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문제 정의
- 백화사설초 현탁 세포배양 시 생장 속도를 높이기 위하여 일반적으로 알려진 식물세포 배양용 기본 배지들 중에서 최적의 배지를 찾고자 하였다. MS, SH, AR (Anderson's Rhododendron), White 배지를 기본 배지로 하여 14일간 세 포 생장을 관찰하였다(Fig.
- 본 연구에서는 백화 사설 초로부터 대량배양이 가능한 현 탁 세포를 유도하고 세포의 생장 및 oleanolic acid 생산에 최적인 배지 조건을 결정하였다. 또한 oleanolic acid를 이성질체인 ursolic acid로부터 분리하여 정량하기 위한 HPLC 분석조건을 최적화하였다.
제안 방법
- lb). 캘러스가 유도되었던 배지와 동일한。.5 mg/L 2, 4-D와 0.1 mg/L kinetin이 포함된 SH 배지에서 백화사설초 현탁 세포를 유도하였다(Fig. lc). 유도된 현탁 세포는 30 g/L의 sucrose 농도에서 접종 후 2일 째까지는 세포의 생장이 거의 관찰되지 않는 지연기를 보였다.
- 2, 4-D 농도를 0.25, 0.5, 0.75 mg/L로, kinetin 농도를 0, 0.05, 0.1 mg/L로 하여 총 9가지 농도에서 현탁 세포를 유도해 보았다(Table 1). 그 결과, 0.
- 배지와 동량의 증류수로 2~3회 세척한 후, 진공펌프를 이용하여 수분을 제거하고 미리 무게를 측정한 weighing dish에 세포를 옮겨 담아 화학저울로 FCW를 측정하였다. FCW 측정 후 60℃ 의 drying oven에서 24시간 동안 항량이 될 때까지 건조하여 DCW를 측정하였다.
- 백화사설초 현탁 세포배양 시 생장 속도를 높이기 위하여 일반적으로 알려진 식물세포 배양용 기본 배지들 중에서 최적의 배지를 찾고자 하였다. MS, SH, AR (Anderson's Rhododendron), White 배지를 기본 배지로 하여 14일간 세 포 생장을 관찰하였다(Fig. 3). 비교한 네 가지 배지 중에서 SH 배지에서 가장 빠른 생장 속도를 보였고, low salt 배지인 White 배지와 AR 배지는 백화사설초 현탁 세포배양에 적절하지 못함을 확인하였다.
- 백화사설초 현탁 세포배양을 통해서 oleanolic acid와 ursolic acid를 생산하기 위해서는 이들을 분리하여 정량 분석할 수 있어야 할 것이다. Oleanolic acid가 소수성 물질이라는 것에 착안하여 역상 컬럼을 사용한 HTLC로 분석하였다. Reversed phase C18 column인 Rexchrom S5-100-ODS column, Metasil 5μ ODS column, Capcell Pak C18 column을 사용하여 oleanolic acid를 분석하였는데, 이 중에서 Rexchrom S5-100-ODS column의 분리 능이 가장 좋았다.
- 따라서 백화사설초 현탁세포에서 oleanolic acid가 생산된다고 결론을 내렸다. Oleanolic acid의 standard가 양에 따라 비례적으로 정량 분석이 가능한지 확인하기 위하여 oleanolic acid의 standard를 100, 200, 300, 400, 500 mg/L로 제조하여 HPLC로 분석하였다. Standard 양의 증가에 따라 peak의 면적이 비례적으로 증가하였으므로 정확한 정량 분석이 가능했다.
- Oleanolic acid의 생산을 증대시키기 위해 signal transducer와 abiotic elicitoi를 배양 6일째 첨가하였고, 배양 10일째 수확하였다' Signal transducer로 methyl jasmonate (MJ), hydrogen peroxide (HP), salicylic acid (SA) 를, abiotic elicitor로 HgCh, CuCh, vanadyl sulfate (VS) 를 사용하였다.
- 두 가지의 생장조절제 조건에서 백화사설초 현탁 세포의 생장과 oleanolic acid 생산성을 비교한 것을 Table 2에 나타내었다. 두 조건 모두 배양 8일째에 현탁 세포의 특성을 관찰하였다. 2, 4-D 0.
- 유용물질을 생산할 목적으로 식물세포 배양을 이용할 경우에는 배양조건을 제어함에 따라 유용물질을 포함한 세포를 효율적으로 얻을 수 있으며 수확도 쉽다. 따라서 백화 사설 초로부터 현탁세 포를 유도하기 위해 기본적인 생장조절제인 2, 4-D와 kinetin을 사용하였다. 무균 조건하에서 발아시킨 백화 사설 초의 잎을 사용하여 0.
