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문제 정의
- 그러나 산삼배양근의 식품 및 의약품으로서의 안전성 여부가 확인되지 않아 이를 활용한 제품 개발에 관한 연구는 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 식물조직배양 기술을 이용하여 생산된 산삼배양추출물의 유전독성 시험 즉 복귀돌연변이 시험을 식품의약품안전청 고시 제2000-63호, 비임상시험 관리기준"8)와 제 1999-61호 "의약품 등의 독성시험 기준, , 9)에 따라 수행함으로서 산삼배양추출물의 식품원로로서의 안전성 여부를 평가하고자 수행하였다.
제안 방법
- 산삼 배양 추출물의 세균에 있어서의 유전자 돌연변이 유발 성 여부를 검색하기 위하여 Salmonella typhimurium의 히스 티딘 요구성 균주 TA100, TA1535, TA98 및 TA1537의 4 개의 균주와 대장균 E. c*의 트립토판 요구성 균주인 WP2 "w"를 이용해 복귀돌연변이 시험을 실시하였다.
- S-9 mix 1ml의 조성은 8 |imol MgCl2 - 6H2O, 33 |imol KC1, 5 |4_mol glucose-6-phosphate, 4 pmol NADPH, 4 gmol NADH, 100 gmol sodium phosphate buffer(pH 7.4) 및 0.3 ml S-9 mix로 하였으며, 그의 활성은 2- aminoanthracene의 돌연변이 유발로 확인하였다.
- 1 ml를, 양성 대조군은 양^대조물질 용액을 동일한 방법으로 가하여 실시하였다. 각 평판의 구별을 위해 평판의 일정위치에 유성펜으로 시험번호, 균주명, 농도(기호), S-9 mix 처리여부 등을 기입하였다. 시험물질 및 S-9 mix의 무균성 확인을 위해 시 험물질 최고농도액 0.
- 야생 산삼으로부터 유도한 산삼 배양근을 영양배지에서 4 주간 배양한 후 배양근을 수거하여 물로 3회 수세하고 45℃ 건조기에서 12시간 건조하였다. 건조된 산삼 배양근 1 kg에 대하여 1차 증류수 150 L(l:10)를 첨가하고 85℃의 수조에서 4시간 동안 추출하고 회전진공농축기를 사용하여 brix 60 이상으로 농축하여 산삼배양 추출물을 조제하였으며, 냉장 보관하면서 시험에 사용하였다.
- 대사활성계 적용 여부에 상관없이 최소 1개 균주에서 평판 당 복귀돌연변이 집락수가 1개 이상의 농도에서 재현성 있는 증가를 나타낼 때를 양성으로 판정하였다. 집락수의 용량 상관성 및 음성대조군에 비해 증가하는 정도 또한 고려하였다.
- 집락 계수시 각 평판의 기본 성장균층 (background lawn) 의 형성여부를 검사하였으며 오염 혹은 기타 이상의 발생여부를 점검하였다. 무균성 확인을 위한 평판에서는 미생물의 생장으로 인한 집락 생성 유무를 확인하였다.
- 본시험의 처리 최고농도를 결정함과 아울러 복귀돌연변이 유발성 여부도 알아보기 위해 예비시험을 실시하였다. 예비 시험에서는 대사활성계 적용(+S) 및 미적용 (-S)하에 본시험 에 준하여 시험하되 농도군당 1개의 평판을 사용하였으며, 시험물질 1.
- Salmonella typhimurium을 이용한 복귀돌연변이 시험은 Maron and Ames10)에 의하여 개발된 것으로 그 신속성, 간 편성으로 인하여 in vitro에서 돌연변이 물질 검색법으로 현재 가장 널리 사용되고 있는 시험법이다. 산삼배양추출물의 세균에 대한 돌연변이 유발성 검토를 위해 Salmonella (yp/iinmriitfn의 히스티딘 요구성 균주 TA100, TA1535, TA98 및 TA1537의 4개 균주와 대장균 E. coli의 트립토판 요구성 균주인 WP2 uvrA균주를 이용한 복귀돌연변이 집락수를 조사하였고 그 결과를 Table 1, 2에 나타내었다.
