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문제 정의
- 하지만 경구면역관용 유도가4주 이상 지속되는 만성천식모델에서도 알레르기 염증반응을 효과적으로 억제할 수 있는 지에 대해서는 아직 불확실하다. 본 연구에서는 8주 동안 지속되는 만성 천식 모델을 이용하여 경구면역관용 유도가 알레르기 염증반응 및 기도 재형성에 어떤 영향을 미치는 지를 관찰하였다.
- 본 연구에서는 BALB/c 마우스를 이용하여 사람과 유사하게 기도재형성을 일으키는 만성기관지천식 모델을 만들어, 경구면역관용이 급성 염증 및 기도 과민반응뿐만 아니라 만성 염증에도 억제 효과가 있는지, 또는 경구면역관용이 만성에서 보이는 기도 재형성을 억제하는지 알아보고, 이러한 효과가 저용량, 고용량에 따라 차이가 있는 지, 저용량과 고용량의 기전에 차이가 있는 지 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 기도과민성은 농도별 메타콜린 흡입에 따른 enhanced pause (penh) 값의 변화로 평가하였으며, 기관지폐포세척액 내의 염증세포수를 측정하고 IL-13, IFN-v 농도 및 혈청 내 OVA 특이 IgE, IgGl, IgG2a 농도를 ELISA로 측정하였다. 기도재형성 정도는 폐조직의 PAS 및 Masson's trichrome 염색으로 관찰하였다.
- 저용량 경구면역관용군은 Img의 OVA(grade V; sigma, St. Louis, MO) 을 phosphate buffered saline (PBS)에 녹여 경구삽관용 튜브를 이용하여 6일 동안 매일 먹이고, 고용량 경구면역관용군은 25mg의 OVA 을 1회 먹였다. 천식군은 항원대신 동량의 PBS를 경구 투여하였다.
- Louis, MO) 을 phosphate buffered saline (PBS)에 녹여 경구삽관용 튜브를 이용하여 6일 동안 매일 먹이고, 고용량 경구면역관용군은 25mg의 OVA 을 1회 먹였다. 천식군은 항원대신 동량의 PBS를 경구 투여하였다. 5일 후에 OVA lOQtzg과 aluminum hydroxide (Aldrich, Milwaukee, WI) 500/zg을 섞어 2 주 간격으로 2회 복강 내 투여하여 감작한 후 6주동안 1% OVA를 30분간 네블라이 져 (macjinmedical, Kore) 로 흡입시키는데 5주는 주 2회, 마지막 주에는 3일 동안 연속으로 흡입시켜 기관지천식을 유발하였다(그림 1).
- 천식군은 항원대신 동량의 PBS를 경구 투여하였다. 5일 후에 OVA lOQtzg과 aluminum hydroxide (Aldrich, Milwaukee, WI) 500/zg을 섞어 2 주 간격으로 2회 복강 내 투여하여 감작한 후 6주동안 1% OVA를 30분간 네블라이 져 (macjinmedical, Kore) 로 흡입시키는데 5주는 주 2회, 마지막 주에는 3일 동안 연속으로 흡입시켜 기관지천식을 유발하였다(그림 1).
- Five days later the animals were sensitized with 100 μg of OVA and 500 μg of Aluminum hydroxide two times on day 0 and day 14. After sensitization the animals were challenged by nebulization of aerosolized 1% OVA twice a week during the next 5 weeks and then for 3 consecutive days before Penh measurement in the last week. OVA: ovalbumin, Alum: Aluminum hydroxide, Penh: enhanced pause, Sac: sacrificed.
- 각 군별로 감작시키고 흡입유발 후 급성천식모델인 4주 때와 도살직전 만성천식모델인 8주 때 마지막 네블라이져 흡입 24시간 후 기도저항 측정기(Allme- dicus, An Yang, Korea)를 이용해 기도과민성을 측정하였다. 기도과민성은 0, 12.
- 기도과민성은 0, 12.5, 25, 50, 100 mg/mℓ의 메타콜린(sigma)을 각 농도별로 3i戒씩 Ultra-Neb 초음파 연무기 (3650p, DeVilbiss, Pennsylvania, PA)를 이용하여 에어로졸로 3분간 흡입 후 3분 동안의 enhanced pause(Penh) 값을 구하여 측정하였다. 이 때 Penhe 기도저항을 나타내는 지표로서 구하는 공식은 다음과 같다.