- 2배 증가되었다. 따라서, 백화사설초 현탁 세포배양에 사용할 생장조절제로 0.75 mg/L의 2, 4-D와 0.1 mg/L의 kinetin을 사용하였다.
- 본 연구에서는 백화 사설 초로부터 대량배양이 가능한 현 탁 세포를 유도하고 세포의 생장 및 oleanolic acid 생산에 최적인 배지 조건을 결정하였다. 또한 oleanolic acid를 이성질체인 ursolic acid로부터 분리하여 정량하기 위한 HPLC 분석조건을 최적화하였다. 확립된 배양 및 분석조건을 이용하여 oleanolic acid의 생산을 증대시키기 위해 다양한 signal transducer와 abiotic elicitor 들을 처리하였으며 세포 배양을 위한 생산 가능성을 조사하였다.
- 무균 조건 하에서 발아된 백화 사설 초의 잎에 상처를 낸 다음, 2, 4-D와 kinetin을 농도별로 첨가한 MS, SH 배지에서 2 5℃, 암조건 하에 캘러스를 유도하였다. 2, 4-D와 kinetin을 농도별로 첨가한 SH 배지에 캘러스를 넣고 251, 100 rpm의 회전식 진탕배양기에서 암조건 하에 배양하여 현탁 세포를 유도하였다.
- la). 무균 조건하 에서 발아시킨 백화 사설 초의 잎을 사용하여 0.5 mg/L 2, 4-D, 0.1 mg/L kinetin, 30 g/L sucrose가 첨가된 SH 배지에서 캘러스를 유도하였다(Fig. lb). 캘러스가 유도되었던 배지와 동일한。.
- 2 기압에서 가압 증기 멸균하여 사용하였다. 배양조건은 회전식 진탕배양기에서 25℃, 120 rpm, 암 조건으로 유지하였고, 계대배양은 7일 간격으로 수행하였다.
- 1 여과지상에서 시료의 배양액을 걸러내었다. 배지와 동량의 증류수로 2~3회 세척한 후, 진공펌프를 이용하여 수분을 제거하고 미리 무게를 측정한 weighing dish에 세포를 옮겨 담아 화학저울로 FCW를 측정하였다. FCW 측정 후 60℃ 의 drying oven에서 24시간 동안 항량이 될 때까지 건조하여 DCW를 측정하였다.
- 2, 4-D와 kinetine 캘러스와 현탁 세포를 유도하기 위한 기본적인 식물 생장조절제이다. 백화 사설 초의 캘러스를 유도하기 위하여 먼저, 백화 사설 초의 종자를 표면멸균을 하여 발아시켰다(Fig. la). 무균 조건하 에서 발아시킨 백화 사설 초의 잎을 사용하여 0.
- 9분이었다. 백화 사설 초의 현탁 세포 추출물의 추정 피크가 맞다는 것을 명확하게 하기 위해 현탁 세포 추출물에 같은 농도가 되도록 oleanolic acid를 첨가하여 분석하였다(Fig. 5). 한편, 현탁 세포 추출물에 같은 농도가 되도록 ursolic acid를 첨가하여 분석하였다(Fig.
- 따라서 생장조절제의 농도를 최적화하면 백화사설초 현탁 세포의 생장 효율을 높일 수 있다. 백화사설초 캘러스로부터 현탁 세포를 유도할 때, 생장 효율과 생산성이 좋은 현탁 세포를 얻기 위해 식물의 생장과 현탁 세포 유도에 관련된 기본적인 생장조절제인 2, 4-D와 kinetini- 여러 농도로 사용하여 백화사설초 현탁 세포에 최적인 조건을 찾았다.
- 백화 사설 초의 종자를 70% 알코올에 1분간 살균 후, 멸균한 증류수로 세척하였다. 서) 척한 종자를 1% NaOCl에 15분간 멸균 후, 멸균한 증류수로 3회 세척하였고, 생장조절제가 없는 Murashige와 Skoog (MS), Schenk와 Hildebrandt (SH), 및 White 배지에서 발아시켰다.
- 세포의 생장을 측정하기 위해서 세포 생체량 (fresh cell weight, FCW)과 세포 건조량 (dry cell weight, DCW)을 측정하였다. 100- mL Erlenmeyer flask에서 배양한 현탁 세포를 Buchner funnel을 이용하여 Whatman No.
- 비교한 네 가지 배지 중에서 SH 배지에서 가장 빠른 생장 속도를 보였고, low salt 배지인 White 배지와 AR 배지는 백화사설초 현탁 세포배양에 적절하지 못함을 확인하였다. 이상의 결과로부터 백화 사설 초 현탁 세포배양에 적합한 배지는 SH 배지라고 결론을 내렸으며, 이후 연구에서 전과 같이 SH 배지를 기본 배지로 사용하였다. 생장조절제는 극소량으로도 식물의 생장과 발생에 영향을 미친다.
