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가설 설정
- 이상과 같이 사람의 천식에 사용되는 처방인 HMT에 대하여 생쥐에 유발된 천식의 각종 지표들을 개선해 줄 수 있을 것이라는 가설을 세우고 본 실험을 진행하였다.
제안 방법
- 얻어진 세척액은 염증세포의 수를 측정하는데 사용되었다. BALF 내에 존재하는 각종 면역 세포의 개수를 확인하기 위하여 cyto-spin(Thermo, USA)을 이용하여 면역 세포들을 슬라이드 글라스에 부착시킨 후 hematoxylin과 eosin으로 염색하여 광학 현미경(Olympus, Japan) 100x로 관찰하였다.
- 이와 같이 HMT는 문헌적으로 천식에 효험이 있다고 기술되고 천식 치료에 응용되어진 처방으로, 구성 약재 및 그와 유사한 처방에 대한 연구는 시행되었으나 아직까지 HMT의 천식에 대한 연구는 미비한 상황이다. 따라서 본 연구에서는 HMT의 천식 생쥐에 대한 기도과민성, 기도조직, BALF 내 면역세포, 면역 글로불린, cytokine 등의 변화를 살펴보았다.
- 생쥐로부터 얻은 혈액에서 분리한 혈청 내 IgE 항체, 항원 특이 IgG1 항체, IgG2a 항체의 함량 변화를 측정하였다. 천식 유발군에서 정상군에 비하여 유의한 IgE 항체 함량 증가가 있었다.
- 생쥐에 난알부민(Ovalbumin)의 비강 내 점적(Intra-nasal instillation)21,22으로 천식을 유발하고 HMT을 투여한 후 생쥐의 체중 변화, 기도 과민성의 지표인 Penh value(enhanced pause), 조직병리학적 이상 소견, 기관지폐포세척액(BALF, Bronchoalveolar lavage fluid)에서의 면역 세포수 변화, 면역 글로불린 함량과 cytokine 함량에 미치는 영향 그리고, 비장/체중의 무게 비율에 미치는 영향을 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
- 7주령된 수컷 48마리 Balb/c 생쥐를 샘타코(오산, 한국)에서 구입하였다. 일주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 온도와 습도가 조절되는 환경(24±3 ℃, 12-hr light-dark cycle)에서 고형 사료와 물을 자유로이 섭취하게 한 생쥐를 사용하였다.
- HMT는 ≪金匱要略≫7의 처방 구성에 준하여 조제하여 사용하였으며, 모든 약재는 동신대학교 목포 한방병원에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- )를 이용하여 실험 자료를 통계적으로 분석하였다. 실험의 성적은 평균±표준편차(mean±SD)를 이용하여 나타내었으며, 각 실험군의 평균차 검정에는 Anova 검정을 사용하여 p-값이 0.05 미만일 때, 유의한 차이가 있다고 판정하였다.
이론/모형
- 본 연구에서는 비교적 최근에 알려진 비강 내점적법(Intra-nasal instillation)을 활용하여 천식을 유발하였다. 비강 내 점적법은 종래의 분무법으로 각각의 동물에게 일정한 양의 항원을 전달할 수 없는 한계를 보완하여 고안된 방법이다22,23.
- 천식이 유발된 생쥐로부터 떼어 낸 폐 조직을 조직 분쇄기(인트론, 한국)를 이용하여 분쇄하였으며, lysis buffer(Sigma, USA)를 이용하여 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질을 정량하는데 bicinchoninicAcid(BCA) 방법을 이용하였다. 정량이 끝난 단백질에서 IL-4과 IFN-g의 함량은 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다.
- 심장 천자로 얻은 혈청으로부터 IgE, IgG1 및 IgG2a의 함량을 측정하기 위해 ELISA 방법을 사용하였다. 심장 천자로 얻은 혈액을 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다.
- 분리된 단백질을 정량하는데 bicinchoninicAcid(BCA) 방법을 이용하였다. 정량이 끝난 단백질에서 IL-4과 IFN-g의 함량은 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다. Cytokine 함량은 mouse IL-4detection kit(eBioscience, USA)와 mouse IFN-g detection Kit (eBioscience, USA)를 사용하여 측정하였고, kit와 함께 제공된 지침에 따라 실험을 진행하였다.
성능/효과
- 3. 중등도의 HMT 투여는 기관지폐포세척액 내의 대식세초와 총세포수를 유의한 수준으로 감소시켰으며, 고농도의 HMT 투여는 대식세포, 호중구, 호산구 및 총 세포수를 유의한 수준으로 감소시켰다.
- 6. HMT투여로 인해 생쥐의 체중, 비장/체중의 무게 비율, 혈청 내의 IFN-g 함량에 유의성 있는 변화는 관찰되지 않았다.
- 본 연구에서 천식 유발에 의해 폐 조직 내의 IL-4가 유의하게 상승하였으며, 이러한 상승은 HMT 투여로 효과적으로 억제되었다(Fig. 7).
- 생쥐의 기관지를 세척하여 얻은 세척액(BALF) 내에 존재하는 각종 면역 세포의 수를 확인한 결과 대조군에서 유의한 수준의 세포수 증가가 관찰 되었는데, 대표적으로 대식세포(macrophage), 호중구(neutrophil), 호산구(eosinophil) 그리고 분류되지 않는 림프구(Lymphocyte) 등이었다. 고농도의 HMT 및 프레드니솔론 투여는 대식세포, 호중구, 호산구 및 총 세포수를 감소시켰으며(P< 0.
- 실험 마지막 날 생쥐를 희생시키고 기관지폐포 세척액을 얻은 다음 폐 조직의 일부를 적출하여 육안적으로 관찰한 결과 천식 유발군에서 면역 세포 침윤을 위주로 하는 염증 소견이 발견되었고, 고농도의 HMT 투여는 이러한 염증 소견을 억제하는 경향성을 보였다. 정상군에서는 염증세포가 기관지 및 혈관 주변을 침윤하고 조직을 손상시키는 염증 소견이 관찰되지 않았으며, 기관지 벽의 비후도 관찰되지 않았으나, 천식 대조군에서는 기관지벽의 비후가 관찰되었다.
- 천식이 유발된 생쥐의 폐 조직에서 IFN-g 수준의 변화를 관찰한 결과 대조군에서 유의한 수준의IFN-g의 증가가 관찰되었으며, HMT 및 prednisolone은 IFN-g 수준에 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 7).
후속연구
- 이를 종합하면 HMT가 천식 생쥐의 주요 병리가 되는 폐 조직 내의 염증세포의 침윤과 기관지 비후 등의 구조적 손상을 억제하고 기관지 과민성을 억제하며, 주요 면역반응 경로가 되는 Th2 반응에 관여하는 IgE, IgG1, IL-4를 감소시켜 천식의 염증 반응에 효과를 나타낼 수 있으리라 생각된다.
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