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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 식품 부산물을 원료로 사용하여 회분식 발효를 통한 유기산의 생산성을 검토하고 세포재 순환식 연속발효를 통해 유기산의 대량생산을 위한 기초 자료를 마련하고자 한다.
- 본 연구에서는 식품 부산물을 원료로 사용하여 회분식 발효를 통한 Propionibacterium acidipropioniciS] 유기산 생산성을 검토하고 세포 재 순환식 연속발효를를 통해 유기산의 대량생산을 위한 기초자료를 마련하고자 하였다. CSL의 함유량에 따른 회분식 발효를 실시하여 균주의 생산성이 최대가 되는 발효 조건을 구하여 연속 발효 공정에 적용하였다.
제안 방법
- 본 연구에서는 식품 부산물을 원료로 사용하여 회분식 발효를 통한 Propionibacterium acidipropioniciS] 유기산 생산성을 검토하고 세포 재 순환식 연속발효를를 통해 유기산의 대량생산을 위한 기초자료를 마련하고자 하였다. CSL의 함유량에 따른 회분식 발효를 실시하여 균주의 생산성이 최대가 되는 발효 조건을 구하여 연속 발효 공정에 적용하였다. 희석률을 0.
- 유기산을 생성하는 박테리아 균주로서 Propionibacterium acidipropionici ATCC 4965를 미국 ATCC (American Type Culture Collection)에서 구입하였다. 종균 (seed culture)으로 사용하기 위해 냉동 건조된 박테리아를 수차례에 걸쳐 계 대 (transfer)한 후, 신선한 배지가 담긴 1.7 mL microtube°1] 접종하여 -70℃ 냉동고에 저장하였다.
- 발효 배지로는 당원으로 글루코스 함량이 약 3% (이하 w/v) 가 될 수 있도록 hydrol 을 환산하여 사용하였으며, CSL을 고형성분 중심으로 0.5~3.0% (이하 w/v)까지 0.5%씩 증가시키면서 발효를 실시하였다.
- 발효기는 Omni-Culture Bench-Top Fermenter System (Virtis. Co.)를 사용하여 온도 및 교반 속도를 조절하고 유 기산 생성 시 pump를 통해 3.0 N NaOH를 자동 주입하여 적정 pH를 유지하였으며, 혐기성 상태를 유지하기 위해 가스 주입구에 N2 가스를 간헐적으로 주입하였다. 또한 발효조 내의 정확한 온도 유지를 위해 온도계를 이용하여 발효기의 setting value와 실제 온도 값의 오차를 조절하였다.
- 0 N NaOH를 자동 주입하여 적정 pH를 유지하였으며, 혐기성 상태를 유지하기 위해 가스 주입구에 N2 가스를 간헐적으로 주입하였다. 또한 발효조 내의 정확한 온도 유지를 위해 온도계를 이용하여 발효기의 setting value와 실제 온도 값의 오차를 조절하였다. 발효가 시작되면 일정 시간별로 시료를 추출, 증류수로 25배 희석하고 0.
- 전분당 부산물을 이용한 연속발효에서는 hydrol 44.1 mL (최종 글루코스 3%)와 CSL 50 g (최종 고형성분 2.5%)를 증류수에 혼합하여 1 L를 제조한 후 12「C에서 15분간 살균하여 배지로 사용하였다. 먼저 pH 6.
- 5%)를 증류수에 혼합하여 1 L를 제조한 후 12「C에서 15분간 살균하여 배지로 사용하였다. 먼저 pH 6.0, 30℃에서 회분식 발효를 실시하였으며, 발효 80시간 후 발효액의 반 정도를 유출(breeding)시키고 신선한 배지로 같은 양 만큼 교체한 후 희석률 0.1 hr'로 세포 재 순환식 연속 발효를 시작하였다. 발효조 내의 세포량과 유기산량이 거의 정상 상태 (steady state)에 도달되는 시기에 다시 발효액의 반 정도를 신선한 배지로 교체한 후 희석률을 0.
- 2 hr's. 전 환시켜 가며 연속 발효를 실시하였으며 약 8시간 간격으로 시료를 뽑아 세포량과 당 소모량, 그리고 유기산의 농도를 측정하였다. 희석률(D)은 유량 (F) 에 발효조의 부피 (V) 를 나누어 산출하였다.
- 발효 장비는 회분식 발효 장치에 공극 0.1 ㎛의 MF Module (SAMBO global)이 장착된 교차흐름식 여과장치를 사용하였으며, 맥동 펌프 (Watson Marlow 313)를 이용하여 생성물은 통과시키고 고형물만 발효조 내로 재순환시킴으 로서 세포 농도를 높게 유지시켰다. 세포재순환식 연속발효 장치는 Fig.
- 칼럼은 HPX-87H (Bio-Rad)를 항상 50℃로 유지하며 사용하였다. 먼저 UV/ VIS Detector를 이용하여 유기산의 농도를 분석하였으며 당 농도 측정 시에는 UV/VIS Detector 회로를 RI (Refractive Index)에 연결시켜 사용하였다. Pump의 유속과 압력은 0.
