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문제 정의
- 본 연구를 통하여 유기산 생산을 위한 Propionibacterium acidipropionici 의 발효 특성을 규명하여 보았다. P- acidipropionici ATCC 25562, 4875, 및 4965 등 세 균주를 선별하여 발효 실험에 의한 최적 성장조건을 규명한 결과, peptone 1.
- 유기산은 현재까지 석유나 천연가스 등 화석원료에만 의지해 왔으나 이러한 합성 유기산은 가격이 비쌀 뿐 아니라 그 많은 수요를 조달하기에는 양이 중분치 않은 실정이다. 따라서 본 연구에서는 회분식 발효 공정을 이용하여 Propionibacterium acidipropionici 의 발효 특성을 연구하고 우수한 발효 균주의 선별을 통해 유기산 대량 생산을 위한 기초자료를 마련하고자 한다.
제안 방법
- 유기산을 생성하는 박테리아 균주로서 초산과 프로피온산의 생산성이 우수한 Propionibacterium acidipropionici 균주 3종 (ATCC 4875, 4965, 25562)을 미국 ATCC (American Type Culture Collection)에서 구입하였다. 종균 (seed culture) 으로 사용하기 위해 냉동 건조된 박테리아를 수차례에 걸쳐 계대 (transfer)한 후 사용하였다.
- 유기산 균주의 최적 성장조건을 알아보기 위해 pH를 5.0~ 7.5까지 변화시키고 peptone (Acumedia, Inc)과 yeast extract (Difco Co.)의 양을 변화시키면서 발효를 실시하였다. 각각의 실험조건은 Table 1에 나타나 있다.
- Omni-Culture Bench-Top Fermenter System (Virtis. Co)를 사용하여 온도 및 교반 속도를 조절하고 유기산 생성 시유 량 펌프를 통해 3.0 N NaOH를 자동 주입하여 적정 pH를 유지하였으며, 혐기성 상태를 유지하기 위해 가스 주입구에 N2 가스를 간헐적으로 주입하였다. 또한 발효조 내의 정확한 온도 유지를 위해 온도계를 이용하여 발효기의 setting value와 실제 온도 값의 오차를 조절하였다.
- 0 N NaOH를 자동 주입하여 적정 pH를 유지하였으며, 혐기성 상태를 유지하기 위해 가스 주입구에 N2 가스를 간헐적으로 주입하였다. 또한 발효조 내의 정확한 온도 유지를 위해 온도계를 이용하여 발효기의 setting value와 실제 온도 값의 오차를 조절하였다. 발효가 시작되면 일정 시간별로 시료를 추출, 증류수로 25배 희석하고 0.
- 발효조 내의 유기산 (젖산, 프로피온산 및 초산)과 소모된 당 (글루코스) 농도는 HPLC (JASCO LC-900 Series)를 사용하여 분석하였다. 사용된 칼럼은 HPX-87H (Bio-Rad)이며 칼 럼 내의 온도는 항상 50℃ 로 유지하였다.
- 사용된 칼럼은 HPX-87H (Bio-Rad)이며 칼 럼 내의 온도는 항상 50℃ 로 유지하였다. 먼저 UV/VIS Detector를 이용하여 유기산의 농도를 분석하였으며 당 농도 측정 시에는 Column과 연결된 UV/VIS Detector 회로를 RI (Refractive Index)에 연결시켜 사용하였다. Pump의 유속과 압력은 0.
- 유기산 균주의 최적 성장조건을 규명하기 위하여 영양분 조성과 pH 등을 조정하며 발효를 실시하였다. P.
- 유기산 균주의 최적 pH 조건을 구하기 위해 발효조 내의 pH를 5.0에서 7.5까지 변화시키며 유기산 생산성을 검토하였다(Fig. 3). 발효 개시 후 90시간에는 pH가 높아질수록 젖산 생산량이 증가하는 것으로 보아 높은 pH에서 발효 속도가 빨라지며 pH 5.
- 환경제어 회분식 발효를 통하여 P- acidipropionici 세종류 균주의 발효 특성을 비교하여 보았다. 최초 당의 농도를 30 g/L, 온도를 37℃로 고정하고 pH 6과 7에서 실험을 실시하였다.
- 환경제어 회분식 발효를 통하여 P- acidipropionici 세종류 균주의 발효 특성을 비교하여 보았다. 최초 당의 농도를 30 g/L, 온도를 37℃로 고정하고 pH 6과 7에서 실험을 실시하였다. Fig.