- 각 평판의 구별을 위해 평판의 일정위치에 유성펜으로 시험번호, 균주명, 농도(기호), S-9 mix 처리여부 등을 기입하였다. 시험물질 및 S-9 mix의 무균성 확인을 위해 시 험물질 최고농도액 0.1 ml와 S-9 mix 0.5 ml를 각각 2 ml의 top agar에 혼합하여 평판을 제작하였다. 처리가 끝난 후 top agar가 굳으면 평판을 뒤집어 37℃에서 약 48시간 배양한 후 복귀돌연변이 집락을 계수하였다.
- 시험물질 적량을 멸균생리식염수로 단계별 희석을 하여 각 농도의 용액을 조제하였다. 음성대조물질로는 시험물질의 조제에 사용한 멸균생리식염수를 사용하였다.
- 시험물질은 멸균생리식염수에 용해하여 처리하였으며 , 대사 활성계 적용(+s)및 미적용(-S)하에 5단계의 농도군과 음성 및 양성대조군으로 시험군을 구성해 본 시험을 실시하였다. 시험에 사용한 5개 균주의 생균수는 파장 600 nm에서 흡광도에 의한 측정 결과 0.
- 본시험의 처리 최고농도를 결정함과 아울러 복귀돌연변이 유발성 여부도 알아보기 위해 예비시험을 실시하였다. 예비 시험에서는 대사활성계 적용(+S) 및 미적용 (-S)하에 본시험 에 준하여 시험하되 농도군당 1개의 평판을 사용하였으며, 시험물질 1.6, 8, 40, 200, 1,000, 2, 500 및 5,000 μg/plate 와 음성 및 양성대조군으로 시험군을 구성하여 시험하였다.
- 위 결과를 근거로 하여, 각각의 균주에 대하여 5000 ㎍ /plate를 본시험의 최고농도로 하고, 공히 공비를 3으로 한 5단계 농도군과 음성 및 양성대조군으로 시험군을 구성하여 본시험을 실시하였다.
- 음성대조군은 시험물질 용액 대신 부형제 0.1 ml를, 양성 대조군은 양^대조물질 용액을 동일한 방법으로 가하여 실시하였다. 각 평판의 구별을 위해 평판의 일정위치에 유성펜으로 시험번호, 균주명, 농도(기호), S-9 mix 처리여부 등을 기입하였다.
- 집락 계수시 각 평판의 기본 성장균층 (background lawn) 의 형성여부를 검사하였으며 오염 혹은 기타 이상의 발생여부를 점검하였다. 무균성 확인을 위한 평판에서는 미생물의 생장으로 인한 집락 생성 유무를 확인하였다.
- 항균성은 기본 성장균층이 엷어지거나 없어질 때 혹은 집락수가 음성대조군에 비해 현저하게 감소하는 것으로 판단하였다. 집락수의, 현저한 감소'에 대해서는 공통된 기준이 없으므로, 본 시험에서는 편의상 집락수가 음성대조군에서 나타난 집락 수 평균치의 50% 이하로 감소한 경우를 항균성으로 판단하였다.
- 2)에 접종해 shaking incubator(37℃, 200 rpm)에서 약 10시간 전에 배양하였으며, 전배양을 마친 균주는 시험에 사용할 때까지 실온에 보관하였다. 최소배지는 1.5% Bacto agar(Difco)와 Vogel- Bonner medium E 및 2% glucose를 함유한 것을 페트리디 쉬에 25 ml씩 분주해 사용하였으며, E. coli을 이용한 시험에는 위와 동일한 최소배지에 0.1% 트립토판액을 0.25 ml/ L로 첨가한 것을 사용하였다.
대상 데이터
- Salmonella 4개 균주는 Molecular Toxicology Inc.(lll Gibralter avenue, Annapolis, MD21401, USA)에서 시판하는 것을, E. coli WP2 uvrA 균주는 Dr. M.H.L Green(University of Sussex, Falmer, Brighton, UK)가 제공한 것을 사용하였다. 위 5개 균주들은 한국 화학연구원 부설 안전성 평가연구소를 경유하여 분양받은 것이며 모든 균주는 (주) 켐온 전임상연구센터에서 형질확인 후 계대배양한 것을 시험에 사용하였다.
- 배양한 균배양액 1 ml당 DMSO 90 μ1를 가하여 냉동보관용 바이알에 채워 액체질소 내에 냉동 보관하였으며, 형질이 확인된 균주의 mater plate를 제작, 시험에 사용하였다.
