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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 항산화 활성이 강한 신나무(, 4cer ginnala Max.)를 대상으로 신나무 껍질 추출물을 분획조제 하고, 이들에 대하여 S. typhimurium TA98, TA100을 이용한 Ames test로서 항돌연변이원성을 검토하였고, SRB aesay를 이용하여 각종 암세포에 대한 항암 활성을 탐색하였다.
제안 방법
- SRB (sulforhodamine B) assay는 세포 단백질 염색을 이용하여 세포 증식이나 독성을 측정하는 방법(21)으로 10%의 fetal bovine serum과 각각의 세포들인 인간 폐암세포 (A549), 인간유방암세포 (MCF-7), 인간의 간암세포(Hep3B) 그리고 인간의 위암세포 (AGS)를 함유하는 RPMI 1640배지를 5x104 cell/mL 농도로 100 J1L씩 각 well에 첨가하여 하루 동안 배양 (37℃, 5% C6)시킨 후 PBS에 녹인 시료들을 각각 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 mg/mL씩 첨가하여 다시 48시간 배양시켰다. 그 후상등액을 aspiratoi.
- 간접 변이원의 대표적인 물질인 B(a)P와 아미노산 가열분 해산물로 강력한 돌연변이 원인 Trp-P-1에 대한 시료들의 억 제활성도 관찰하였다. B(a)P (10 pg/plate)의 경우 S.
- 그 후상등액을 aspiratoi.로 조심스럽게 제거하고 차가운 10% TCA (4℃) 용액을 50 uL씩 첨가하여 세포들을 well 바닥에 고정시켰다 한 시간 동안 4C에서 배양시킨 후, TCA와 배지들을 제거하기 위하여 증류수로 다섯 번 헹구었다 Plate 를 건조시키고 여기에 1% acetic acid에 녹인 0.4% SRB를 첨가해서 30분 동안 염색시킨 후 결합하지 않은 SRB염색액 을 제거하기 위해 1% acetic acid 용액으로 네 번 세척하였다. 건조기에서 건조된 plate는 10 mM Tris buffer 100 pL로 염색제를 충분히 녹인 후 540 nm에서 microplate readei.
- 돌연연변이 원의 대부분은 발암물질이므로 항돌연변이원성드을 나타내는 물질은 항암 활성을 나타낸다는 것이 지금까지 많은 연구결과 확인되었다. 신나무 껍질 메탄올 추출물과 그 분획물들도 항돌연변이원성을 나타내고 있으므로 인간 암세포에 대한 성장 억제 효과를 규명하기 위하여 폐암세포 (A549), 유방암세포 (MCF-7), 위암세포(AGS), 간암세포 (Hep3B)를 이용한 이들 암세포에 대하여 SRB assay를 행하여성장억제 활성을 알아보았다.
- 이것을 37℃에서 20분간 진탕배양한 다음 상기의 돌연변이원성 실험과 같은 방법으로 실험하여 생성된 복귀 돌연변이 수를 측정하여 항돌연변이 성 유무를 판정하였다. 신나무 껍질 추출물과 분획물 그리고 변이원 물질의 농도는 예비실험을 통하여 결정하였으며, 항돌연변이 활성은 변이원 물질의 활성에 대한 시료의 억제율(inhibition, %)로 나타내었다.
- 신나무(4cer ginnala Max.) 껍질의 메탄올 추출물 및 분획물들의 Ames test를 이용한 항돌연변이원성 및 SRB assay에 의한 세포독성 효과를 규명하였다. 시료 자체는 돌연변이 원 성이 없는 것으로 나타났다.
- 어서 음지에서 풍건하였다. 음건한 시료를 95% 메탄올을 가하여 16시간씩 3회 추출한 후 여과하여 감압 농축기를 사용하여 추출용매를 제거하여 메탄올 추출물을 얻었다. 이 메탄올 추출물을 용매의 극성에 따라 순차적으로 분별분리를 행하여 각각 핵산, 클로르포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물분획물을 얻고, 다시 감압 농축하여 동결건조한 후 실험에 사용하였다.
- 음건한 시료를 95% 메탄올을 가하여 16시간씩 3회 추출한 후 여과하여 감압 농축기를 사용하여 추출용매를 제거하여 메탄올 추출물을 얻었다. 이 메탄올 추출물을 용매의 극성에 따라 순차적으로 분별분리를 행하여 각각 핵산, 클로르포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물분획물을 얻고, 다시 감압 농축하여 동결건조한 후 실험에 사용하였다.