- 전분당 부산물의 최적 조건을 알아보기 위해 CSL의 고형 성분을 0.5~3.0%까지 변화시키며 발효실험을 실시한 결과 중 일부를 도시하였다. CSL이 1.
- 회분식 발효를 통해 선정된 CSL의 최적 함량을 기초로 하여 유기산의 대량생산 가능성을 타진하기 위해 세포 재순환 식 연속발효를 실시하였다. 먼저 회분식 발효를 통하여 일정 농도의 세포량을 확보한 후 희석률을 0.
- 발효조 내의 유기산 (젖산, 프로피온산 및 초산)과 소모된 글루코스 농도는 HPLC (JASCO LC-900 Series)를 사용하여 분석하였다. 칼럼은 HPX-87H (Bio-Rad)를 항상 50℃로 유지하며 사용하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용되는 배지로는 (주)대상에서 입수한 옥 침수 (Com steep liquor, CSL)와 당원으로 Hydrol을 사용하였다. CSLe 각종 영양성분과 무기물 등이 풍부하여 발효 산업에서 단백질원이나 비타민원 등으로 사용되고 있으며, 고형물 함량은 50% (w/w)로 측정되었다.
- 유기산을 생성하는 박테리아 균주로서 Propionibacterium acidipropionici ATCC 4965를 미국 ATCC (American Type Culture Collection)에서 구입하였다. 종균 (seed culture)으로 사용하기 위해 냉동 건조된 박테리아를 수차례에 걸쳐 계 대 (transfer)한 후, 신선한 배지가 담긴 1.
이론/모형
- 1에 나타난 바와 같다. 연속발효 시에 발생하는 거품으로 인한 발효액과 세포의 유실을 방지하기 위해 Antiform A (SIGMA, A-5758)를 사용하였다.
- 005 M H2SO4< 초순수 여 과하여 사용하였다. Biomass 측정에는 건조 중량 법을 사용하여 시료마다 분광광도계 (Shimadzu, UV-1201)를 이용해 540 nm에서 흡광도를 측정하여 농도를 구하였다.
성능/효과
- 옥수수를 가수분해하여 전분당을 생산하는 공정에서 부산물로 발생하는 hydrol, raffinate 등은 풍부한 양의 글루코 오스를 함유하고 있어서 유기산 발효에 있어 당원으로 사용되며, 또한 옥 침수라 불리는 com steep liquor (CSL)는 탄 수화물, 아미노산, 단백질, 지방산, 락트산, 비타민, 그 밖의 무기 이온을 다량 함유하고 있어 유기산 발효 시 단백질원과 비타민 원으로 사용이 되며, 또한 고가의 yeast extract 14 peptone 등을 대체할 수 있어 경제적인 부산물로써 발효 산업에 큰 각광을 받고 있다(6). Quesada-Chanto 등 ⑺은 Propionibacterium shermanlie: 이용하여 비타민과 질 소원에 따른 생산성을 비교하였는데, yeast extract, CSL, soy brand를 비교 대상으로 하여 검토해본 결과 CSL의 프로피온산 생산성이 가장 높은 것으로 나타났다. Kadam 등 (8) 은 CSL, (NH4)2SO4, MgSO4, urea를 첨가한 저가 배지와 peptone, yeast extract를 사용한 고가 배지를 만든 후 각각 알코올 발효를 실시하여 발효 성능의 차이를 비교해 본 결과 두 배지 모두 80% 이상의 에탄올 생산량을 보였다.
- CSLe 각종 영양성분과 무기물 등이 풍부하여 발효 산업에서 단백질원이나 비타민원 등으로 사용되고 있으며, 고형물 함량은 50% (w/w)로 측정되었다. 또한 HPLC를 사용하여 Hydrol의 글루코오스 함량을 측정한 결과 68% (w/v)로 나타났다.
- 2에서 보는 바와 같이 113시간 만에 글루코스가 모두 소비되었으며, 같은 시간대에 총유 기산 생산량 (Toa) 도 평형에 도달하였다. 세 포량은 발효 76시간 만에 최대로 성장하였으며 발효 종료 후까지 건강한 상태를 지속적으로 유지하였다. 중간 대사산물인 젖산 (HLa) 은 발효 초반에 약간 측정되다가 곧 소모되어 초산 (HAc) 과 프로피온산 (HPr) 으로 전환되었다.
- 중간 대사산물인 젖산 (HLa) 은 발효 초반에 약간 측정되다가 곧 소모되어 초산 (HAc) 과 프로피온산 (HPr) 으로 전환되었다. 최종 초산, 프로피온산의 양은 각각 3.56 g acetic acid/L, 14.02 g propionic acid/L로 나타났다.
- Fig. 3은 CSL이 2.5%일 때의 발효 실험 결과로서 글루코 스가 90시간 전후에 완전히 소비되어 CSL 1.0%일 때에 비해 대사 속도가 약 20시간 이상 빨라짐을 알 수 있었다. 또한 비슷한 시간대에 유기산 생산량도 평형에 도달하여 최종 초산과 프로피온산 농도가 각각 4.