- 5). 한편, 현탁 세포 추출물에 같은 농도가 되도록 ursolic acid를 첨가하여 분석하였다(Fig. 6). 백화사설초 현탁 세포 추출물에 oleanolic acid를 첨가하여 분석하였을 경우, oleanolic acid의 retention time인 12.
- 또한 oleanolic acid를 이성질체인 ursolic acid로부터 분리하여 정량하기 위한 HPLC 분석조건을 최적화하였다. 확립된 배양 및 분석조건을 이용하여 oleanolic acid의 생산을 증대시키기 위해 다양한 signal transducer와 abiotic elicitor 들을 처리하였으며 세포 배양을 위한 생산 가능성을 조사하였다.
성능/효과
- 두 조건 모두 배양 8일째에 현탁 세포의 특성을 관찰하였다. 2, 4-D 0.5 mg/L 와 kinetin 0.1 mg/L를 첨가한 (A) 조건에서의 세포건 조 중량은 17.1 g/L인 반면, 2, 4-D 0.75 mg/L 와 kinetin 0.1 mg/L를 첨가한 (B) 조건에서는 21.9 g/L로 (A) 조건에 비해 4.8 g/L 증가하였다. 이러한 차이는 다른 농도의 생장조절제와 초기 접종량에서 기인한 것으로 보인다.
- 1 mg/L의 kinetic이 첨가된 경우였다. Oleanolic acid가 소수성 물질이라는 것에 착안하여 역 상 컬럼을 사용한 HPLC로 분석하였는데, Rexchrom S5-I00-ODS c 이 umn 의 분리 능이 가장 좋았다. Spectrophotometere}- photodiode array detect。]를 사용하여 oleanolic acid와 ursolic acid의 최적 UV 파장을 검색한 결과, 200 nm에서 최적의 UV 흡광도가 나타났다.
- F/D ratio가 작으면 세포의 부피가 작아서 고농도 배양에 유리하다. Oleanolic acid의 생산량은 (A), (B) 조건에서 각각 7.01, 43.4 mg/L로, (B) 조건에서의 생산량이 (A) 조건보다 6.2배 증가되었다. 따라서, 백화사설초 현탁 세포배양에 사용할 생장조절제로 0.
- Oleanolic acid가 소수성 물질이라는 것에 착안하여 역상 컬럼을 사용한 HTLC로 분석하였다. Reversed phase C18 column인 Rexchrom S5-100-ODS column, Metasil 5μ ODS column, Capcell Pak C18 column을 사용하여 oleanolic acid를 분석하였는데, 이 중에서 Rexchrom S5-100-ODS column의 분리 능이 가장 좋았다. Spectrophotometere- photodiode array detector# 사용하여 oleanolic acid와 ursolic acid의 최적 UV 파장을 검색한 결과, 200 nm에서 최적의 UV 흡광도가 나타났다.
- Reversed phase C18 column인 Rexchrom S5-100-ODS column, Metasil 5μ ODS column, Capcell Pak C18 column을 사용하여 oleanolic acid를 분석하였는데, 이 중에서 Rexchrom S5-100-ODS column의 분리 능이 가장 좋았다. Spectrophotometere- photodiode array detector# 사용하여 oleanolic acid와 ursolic acid의 최적 UV 파장을 검색한 결과, 200 nm에서 최적의 UV 흡광도가 나타났다. 이상의 실험으로부터 결정된 Rexchrome S5-100-ODS column을 이용하고, 이동상으로는 acetonitrile과 watei를 80 : 20으로 하고, 유속은 1.
- Oleanolic acid의 standard가 양에 따라 비례적으로 정량 분석이 가능한지 확인하기 위하여 oleanolic acid의 standard를 100, 200, 300, 400, 500 mg/L로 제조하여 HPLC로 분석하였다. Standard 양의 증가에 따라 peak의 면적이 비례적으로 증가하였으므로 정확한 정량 분석이 가능했다.
- Oleanolic acid가 소수성 물질이라는 것에 착안하여 역 상 컬럼을 사용한 HPLC로 분석하였는데, Rexchrom S5-I00-ODS c 이 umn 의 분리 능이 가장 좋았다. Spectrophotometere}- photodiode array detect。]를 사용하여 oleanolic acid와 ursolic acid의 최적 UV 파장을 검색한 결과, 200 nm에서 최적의 UV 흡광도가 나타났다. 이동상은 acetonitrilee watei를 80 : 20으로, 유속은 1.