- 4)로 전체량이 700 yL가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 20분간 진탕배양한 다음 histidine/biotin이 첨가된 top agar (45 ℃)를 2 mL씩 가하여 잘 혼합한 후 미리 조제해 놓은 minimal glucose agar plate상에 도 말하고 평판 고정화시켜 37 ℃ 에서 48시간 배양하여 생성된 복귀 돌연변이 (his+ revertant colony)수를 측정하여 돌연변이원성의 유무를 판정하였다.
- 2 M sodium phosphate buffer를 가하여 최종 부피가 700 J1L가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 20분간 진탕배양한 다음 상기의 돌연변이원성 실험과 같은 방법으로 실험하여 생성된 복귀 돌연변이 수를 측정하여 항돌연변이 성 유무를 판정하였다. 신나무 껍질 추출물과 분획물 그리고 변이원 물질의 농도는 예비실험을 통하여 결정하였으며, 항돌연변이 활성은 변이원 물질의 활성에 대한 시료의 억제율(inhibition, %)로 나타내었다.
대상 데이터
- Ames test를 개량한 preincubation법에 따라 항돌연변이원성 실험을 실시하였으며, 실험에 사용한 변이원은 4NQO, MNNG, Trp-P-1 그리고 B(a)P이었다. 건 열멸균 시킨 glass cap tube에 시료를 각각 50 uL씩 첨가하고 이어서 변이원 물질을 각각 50 uL씩 첨가하였다.
- )로부터 구입하였다.본 실험에 이용된 인간 폐암 세포 A549 (Lung carcinoma, Human), 인간위암세포 AGS (Gastric carcinoma, Human), 인간의 유방암 세포 MCF-7 (Breast adenocarcinoma, Human) 및 인간의 간암 세포 Hep3B (Hepatocellular carcinoma, Hunan)는 Korea Cell Line Bank (KCLB)로부터 구입하여 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다. 그 외 추출용매인 메탄올, 핵산, 클로로 포름, 에틸아세테이트, 부탄올 등은 특급시약을 사용하였다.
- 직접 돌연변이원 (direct mutagen)으로서 4-nitroquinoline-l -oxide (4NQO), N-methyl-N'-ntro-N-ntroso-guamlidine (MNNG)은 미국 Sigma사, 간접돌연변이원인 benzo(a)pyrene (B(a)P)과 3-amino-1, 4-dimethyl-5H-pyrido-(4, 3-b)indol (Trp-P-1)은 일본 和 光純藥의 특급 시약을 구 입하여 사용하였다.세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640과 Hepes buffer, Fetal bovine serum (FBS), Tripsin-EDTA는 Gibco사 (U.S.A.)로부터 구입하였다.본 실험에 이용된 인간 폐암 세포 A549 (Lung carcinoma, Human), 인간위암세포 AGS (Gastric carcinoma, Human), 인간의 유방암 세포 MCF-7 (Breast adenocarcinoma, Human) 및 인간의 간암 세포 Hep3B (Hepatocellular carcinoma, Hunan)는 Korea Cell Line Bank (KCLB)로부터 구입하여 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용한 신나무는 강원도 홍천군 내면 일대에 야생하는 20년 내외 수령으로 11월에 채취하여, 나뭇가지 1 cm 까지는 그대로 사용하고 굵은 것은 수피부분을 잘게 썰.어서 음지에서 풍건하였다.
- 직접 돌연변이원 (direct mutagen)으로서 4-nitroquinoline-l -oxide (4NQO), N-methyl-N'-ntro-N-ntroso-guamlidine (MNNG)은 미국 Sigma사, 간접돌연변이원인 benzo(a)pyrene (B(a)P)과 3-amino-1, 4-dimethyl-5H-pyrido-(4, 3-b)indol (Trp-P-1)은 일본 和 光純藥의 특급 시약을 구 입하여 사용하였다.세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640과 Hepes buffer, Fetal bovine serum (FBS), Tripsin-EDTA는 Gibco사 (U.
이론/모형
- 신나무 껍질 추출물과 분획물의 돌연변이원성 실험은 S typhimurium의 변이주인 TA98과 TA100을 이용하여 Ames test를 개량한 preincubation법 (20)으로 실시하였다. 건 열멸균 시킨 glass cap tube에 각각의 시료를 50 ug/plate씩 가하고 여기에 전 배양 시킨 배양균액 100 UL를 가한 다음 0.
성능/효과
- 4NQO에 대하여도 S. typhimurium TA98균주의 경우, 주죽물 200 uL/plate 첨가시 물 분획물이 91.6%, 메탄올 추출물이 84.4%로 다른 시료보다 높은 억제 활성을 나타났으며 S. typhimurium TA100균주에서도 메탄올 추출물, 물과 핵산분 획물이 각각 83.1%와 77.8% 그리고 77.3%로 높게 나타내었다(Fig. 2).