- 개흉하였다. 좌측 주기관지는 실로 묶고 22게이지 주사바늘을 기관에 삽입하고 우측 폐에서 기관지폐포세척을 시행하였는데 1회에 0.4 禍의 PBS를 3회 주입하여 수거하였으며, 수거율은 90%이상이었다 수거된 기관지폐포세척액을 4℃, 2000rpm에서 7분간 원심분리하고, 상층액은 -70℃에 보관하였다 세포침전물은 혈구계 선반을 이용하여 총세포수를 세고, bio*5개/叫가 되도록 만든 후 50以를 따서 700 rpm에서 5분간 원심분리 (Cytospin 3, Shandon, Runcorn, UK)하여 슬라이드를 만들었다. Diff-Quik(국제시약, Japan)으로 염색하고 40배 시야에서 500개의 세포를 세어 세포백분율을 계산하였다.
- 4 禍의 PBS를 3회 주입하여 수거하였으며, 수거율은 90%이상이었다 수거된 기관지폐포세척액을 4℃, 2000rpm에서 7분간 원심분리하고, 상층액은 -70℃에 보관하였다 세포침전물은 혈구계 선반을 이용하여 총세포수를 세고, bio*5개/叫가 되도록 만든 후 50以를 따서 700 rpm에서 5분간 원심분리 (Cytospin 3, Shandon, Runcorn, UK)하여 슬라이드를 만들었다. Diff-Quik(국제시약, Japan)으로 염색하고 40배 시야에서 500개의 세포를 세어 세포백분율을 계산하였다.
- 기관지 폐포세척 액의 상층액에서 Th2 시토카인인 L-13과 Thl 시토카인인 IFN-Y을 각각에 대한 ELISA kit (R&D system, MN, U.S.A)를 이용하여 측정하였다. 이 검사의 감수성은 각각 4, 2 pg/mℓ이였다.
- 먼저 OVA의 농도를 100 您/ml로 희석하여 96-well plate에 각 well 당 100 成씩 분주하였으며 이에 결합하는 각각의 특이 항체를 측정하고, 이때 표준 시료의 농도를 100 arbitrary unit(A.U.)로 가정하고 단계별로 희석하여 표준농도곡선을 얻은 다음 상대적인 단위 (A.U.)를 구하였다.
- 기관지 상피세포에서 술잔세포는 periodic acid-Schiff (PAS) 염색으로 확인하였으며, 그 정도는 전체 기관지상피세포 중에서 PAS에 염색되는 세포의 비율에 따라서 5단계로 점수를 부여하여 측정하였다. 즉 PAS 양성 세포가 하나도 없는 경우는 0점, 25% 미만이 양성인 경우는 1점, 25-50% 미만이 양성인 경우는 2점, 50-75% 미만이 양성인 경우는 3점, 75-100% 미만이 양성인 경우 또는 점액에 의해 기관지가 막힌 경우는 4점으로 하였다9
- 기관지하부의 섬유화 정도는 Masson's trichrome 염색으로 측정하였으며 기저막하부에 섬유화로 염색되는 부위의 면적을 측정하였다i°;
- 5주된 암컷 BALB/c 마우스에 ovalbumin(OVA)을 복강 내로 투여하여 감작시킨 후 6주 동안 주 2회 OVA 를 반복 흡입시킴으로써 만성천식모델을 만들었다. 경구면역관용은 감작시키기 전에 OVA를 경구 투여함으로써 유도하였으며, 저용량 군(OVA 1 mg/dayx6 일)과 고용량 군(OVA 25 mg政dayxl일)으로 나누었다.
- 만들었다. 경구면역관용은 감작시키기 전에 OVA를 경구 투여함으로써 유도하였으며, 저용량 군(OVA 1 mg/dayx6 일)과 고용량 군(OVA 25 mg政dayxl일)으로 나누었다. 기도과민성은 농도별 메타콜린 흡입에 따른 enhanced pause (penh) 값의 변화로 평가하였으며, 기관지폐포세척액 내의 염증세포수를 측정하고 IL-13, IFN-v 농도 및 혈청 내 OVA 특이 IgE, IgGl, IgG2a 농도를 ELISA로 측정하였다.