- 또한 글루코스를 탄소 원으로 하여 세포가 성장하지만 글루코스가 다 소모된 이후에도 건강한 상태를 유지하여 소량이지만 지속적으로 성장하게 된다. 우수 균주의 선정을 위해 Table 2에 pH에 따른 균주 간의 생산성을 비교 분석하여 보았다. 세 균주 모두 최종 유기산 수율 및 생산성이 pH 6.
대상 데이터
- 유기산을 생성하는 박테리아 균주로서 초산과 프로피온산의 생산성이 우수한 Propionibacterium acidipropionici 균주 3종 (ATCC 4875, 4965, 25562)을 미국 ATCC (American Type Culture Collection)에서 구입하였다. 종균 (seed culture) 으로 사용하기 위해 냉동 건조된 박테리아를 수차례에 걸쳐 계대 (transfer)한 후 사용하였다.
- 발효용 배지로는 glucose 30 g/L, peptone 15 g/L, yeast extract 0.75 g/L, K2HPO4 0.25 g/L, KH2PO4 0.25 g/L, MnSO4 0.05 g/L를 사용하였다.
- 발효조 내의 유기산 (젖산, 프로피온산 및 초산)과 소모된 당 (글루코스) 농도는 HPLC (JASCO LC-900 Series)를 사용하여 분석하였다. 사용된 칼럼은 HPX-87H (Bio-Rad)이며 칼 럼 내의 온도는 항상 50℃ 로 유지하였다. 먼저 UV/VIS Detector를 이용하여 유기산의 농도를 분석하였으며 당 농도 측정 시에는 Column과 연결된 UV/VIS Detector 회로를 RI (Refractive Index)에 연결시켜 사용하였다.
이론/모형
- 005 M H2SO4를 초순수 여과하여 사용하였다. 세포량 측정에는 건조 중량 법을' 사용하여 시료마다 분광광도계 (Shimadzu, UV-1201)를 이용해 540 nm에서 홉 광도를 측정하여 농도를 구하였다.
성능/효과
- 유기산 균주의 최적 성장조건을 규명하기 위하여 영양분 조성과 pH 등을 조정하며 발효를 실시하였다. P. acidipropionici ATCC 25562를 이용한 배양시험에서, 발효 개 시 70시간 이후에는 프로피온산 (HPr) 과 아세트산 (HAc) 이 소량 생성되기 시작했으며, 전체적으로 중간 대사산물인 젖산 (HLa) 의 양이 모두 높게 나타난 것으로 보아 대사 반응이 한창 진행 단계에 있음을 알 수 있다(Fig. la). 그러나 170시간 이후에는 발효조 내의 젖산이 거의 다 소모되었으며 프로 피온 산과 아세트산의 생산량은 70시간 발효의 두 배 이상으로 증가하여 발효가 거의 종료되었음을 보여주고 있다(Fig.
- 2에 나타내었다. 발효 100시간 이후에는 yeast extract 주입량의 증가에 따라 프로피온산과 초산의 생산량이 조금씩 증가하는 경향을 나타내었으나 젖산의 소비는 주입량에 따라 불규칙적인 현상을 보이다 210시간 이후에는 생성된 젖산이 거의 소비되며 프로피온산과 초산으로 전환된 것을 볼 수 있었다. 젖산을 포함한 유기산 생산량은 yeast extract 함유량이 0.
- 3). 발효 개시 후 90시간에는 pH가 높아질수록 젖산 생산량이 증가하는 것으로 보아 높은 pH에서 발효 속도가 빨라지며 pH 5.5 이하에서는 프로피온산의 생성율이 현저히 떨어지는 것을 알 수 있다. 200시간 발효 후에는 생성된 젖산이 거의 다 소모되고 프로피온산과 초산으로 전환되었다.
- 200시간 발효 후에는 생성된 젖산이 거의 다 소모되고 프로피온산과 초산으로 전환되었다. 최종 유기산 생산량은 pH 5.0에서 가장 낮았으며 pH 5.5~ 7.5에서 비슷한 수치를 보여주고 있으나 프로피온산의 생성 율은 pH가 높아질수록 증가하는 경향이 있었다.
- 최초 당의 농도를 30 g/L, 온도를 37℃로 고정하고 pH 6과 7에서 실험을 실시하였다. Fig. 4는 pH 6.0에서 ATCC 25562 균주의 발효 실험 결과로서, 발효조 내의 모든 글루코스는 75시간이 경과하는 동 안에 모두 소비되었고 그 이후에 생성된 젖산도 75시간 전후에서 22 g lactic acid/L로서 최대 생산량을 보이다가 220시간의 발효 기간 동안 서서히 소모되었다. 초산과 프로피온산은 젖산이 고갈되는 시점을 전후해서 거의 모든 양이 생산되었고 최종 생산량은 각각 6.