- typhimurium TA98과 TA100 두균주 모두에서 메탄올 추출물이 80% 이상의 높은 항돌연변이원성을 나타내었다. B(a)P에 대한 S typhimurium TA98 균주에 대해 시료 200 uL/plate 첨가시 메탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물에서 각각 88.3%와 78.6%의 억제 활성을 나타내었으며 Trp-P-1 (0.15 μg/plate)에서는 S. typhimurium TA98과 TA100 두균주 모두에서 메탄올 추출물이 80% 이상의 높은 억제 활 성을 나타냈다. 폐암 세포주 A549에 대한 암세포 성장 억제 활성을 검토한 결과 메탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물에서 0.
- Fig. 5에서와 같이 폐암 세포 A549에 대한 신나무 껍질 메탄올 추출물 및 용매분획물들의 성장 억제 활성을 검토한 결과 시료 농도 1 mg/mL 첨가시 메탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물에서 각각 77.3%와 76.6%의 억제 활성을 나타낸 반면에 클로로프롬과 물 분획물에서는 50% 미만으로 낮은 억제 활성을 나타냈다.
- MCF-7 세포의 경우에서는 시료의 농도의 증가에 따라 암세포 성장 억제 활성도 증가하였으며 시료 1 mg/mL 첨가시 모든 시료에서 60% 이상의 억제 활성을 나타내었으며 핵산과 에틸아세테이트 분획물에서 90% 이상의 높은 암세포 성장억제 효과를 나타내었다 {Fig. 7).
- 시료 자체는 돌연변이 원 성이 없는 것으로 나타났다. MNNG (0.4 Ug/plate)에 대한 항돌연변이 효과에서 S. typhimurium TA400 균주에 대해 신나무 껍질 메탄올 추출물에서 시료 농도 200 liL/plate 첨가시 83.3%로 가장 높게 나타났다. 동일 시료 농도에서 4NQO에 대하여서는 S.
- 3%로 높은 항돌연변이원성을 나타낸 반면 기타 시료에서는 비교적 낮은 억제율로 나타내었다. S. typhimurium TA100균주에서는 시료 농도 200 pL/plate 첨가시 대부분의 시료에서 모두 80.3% 이상의 높은 억제 활성을 나타냈으며, 그 중에서 메탄올 추출물이 92.7%로 가장 높은 항돌연변이원성을 나타냈다 (Fig. 4).
- 6%로 높은 억 제활성을 나타내었다. S. typhimurium TA100균주에서도 200 UL/plate 첨가시 핵산분획물을 제외한 다른 시료에서 모두 74.3% 이상의 비교적 높은 억제 활성을 나타내었다 {Fig. 3)
- S. typhimurium TA98, TA100의 두균주를 이용한 Ames test를 행한 결과 control의 복귀 돌연변이 집락수는 TA98이 17.5+1.5, TA100은 169±8.0이었다. 신나무 껍질 추출물과 분획물 6종을 50 ulplate, 100 pL/plate, 150 ulplate, 200 p Uplate의 농도로 하여 시험한 결과 농도의 변화에 따른 집락수의 큰 변화를 나타내지 않았으므로 신나무 껍질 추출물과 분획들 자체로는 돌연변이 원성이 없는 것으로 판단되었다(데이타 생략).
- 본 연구 결과에 의하면 신나무 시료들의 항돌연변이 억제 효 과는 변이원의 종류에 따라 다른 효과를 나타내었으며 이는 생열귀나무 잎의 추출물들의 항돌연변이 억제 효과가 변이원의 종류에 따라 다양하게 나타내었다는 보고(22)와 일치하였다. 또한 시료 농도의 증가에 따라 억제율도 증가하여 껍질 추출물과 분획물의 첨가량과 억제율간에 확실한 용량-반응관계를 나타내었다.
- 메탄올 추출물과 각각의 용매분획물에 대한 항돌연변이원성을 실험한 결과, 직접 변이원으로 작용하는 강력한 돌연변이원성과 발암성을 가진 MNNG (0.4 llg/plate)에 대하여 S. typhimurium TA100 균주에서 시료 농도 50 pL/plate에서 200 llL/plate까지 첨가하였을 때 용량-반응 관계가 뚜렷하게 나타났다. 특히, 시료 농도 200 UL/plate 첨가시 메탄올 추출물과 물분획물에서 각각 83.
- 본 연구 결과에 의하면 신나무 시료들의 항돌연변이 억제 효 과는 변이원의 종류에 따라 다른 효과를 나타내었으며 이는 생열귀나무 잎의 추출물들의 항돌연변이 억제 효과가 변이원의 종류에 따라 다양하게 나타내었다는 보고(22)와 일치하였다. 또한 시료 농도의 증가에 따라 억제율도 증가하여 껍질 추출물과 분획물의 첨가량과 억제율간에 확실한 용량-반응관계를 나타내었다.