- 세포량은 발효 70시간을 전후해서 최대로 측정되었으며 발효 종료 후까지 건강한 상태가 지속되었다. CSL 1.0% 발효 결과와 비교해 볼 때 발효 속도 면에서는 약 20% 이상 단축되었으며 최종 유기산 생산량도 25% 이상 증산되었다.
- 29 g drycell/g glucose로 최대치를 보여주었다. 유기산 수율 및 생산성도 CSL 함량이 증가함에 따라 대체로 증가하는 경향을 보였다. 발효 시간을 고려한 유기산 생산성을 볼 때 CSL 0.
- 유기산 수율 및 생산성도 CSL 함량이 증가함에 따라 대체로 증가하는 경향을 보였다. 발효 시간을 고려한 유기산 생산성을 볼 때 CSL 0.5%의 경우 0.05 g total acids/L/h로 가장 낮았으며 CSL 2.5%와 3.0%에서는 0.26 g total acids/L/h으로 가장 높게 나타났다. 또한 CSL 1.
- 0%에서는 뚜렷한 변화 없이 서로 비슷한 경향을 보였다. 그러나 유기산 수율에 있어 CSL 2.5%가 0.8 g total acids/g glucose로 가장 높게 나타나 연속발효를 위한 최적 함량으로 결정되었다.
- 2 hr'에서는 40시간 만에 발효조 내의 세포량이 최고치에 도달하였다. 또한 세포 생산량도 급격히 증가하여 희석률이 0.1 hr1, 0.15 hr1, 0.2 成'일 때 최대 세포량은 각각 64.1 g drycell/L, 74.1 g drycell/L, 150 g drycell/L에 도달하여 희석률이 증가하면서 세포량이 급격하게 증가하는 것으로 나타났다. 이 결과들은 같은 영양 조건에서 회분식 발효와 비교해 볼 때 9~21배 증가된 것이다.
- 5에서 비교하여 보았다. 그 결과 주어진 실험실 조건에서는 희석률이 증가하면서 유기산 수율은 감소하는 반면 유기산 생산성은 증가하는 것으로 나타났다. 유기산 수율이 감소하는 이유는 세 포 생산량이 증가하면서 더 많은 글루코스가 세포 생산 및 유지에너지로 사용된 때문인 것으로 보이며, 희석률이 증가하면서 생산된 유기산이 즉시 발효조 밖으로 유출되어 생성 물 저해 효과가 줄어들고 신선한 배지가 빠른 속도로 공급됨으로 인하여 발효조의 환경 조건이 개선되어 유기산 생산성은 증가하는 것으로 판단된다.
- 유기산 수율이 감소하는 이유는 세 포 생산량이 증가하면서 더 많은 글루코스가 세포 생산 및 유지에너지로 사용된 때문인 것으로 보이며, 희석률이 증가하면서 생산된 유기산이 즉시 발효조 밖으로 유출되어 생성 물 저해 효과가 줄어들고 신선한 배지가 빠른 속도로 공급됨으로 인하여 발효조의 환경 조건이 개선되어 유기산 생산성은 증가하는 것으로 판단된다. 유기산 수율은 주어진 희석률에서 0.79~0.55 g total acids/g glucose로서 같은 조건의 회분식 발효에 비해 70~100%이지만 최대 생산성은 2.38~3.32 g total acids/L/h로서 9~13배까지 향상되었다. 따라서 세포 재 순환식 연속발효 공정을 scale-up 함으로서 유기산 생산뿐만 아니라 biomass 자원으로서 세포량의 대량생산도 가능할 것으로 판단된다.
- CSL의 함유량에 따른 회분식 발효를 실시하여 균주의 생산성이 최대가 되는 발효 조건을 구하여 연속 발효 공정에 적용하였다. 희석률을 0.1 ~0.2 hr'로 변화시키며 세포 재 순환식식 연속발효를 실시한 결과 0.2 hr'에서 최대 세포량은 150 g drycell/L으로 회분식 발효에 비해 21배 증가하였으며, 유기산의 최대 생산성은 3.32 g total acids/L/h로서 13배가 향상된 것으로 나타났다. 따라서 이 발효 공정을 scale-up 한다면 유기산뿐만 아니라 바이오매스 자원으로서 세포량의 대량 생산도 가능할 것으로 판단된다.
후속연구
- 32 g total acids/L/h로서 13배가 향상된 것으로 나타났다. 따라서 이 발효 공정을 scale-up 한다면 유기산뿐만 아니라 바이오매스 자원으로서 세포량의 대량 생산도 가능할 것으로 판단된다.
- 32 g total acids/L/h로서 9~13배까지 향상되었다. 따라서 세포 재 순환식 연속발효 공정을 scale-up 함으로서 유기산 생산뿐만 아니라 biomass 자원으로서 세포량의 대량생산도 가능할 것으로 판단된다.
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