- 경구면역관용은 감작시키기 전에 OVA를 경구 투여함으로써 유도하였으며, 저용량 군(OVA 1 mg/dayx6 일)과 고용량 군(OVA 25 mg政dayxl일)으로 나누었다. 기도과민성은 농도별 메타콜린 흡입에 따른 enhanced pause (penh) 값의 변화로 평가하였으며, 기관지폐포세척액 내의 염증세포수를 측정하고 IL-13, IFN-v 농도 및 혈청 내 OVA 특이 IgE, IgGl, IgG2a 농도를 ELISA로 측정하였다. 기도재형성 정도는 폐조직의 PAS 및 Masson's trichrome 염색으로 관찰하였다.
대상 데이터
- 5주된 암컷 BALB/c 마우스(Samta我0 bio, Korea) 를 사용하였다. 실험동물은 천식유발을 하지 않은 음성대조군, Ovalbumin(OVA)으로 감작시킨 후 천식 유발을 시킨 양성대조군(천식군), 저용량 경구 면역관용군, 고용량 경구면역관용군으로 나누었으며 각 군당 12마리의 마우스를 사용하였다.
- 사용하였다. 실험동물은 천식유발을 하지 않은 음성대조군, Ovalbumin(OVA)으로 감작시킨 후 천식 유발을 시킨 양성대조군(천식군), 저용량 경구 면역관용군, 고용량 경구면역관용군으로 나누었으며 각 군당 12마리의 마우스를 사용하였다.
데이터처리
- 모든 기관지는 기저막둘레의 길이를 기준으로 크기가 유사하고 비교적 원형모양을 띄는 3개를 정해 평균값을 계산하였으며 모든 측정은 computerized image analyzer 프로그램(BX50, Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하였다.
- 모든 측정값은 평균士표준오차로 표시하였으며, 각 군 간의 통계적 검정은 Wndows용 SPSS 통계 프로그램 (version 10.0)을 이용하여 independent sample T-test로 검정하였고 P 값이 0.05이하인 경우를 통계적 유의성이 있는 것으로 보았다.
이론/모형
- 각 군에서 채취한 혈청으로 OVA 특이 IgE (BD biosciences, San Diego, CA), IgGl (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), IgG2a (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 항체반응정도를 ELISA방법을 이용하여 측정하였다.
성능/효과
- OVA로 감작 후 4주째와 8주째에 측정한 Penh 값은메타콜린 농도에 상관없이 두 경구면역관용군에서 천식 군보다 유의하게 감소되었으며(PC0.01), 이러한 차이는 4주째가 8주째에 비해, 저농도의 메타콜린보다는 고농도의 메타콜린을 흡입시켰을 때 더욱 뚜렷한 차이를 보여주었다(그림 2A, 2B). 두 경구면역관용군간의 차이는 보이지 않았으며, 음성대조군과도 차이가 없었다.
- 기관지폐포세척액내 염증세포를 현미경으로 관찰해 보았을 때 천식군에서 염증세포가 많이 관찰되는 것에 비해 두 경구면역관용군에서는 현저하게 감소하는 것을 볼 수 있었다(그림 3). 기관지폐포세척액내세포수(×104/mℓ)는 총세포수의 경우 천식군(124.
- 01). 호중구수는 저용량 경구면역 관용 군(0.77±0.37)에서는 천식군 (15.01±6.92) 과 통계적인 차이는 보이지 않았으나 현저하게 감소하는 경향을 보였으며 고용량 경구면역관용군(0.43±0.13)은 천식군에 비해 유의하게 감소되었다(P<0.05, 그림 4).
- 3. 기관지폐포세척액내에서 IL-13과 IFN-v 측정기관지폐포세척액내의 IL-13 농도(pg/禍)는 천식군 (8.8±1.0)에 비해 저용량 경구면역관용군, 고용량 경구 면역관용군(2.13±0.34, 1.86±0.44)이 유의하게 감소하였다(RQ01, 그림 5A). IFN-v 농도(pg/砒)도 천식군 (5.