- 그러나 식물 추출물의 생리활성은 미지의 미량 성분들이 복합적으로 작용하여 나타나는 경우가 많고, 신나무의 성분으로 phenol성 화합물이나 tannin류 외에도 saponin류도 분리되고 있고, 미확인 물질들도 존재할 수 있으므로 단일 성분에 의한 효과로 보기 어렵다. 본 연구 결과에서도 메탄올 추출물이 대부분의 암세포에 대하여 강한 억제 활성을 나타내는 데 비하여 용매별 분획으로 얻어진 분획물 중에서는 에틸아세테이트 분획물 외에는 대체로 메탄올 추출물보다 억제 활성이 강하게 나타나는 분획물은 없는 것으로 나타내었다. 따라서 신나무 껍질 추출물이 항돌연변이원성과 각종 암세포에 대한 억제 활성이 비교적 다양하게 나타났으므로 앞으로 그 효과를 명백히 규명하기 위하여 추가적인 검색 및 활용방안에 대하여 충분한 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 한19) 등은 신나무의 생리활성 물질인 methyl gallate (일명 gallicin) 이 인체 구강유상피암 종세포에 대하여 억제 활성이 있으며, 정상 세포에 영향을 미치는 독성 작용이 적은 우수한 항암물질로 판정하였고, 앞으로 구강암 치료를 위한 항암제로 개발될 수 있을 것이라고 하였다. 본 연구에서도 4종의 암세포 모두에 대하여 신나무 껍질 추출물들이 비교적 강한 성장억제활성을 나타내었는데 이는 신나무 수피에 함유되어 있는 methyl gallate, acertannin과 같은 polyphenol 이나 tannin의 영향이 클 것으로 판단된다. 그러나 식물 추출물의 생리활성은 미지의 미량 성분들이 복합적으로 작용하여 나타나는 경우가 많고, 신나무의 성분으로 phenol성 화합물이나 tannin류 외에도 saponin류도 분리되고 있고, 미확인 물질들도 존재할 수 있으므로 단일 성분에 의한 효과로 보기 어렵다.
- 0이었다. 신나무 껍질 추출물과 분획물 6종을 50 ulplate, 100 pL/plate, 150 ulplate, 200 p Uplate의 농도로 하여 시험한 결과 농도의 변화에 따른 집락수의 큰 변화를 나타내지 않았으므로 신나무 껍질 추출물과 분획들 자체로는 돌연변이 원성이 없는 것으로 판단되었다(데이타 생략).
- 위암 세포 AGS에 대한 추출물 및 분획물들의 억제 활성은 1 mg/mL 첨가시 물 분획물을 제외한 모든 시료에서 90% 이상의 매우 강한 활성을 나타내었는데 메탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물에서 0.25 mg/mL의 낮은 시료 농도에서도 각각 84.6%와 72.1%의 강한 억제 효과를 보여주었다(Fig. 6).
- typhimurium TA100 균주에서 시료 농도 50 pL/plate에서 200 llL/plate까지 첨가하였을 때 용량-반응 관계가 뚜렷하게 나타났다. 특히, 시료 농도 200 UL/plate 첨가시 메탄올 추출물과 물분획물에서 각각 83.3%와 78.1%로 다른 시료보다 높은 항돌연변이원성을 나타내었다 (Eg. 1).
- typhimurium TA98과 TA100 두균주 모두에서 메탄올 추출물이 80% 이상의 높은 억제 활 성을 나타냈다. 폐암 세포주 A549에 대한 암세포 성장 억제 활성을 검토한 결과 메탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획물에서 0.25 mg/mL의 낮은 시료 농도에서도 54.9%와 55.3%의 억제 효과를 보여주었다. 위암 세포AGS의 경우 시료 농 도 1 mg/mL 첨가시 대부분의 시료에서 90% 이상의 매우 강한 활성을 나타내었다.
후속연구
- 본 연구 결과에서도 메탄올 추출물이 대부분의 암세포에 대하여 강한 억제 활성을 나타내는 데 비하여 용매별 분획으로 얻어진 분획물 중에서는 에틸아세테이트 분획물 외에는 대체로 메탄올 추출물보다 억제 활성이 강하게 나타나는 분획물은 없는 것으로 나타내었다. 따라서 신나무 껍질 추출물이 항돌연변이원성과 각종 암세포에 대한 억제 활성이 비교적 다양하게 나타났으므로 앞으로 그 효과를 명백히 규명하기 위하여 추가적인 검색 및 활용방안에 대하여 충분한 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
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