- 0에서 ATCC 25562 균주의 발효 실험 결과로서, 발효조 내의 모든 글루코스는 75시간이 경과하는 동 안에 모두 소비되었고 그 이후에 생성된 젖산도 75시간 전후에서 22 g lactic acid/L로서 최대 생산량을 보이다가 220시간의 발효 기간 동안 서서히 소모되었다. 초산과 프로피온산은 젖산이 고갈되는 시점을 전후해서 거의 모든 양이 생산되었고 최종 생산량은 각각 6.4 g acetic acid/L, 19.7 g propionic acid/L로 나타났다. 세포 성장은 발효 기간 내내 저조하였으며 220시간 경과 후에 3.
- 69 g lactic acid/L로 최대에 도달하였으며 100시간까지 서서히 소모되었다. 또한 아세트산과 프로피온산의 최종 생산량은 각각 4.93 g acetic acid/L, 17.15 g propionic acid/L로 나타났다.
- 6). 세포량도 60시간대에 7.8 g drycell/L로 최대에 이르러 다른 유기산 균주에 비해 성장 속 도가 빠르고 왕성한 것으로 나타났다. 발효가 진행되는 동안 젖산의 농도가 관측되지 않는 것으로 보아 균주 체내에서 생성되는 즉시 빠른 속도로 소모되어 초산과 프로피온산으로 전환되는 것으로 보인다.
- 우수 균주의 선정을 위해 Table 2에 pH에 따른 균주 간의 생산성을 비교 분석하여 보았다. 세 균주 모두 최종 유기산 수율 및 생산성이 pH 6.0에서 더 높은 것으로 나타났으며 최대 세포량 역시 pH 6.0에서 더 높게 관찰되었다. 또한 pH 6.
- 0에서 더 높게 관찰되었다. 또한 pH 6.0에서 균주 간의 생산성을 비교해 본 결과 ATCC 25562 균주가 0.94 g total acids/g sugar로 유기산 수율은 가장 높지만 발효에 소모되는 시간이 220시간 이상으로 ATCC 4875, ATCC 4965 균주에 비해 대사 속도가 2배 이상 늦어 유기산 생산성을 고려해 볼 때 효율이 상당히 떨어짐을 알 수 있었다. ATCC 4965, ATCC 4875 균주에서는 생산성이 각각 0.
- 94 g total acids/g sugar로 유기산 수율은 가장 높지만 발효에 소모되는 시간이 220시간 이상으로 ATCC 4875, ATCC 4965 균주에 비해 대사 속도가 2배 이상 늦어 유기산 생산성을 고려해 볼 때 효율이 상당히 떨어짐을 알 수 있었다. ATCC 4965, ATCC 4875 균주에서는 생산성이 각각 0.29 g total acids/L/h, 0.28 g total acids/L/h로서 ATCC 4965 균주가 유 기산 생산성이 가장 높은 것으로 판명되었다.
- 본 연구를 통하여 유기산 생산을 위한 Propionibacterium acidipropionici 의 발효 특성을 규명하여 보았다. P- acidipropionici ATCC 25562, 4875, 및 4965 등 세 균주를 선별하여 발효 실험에 의한 최적 성장조건을 규명한 결과, peptone 1.5% (w/v), yeast extract 0.75% (w/v)에서 유기산 생산성이 최대로 나타났다. 또한 주어진 영양 조건에서 온도, pH 등 환경을 제어하며 회분식 발효를 실시한 결과 세 균주 모두 pH 6.
- 75% (w/v)에서 유기산 생산성이 최대로 나타났다. 또한 주어진 영양 조건에서 온도, pH 등 환경을 제어하며 회분식 발효를 실시한 결과 세 균주 모두 pH 6.0에서 유기산 수율과 생산성이 가장 높았으며, 그중에서도 P. acidipropionci ATCC 4965 균주가 유기산 생산성이 0.29 g total acids/L/h로 가장 우수한 것으로 판명되었다. 세 균주의 화학 양론적인 유기산 생산비를 비교해본 결과 1.
- 29 g total acids/L/h로 가장 우수한 것으로 판명되었다. 세 균주의 화학 양론적인 유기산 생산비를 비교해본 결과 1.5몰의 글루코오스로부터 1.60 ~ 2.34몰의 프로피온산과 0.7 4~ 1.05몰의 초산을 생산하는 것으로 나타났다.
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