability of caprine oocytes. Mature Korean native goats were pretreated with intravaginal CIDR for 10 days. The goats were then treated with a single intramuscular injection of 1,000 IU PMSG on Day 8 or twice daily injection of a total of 70 mg FSH for 3 days from Day 8 of CIDR insertion for superovulation. All the goats were injected with 10 mg PGF/sub 2a/ on Day 8 and 400 IU hCG on Day 10 of CIDR. Oocytes were surgically collected by oviduct flushing(in vivo maturation) or direct follicle aspiration(in vitro maturation) through mid-ventral incision at 35 h after hCG injection. Fifteen to twenty oocytes were placed in TCM-199 medium containing 25 mM Hepes and hormones under mineral oil at 39℃ in a humudified atmosphere of 5% CO₂ in air for 22 to 24 h. After maturation, the oocytes were activated by electric stimulation or ionomycin + 6-DMAP. The activated oocytes were then cultured in M16, TCM-199 and mSOF media supplemented with proteins at 39℃ for 6 to 7 days. Activation treatments did not affect cleavage of the oocytes. The cleavage rates were 64.1% (41/64) in oocytes activated by electric stimulation and 76.5% (218/285) in oocytes activated by ionomycin + 6-DMAP. The proportion of development to blastocyst was 15.6% (34/218) in oocytes activated by ionomycin + 6-DMAP, but activation by electric stimulation did not support embryos developed beyond morula stage. There were no differences in the cleavage rates of activated oocytes experiencing in vivo (86.8%, 66/76) and in vitro maturation (69.0%, 127/184). However, the development rate to blastocyst stage was significantly (P<0.05) higher for oocytes matured in vivo (50.0%, 33/66) compared to in vitro (0.8%, 1/127). Culture conditions did not affect the cleavage of -activated oocytes. The cleavage rates were 51.6% (49/95) in M16, 64.3% (18/28) in TCM-199 and 81.0% (145/179) in mSOF, respectively. By contrast, the development rate of activated oocytes to stage was greater (P<0.05) for oocytes cultured in mSOF medium (23.4%, 34/145) than in M16 or TCM-199 (0.0%). Our results suggest that source of oocytes and culture conditions are major factors affecting in vitro development of caprine parthenogenetic oocytes.
This study was conducted to examine whether activation treatments, source of oocytes and culture conditions affect in vitro developmental ability of caprine oocytes. Mature Korean native goats were pretreated with intravaginal CIDR for 10 days. The goats were then treated with a single intramuscular injection of 1,000 IU PMSG on Day 8 or twice daily injection of a total of 70 mg FSH for 3 days from Day 8 of CIDR insertion for superovulation. All the goats were injected with 10 mg PGF/sub 2a/ on Day 8 and 400 IU hCG on Day 10 of CIDR. Oocytes were surgically collected by oviduct flushing(in vivo maturation) or direct follicle aspiration(in vitro maturation) through mid-ventral incision at 35 h after hCG injection. Fifteen to twenty oocytes were placed in TCM-199 medium containing 25 mM Hepes and hormones under mineral oil at 39℃ in a humudified atmosphere of 5% CO₂ in air for 22 to 24 h. After maturation, the oocytes were activated by electric stimulation or ionomycin + 6-DMAP. The activated oocytes were then cultured in M16, TCM-199 and mSOF media supplemented with proteins at 39℃ for 6 to 7 days. Activation treatments did not affect cleavage of the oocytes. The cleavage rates were 64.1% (41/64) in oocytes activated by electric stimulation and 76.5% (218/285) in oocytes activated by ionomycin + 6-DMAP. The proportion of development to blastocyst was 15.6% (34/218) in oocytes activated by ionomycin + 6-DMAP, but activation by electric stimulation did not support embryos developed beyond morula stage. There were no differences in the cleavage rates of activated oocytes experiencing in vivo (86.8%, 66/76) and in vitro maturation (69.0%, 127/184). However, the development rate to blastocyst stage was significantly (P<0.05) higher for oocytes matured in vivo (50.0%, 33/66) compared to in vitro (0.8%, 1/127). Culture conditions did not affect the cleavage of -activated oocytes. The cleavage rates were 51.6% (49/95) in M16, 64.3% (18/28) in TCM-199 and 81.0% (145/179) in mSOF, respectively. By contrast, the development rate of activated oocytes to stage was greater (P<0.05) for oocytes cultured in mSOF medium (23.4%, 34/145) than in M16 or TCM-199 (0.0%). Our results suggest that source of oocytes and culture conditions are major factors affecting in vitro development of caprine parthenogenetic oocytes.