- 음성대조군에서는 술잔세포가 관찰되지 않았으며, PAS 염색에서의 술잔세포 과다형성 점수는 천식 군에 비해 저용량 및 고용량 경구면역관용군에서 유의하게 낮았다(3.63±0.14, 0.45+0.12, 1.00±0.19, P<0.01, 그림 8A, 8B).
- 기저막하부의 섬유화 면적(㎛2)은 음성대조군(9, 686±460), 저용량 경구면역관용군(17, 470±1, 796), 고용량 경구면 역 관용군(16, 476±1, 325), 천식군(39, 046±3, 534) 으로 천식군에 비해 모든 경구면역관용군에서 섬유화가 억제되는 것을 관찰할 수 있었다(PCQ01, 그림 9A, 9B).
- 본 연구 결과 경구면역관용 유도는 4주째뿐만 아니라 8주째의 기도과민성도 현저하게 감소시켰으며, 8주째에 나타나는 기도염증반응기 관지 폐포세 척 액내의염증세포 수)과 기도재형성의 대표적인 지표인 기도 상피 술잔세포의 과다형성 및 기저막하부의 섬유화 정도도 현저하게 억제시킴을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 알레르기 기관지천식모델에서 알레르기 면역반응을 억제시키기 위한 경구면역관용 유도의 효과가 8 주까지 장기적으로 지속될 수 있다는 것을 의미한다.
- 현저하게 억제시킴을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 알레르기 기관지천식모델에서 알레르기 면역반응을 억제시키기 위한 경구면역관용 유도의 효과가 8 주까지 장기적으로 지속될 수 있다는 것을 의미한다.
- 본 연구에서도 경구면역관용 유도 후 IFN-y 및 IL-13의 농도가 감소되며, 이러한 시토카인의 영향을 받는 혈청 내 OVA 특이 IgE, IgGl, IgG2a 농도도 감소됨을 관찰할 수 있었다. 이와 같은 연구결과들은 경구면역 관용 유도가 알레르기 면역반응에서 주가 되는 Th2 면역반응뿐만 아니라 Thl 면역반응까지도 억제됨을 보여주고 있다.
- 결론적으로 알레르기 기관지천식 모델에서 경구면역 관용 유도는 8주까지 장기적으로 기도과민성, 염증반응 및 기도재형성을 억제할 수 있으며, 그 기전에는 항원 특이 면역글로불린과 Thl 및 Th2 시토카인들에대한 억제작용이 중요한 역할을 하는 것으로 추측이 된다. 이와 같은 연구결과는 향후 실제 임상에서 경구면역 관용 유도를 알레르기 기관지천식의 치료에 응용할 수 있을 것으로 생각된다.
- 경구면역관용군은 천식군에 비해 penh 값, 기관지폐포세 척 액 내의 염증세포 수, IL-13 및 IFN-v 농도, 혈청 내의 OVA 특이 IgE, IgGl 및 IgG2a 농도, 폐 조직 술잔 세포의 과다형성, 기저막하부의 섬유화 정도가 유의하게 감소되었다 (P<0.05).
- 알레르기 기관지천식 모델에서 경구면 역관용 유도는8 주까지 장기적으로 기도과민성, 염증반응 및 기도 재형성을 억제하였으며, 그 기전에는 항원 특이 면역글로불린과 Thl 및 Th2 시토카인들에 대한 억제작용이 중요한 역할을 하는 것으로 추측되었다.
후속연구
- 이는 경구면역관용이 조절 도움 T 림파구의 활성화를 시켜서 면역반응이 억제될 수 있으나 본 연구에서는 조절 도움 T 림파구에서 주로 분비되는 IL-10의 농도가 감소되어 있어 가능성은 희박하다. 다른 기 전으로는 경구면역관용이 T 림파구의클론 결손이 나 무반응을 유도하여 항원특이 T 도움 세포의 반응이 억제될 수 있으므로 향후 이에 대한 연구가 필요하겠다.
- 이와 같은 연구결과는 향후 실제 임상에서 경구면역 관용 유도를 알레르기 기관지천식의 치료에 응용할 수 있을 것으로 생각된다.
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