- 세포의 수분 함량을 나타내는 세포 크기지수인 FCW/DCW ratio (F/D ratio)의 경우 19 부근의 값을 보였다. 가장 잘 알려진 담배 현탁 세포의 F/D ratio가 보통 20 정도의 값을 가지는 것에 비춰볼 때, 백화 사설 초와 담배의 현탁 세포는 세포의 크기가 비슷하다는 것을 알 수 있다. 배양 8일째 세포를 수확하여 분석한 결과, 건조 세포 1 g 당 0.
- 1 mg/L로 하여 총 9가지 농도에서 현탁 세포를 유도해 보았다(Table 1). 그 결과, 0.75 mg/L의 2, 4-D와 0.1 mg/L의 kinetin 농도에서 가장 빨리 현탁 세포가 유도되었다. 이때, 유도된 백화 사설 초의 현탁 세포는 30 g/L의 sucrose 농도에서 접종 후 2일째까지는 세포의 생장이 거의 관찰되지 않는 지연기를 보였다.
- MJ 100 mM을 배양 6일째 첨가했을 때의 세포 생장 변화를 보면, 첨가 후 2일이 지나면서부터 세포의 양이 크게 감소 하기 시작하여 첨가 4일 후부터는 변화가 없었다. 따라서 MJ 100 mM 처리 후 4일이 지나면 세포가 모두 죽는다는 것을 알 수 있었다(Fig. 9). MJ 100 mM을 첨가한 후 4일째에 수확한 세포로부터 나온 이eanolic acid의 양은 5.
- Methyl jasmonate 100 mM을 배양 6일째 첨가했을 때의 세포 생장 변화를 보면, 첨가 후 2일이 지나면서부터 세포의 양이 크게 감소하기 시작하여 첨가 4일 후부터는 변화가 없었다. 따라서 methyl jasmonate를 처리 후 4일이 지나면 세포가 모두 죽는다는 것을 알 수 있었다. Methyl jasmonate 100 mM을 첨가한 후 4일째에 수 확한 세포로부터 나온 oleanolic acid의 양은 5.
- 9분에서 두 개의 피크가 나왔다. 따라서 백화사설초 현탁세포에서 oleanolic acid가 생산된다고 결론을 내렸다. Oleanolic acid의 standard가 양에 따라 비례적으로 정량 분석이 가능한지 확인하기 위하여 oleanolic acid의 standard를 100, 200, 300, 400, 500 mg/L로 제조하여 HPLC로 분석하였다.
- 가장 잘 알려진 담배 현탁 세포의 F/D ratio가 보통 20 정도의 값을 가지는 것에 비춰볼 때, 백화 사설 초와 담배의 현탁 세포는 세포의 크기가 비슷하다는 것을 알 수 있다. 배양 8일째 세포를 수확하여 분석한 결과, 건조 세포 1 g 당 0.41 mg의 oleanolic acid가 생산되었다.
- 3). 비교한 네 가지 배지 중에서 SH 배지에서 가장 빠른 생장 속도를 보였고, low salt 배지인 White 배지와 AR 배지는 백화사설초 현탁 세포배양에 적절하지 못함을 확인하였다. 이상의 결과로부터 백화 사설 초 현탁 세포배양에 적합한 배지는 SH 배지라고 결론을 내렸으며, 이후 연구에서 전과 같이 SH 배지를 기본 배지로 사용하였다.
- 세포 건조중량은 20.5 g/L로 control (21.9 g/L)과 별 차이가 없었으나, 건조 세포 1 g 당 포함되어있는 oleanolic acid의 양은 4.59 mg으로 control (1.98 mg)에 비해 2.32배로 증가하였다(Table 3). 위 결과를 종합해 볼 때 SA와 MJ의 처리 가 oleanolic acid 생산에 크게 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.
- 32배로 증가하였다(Table 3). 위 결과를 종합해 볼 때 SA와 MJ의 처리 가 oleanolic acid 생산에 크게 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다. 따라서 SA 및 MJ의 최적 처리 농도를 찾으면 더 높은 수율로 oleanolic acid를 얻을 수 있을 것이라 사료된다.
후속연구
- 위 결과를 종합해 볼 때 SA와 MJ의 처리 가 oleanolic acid 생산에 크게 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다. 따라서 SA 및 MJ의 최적 처리 농도를 찾으면 더 높은 수율로 oleanolic acid를 얻을 수 있을 것이라 사료된다.
- 생약재 백화사설초로부터는 oleanolic acid와 ursolic acid가 생산되나, 이 두 가지 물질은 isomer로서 분리하기가 어렵다. 백화사설초 현탁 세포배양을 통해서 oleanolic acid와 ursolic acid를 생산하기 위해서는 이들을 분리하여 정량 분석할 수 있어야 할 것이다. Oleanolic acid가 소수성 물질이라는 것에 착안하여 역상 컬럼을 사용한 HTLC로 분석하였다.
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