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문제 정의
본 연구는 동물복제 및 형질전환동물 생산 등의 연구에 기초자료를 제공하고자 재래산양의 난자에 단위발생을 유도하여 회수난자의 조건, 활성화 방법, 배양조건 등이 단위발생란의 체외발달율에 미치는 영향을 조사하여 최적의 배양조건을 확립하고자 실시하였다.
제안 방법
3 M MannitoI(Sigma) 용액을 사용하였다. Oocyte를 chamber로 옮겨 양 전극 사이에 일렬로 주입하여 직류전류(DC)로 1.30~2.46 kv/cm, 15~30 usee, 1 또는 2회 통전하여 세포융합을 유도하였다. 통전 후 핵이식란은 10% GS가 첨가된 M16 배양액으로 배양을 실시하였다.
3 g, Eazi Breed, InterAg, New Zealand)를 10 일간 질내에 삽입하고 과배란 처리는 FSH(FolItropin-V, Ve- trepharm, Canada)를 CIDR 삽입 8, 9, 10일째에 12시간 간격으로 70 mg을 감량법으로 투여하였으며, PMSG(Folli- gon, Intervet, Netherlands 경우는 1,000 IU를 CIDR 삽입 제 8일째에 1회 투여하였다. PGF2a(Lutalyse, Upjohn, U.S.A.)는 8일째에 FSH 또는 PMSG와 함께 10 mg 투여하고 CIDR 제거는 10일째에 제거와 동시에 hCG (Chorulon, Intervet, Netherland) 400 IU를 투여하여 과배란을 유도하였다.
난관으로부터 체내 성숙 난자는 외과적으로 난관을 관류하는 방법으로 회수하였다. 먼저 과배란 처리한 산양을약 24시간 절식시킨 다음 2% xylazine(Rompun, Bayer, Korea)을 체중 kg당 0.
난자의 회수를 위하여 과배란유기를 실시하였으며, 먼저 발정 동기화를 위하여 progestagen 제제인 CIDR(Proges- terone 0.3 g, Eazi Breed, InterAg, New Zealand)를 10 일간 질내에 삽입하고 과배란 처리는 FSH(FolItropin-V, Ve- trepharm, Canada)를 CIDR 삽입 8, 9, 10일째에 12시간 간격으로 70 mg을 감량법으로 투여하였으며, PMSG(Folli- gon, Intervet, Netherlands 경우는 1,000 IU를 CIDR 삽입 제 8일째에 1회 투여하였다. PGF2a(Lutalyse, Upjohn, U.
2 mg씩 근육주사하여 진정마취시키고, HC1 ketamine(Ketamine, Yuhan, Korea) 을 체중 kg 당 llmg씩 근육주사하여 마취를 유도하였다. 마취가 도입된산양은 복정중선을 절개하여 난관과 난소를 체외로 노출시킨 다음 배란점을 확인한 후 난자의 회수를 위하여 ca- theter(Tom Cat, KendaU Co., U.S.A.)를 난관누두부로 삽입하여 5~10 ml의 M2(Sigma Co.z U.S.A.) 배양액을 난관자궁접합부 쪽에서 주입하여 관류하였다. 체외성숙용 난자의 회수는 성숙난자를 회수한 다음 난소의 난포로 부터 22G needle 이 부착된 5 ml 주사기로 난포액과 난포란을흡입하여 회수하였다.
방법으로 회수하였다. 먼저 과배란 처리한 산양을약 24시간 절식시킨 다음 2% xylazine(Rompun, Bayer, Korea)을 체중 kg당 0.2 mg씩 근육주사하여 진정마취시키고, HC1 ketamine(Ketamine, Yuhan, Korea) 을 체중 kg 당 llmg씩 근육주사하여 마취를 유도하였다. 마취가 도입된산양은 복정중선을 절개하여 난관과 난소를 체외로 노출시킨 다음 배란점을 확인한 후 난자의 회수를 위하여 ca- theter(Tom Cat, KendaU Co.
통전 후 핵이식란은 10% GS가 첨가된 M16 배양액으로 배양을 실시하였다. 약물처리법은 5 pM의 ionomycin 용액에서 5분, 2 mM 6-DMAP 용액에서 4시간 동안 처리하여 활성화를 유도하였다.
46 kv/cm, 15~30 usee, 1 또는 2회 통전하여 세포융합을 유도하였다. 통전 후 핵이식란은 10% GS가 첨가된 M16 배양액으로 배양을 실시하였다. 약물처리법은 5 pM의 ionomycin 용액에서 5분, 2 mM 6-DMAP 용액에서 4시간 동안 처리하여 활성화를 유도하였다.
회수한 난포란의 체외성숙은 25 mM의 Hepes가 첨가된 TCM-199 체외성숙용 기본배양액에 10% GS, 10 ug/ml, LH(luteinzing hormone), 1 //g/ml estradiol 17-0 및 5 ug/ml FSH(follicular stimulating hormone)을 첨가하여 5% CQz 98-99% 습도, 39℃ 배양기 내에서 약 12시간 정도 전 배양을 시킨 다음 4 well-dish(NUNC, Denmark) 에 well 당 15~20개의 미성숙 난포란을 주입하여 22~24시간 동안 배양함으로써 체외성숙을 유도하였다.
대상 데이터
Oocyte의 전기자극에 의한 활성화 처리는 전기세포융합장치(BTX, U.S.A)로 실시하였으며, 배지는 0.05 mM CaCl2 (Sigma, U.S.A), 0.1 mM MgSO4(Sigma) 및 0.5 mM Hepes (Sigma)가 첨가된 0.3 M MannitoI(Sigma) 용액을 사용하였다. Oocyte를 chamber로 옮겨 양 전극 사이에 일렬로 주입하여 직류전류(DC)로 1.
공시동물은 체중 15~25 Kg 전후의 성숙한 미경산 재래산양으로서 진주 근교의 사육농가로부터 임상적으로 건강하다고 인정되는 것을 구입하여 인근의 임대농장에서 사육하면서 내. 외부 기생충구제와 일정기간 동안 적응시킨 다음 본 연구에 사용하였다.
데이터처리
실험결과의 통계학적 분석은 SAS package를 이용하여 실시하였으며, GLM(General Linear Model) procedure 를적용하여 각 요인의 least square mean 을 구하여 요인 간의 유의차를 검정하였다.
성능/효과
6%보다는 높았다. 4-세포기 및 8-세포기로의 체외발달율도 mSOF 배양액 94.5 및 80.7%로서 유의적으로 높게 나타났다. 상실배기로의 발달율은 mSOF 배양액에서는 69.
0%로서 이들간에 유의적인 차이는 없었다. 4-세포기(93.9% vs 66.1%), 8-세포기(90.9% vs 37.0%) 및 상실배기(89.4% vs 23.6%)는 이들간에 유의적(P<0.05) 인 차이가 있었으며, 배반포기로의 발달율은 체내성숙난자가 50.0%로서 체외성숙난자의 0.8%보다는 유의적으로 높았다.
5%로서 이들간에 유의적인 차이는 없었다. 4.세포기로의 발달율은 43.9 및 67.0%로서 ionomycin + 6-DMAP 처리 방법 이높았으며, 8-세포기(39.0% vs 49.1%), 상실배기(31.7% vs 41.0%)로의 발달율도 차이가 없었다. 그러나 배반포기로의발달율은 전기자극방법으로는 전혀 발달이 이루어지지 않았으나, ionomycin + 6-DMAP 처리방법에서는 15.
In vivo 난자와 in vitro 난자를 활성화를 유도하였을 때분할율은 86.8 및 69.0%로서 이들간에 유의적인 차이는 없었다. 4-세포기(93.
9%)보다 높다고 보고하였다. 본 연구결과 다른 동물에서와는 달리 재래산양의 경우는 전기자극에 의한 단위발생란의 경우 비정상적인 분할이 많았으며, 체외 배양시간이 길어 질수록 fragmentation 이 많았다. 전기 세기를 1.
활성화를 유도한 난자를 mSOF 배양액으로 체외배양을 실시하였을 때 분할율은 81.0%로서 TCM-199 + oviduct cell의 64.3% 및 M16 배양액의 51.6%보다는 높았다. 4-세포기 및 8-세포기로의 체외발달율도 mSOF 배양액 94.
후속연구
0 kv/cm 이하에서는 할구의 분할 자체가 명확하지가 않았다. 따라서 재래산양의 단위발생에 관한 연구는 좀더 세밀히 분석과 검토가 이루어져야 할 것으로 생각된다.
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