- 야생 산삼으로부터 유도한 산삼 배양근을 영양배지에서 4 주간 배양한 후 배양근을 수거하여 물로 3회 수세하고 45℃ 건조기에서 12시간 건조하였다. 건조된 산삼 배양근 1 kg에 대하여 1차 증류수 150 L(l:10)를 첨가하고 85℃의 수조에서 4시간 동안 추출하고 회전진공농축기를 사용하여 brix 60 이상으로 농축하여 산삼배양 추출물을 조제하였으며, 냉장 보관하면서 시험에 사용하였다.
- 염기쌍치환형 (base-pair substitution type) 돌연변이 검색을 위해서 Salmonella typhimurium TA 100, TA1535 및 E. coli WP2 uvrA를, frame-shift형 돌연변이 검색을 위해서 TA98, TA1537 등 모두 5개 균주를 사용하였다. Salmonella 4개 균주는 Molecular Toxicology Inc.
- L Green(University of Sussex, Falmer, Brighton, UK)가 제공한 것을 사용하였다. 위 5개 균주들은 한국 화학연구원 부설 안전성 평가연구소를 경유하여 분양받은 것이며 모든 균주는 (주) 켐온 전임상연구센터에서 형질확인 후 계대배양한 것을 시험에 사용하였다.
- 시험물질 적량을 멸균생리식염수로 단계별 희석을 하여 각 농도의 용액을 조제하였다. 음성대조물질로는 시험물질의 조제에 사용한 멸균생리식염수를 사용하였다. 양성 대조물질은 sodium azide(SA)는 멸균 증류수에 용해하였으며, 2- aminoanthracene(2-AA), 9-aminoacridine(9-AA) 및 4-nitro- quinoline-l-oxide (4NQO)는 DMSO에 용해하여 조제하였다.
이론/모형
- 균주 유전자형 확인을 위해 Salmonella typhimurium TA 균주들의 경우는 histidine 요구성 여부, uvrB mutation 유 지 여부, R-factor 유지 여부, rfa 돌연변이의 유지여부, spontaneous revertant의 수 등을 검사하였고, E. coli WP2 uvrA 균주에서는 트립토판 요구성 여부, uvrA mutation 유 지 여부, spontaneous revertant의 수 등을 Maron and Ames방법2)에 준하여 확인하였다.
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시험방법
시험물질의 처리는 direct plate incorporation 방법으로 하였다. 고압증기 멸균한 top agar를 dry bath에서 45℃로 예 열한 멸균 tube에 2 ml씩 분주한 다음 시험물질 용액 0.
성능/효과
- 그 결과 대사활성계 적용 및 미적용시 공히 모든 균주에 서 최고농도인 5,000 |ig/plate까지 집락이 관찰되었으며, 음성대조군에 비해 집락수의 현저한 증가나 감소는 관찰되지 않았고, 모든 농도군에서 시험물질 용액이 top agar와 혼합 할 때 혼탁은 생성되지 않았으며 기타 특이점도 관찰되지 않았다.
- 모든 균주에 있어서 시험물질을 처리한 5개 농도군 이상 에서 집락 계수가 가능하였고, 최고농도에서 항균성은 관찰되지 않았으며, 최고농도에 이르기까지 집락수의 현저한 증가 또한 관찰되지 않았다.
- 본시험의 결과는 각 농도군당 3개의 평판으로부터 얻은 집 락수의 평균±표준편차(Mean±S.D.) 및 음성대조군에 대한 증가 배수로 나타냈으며, 집락수의 실측치도 아울러 나타내었다.
- 시험물질은 멸균생리식염수에 용해하여 처리하였으며 , 대사 활성계 적용(+s)및 미적용(-S)하에 5단계의 농도군과 음성 및 양성대조군으로 시험군을 구성해 본 시험을 실시하였다. 시험에 사용한 5개 균주의 생균수는 파장 600 nm에서 흡광도에 의한 측정 결과 0.3~3.9xl09/ml이었다.
- 예비독성시험에서 결정된 5,000 jig/plate를 최고농도로 하고 5단계 농도군(5,000, 1, 667, 556, 185 및 62 eg/plate)과 음성, 양성대조군으로 시험군을 설정하여 시험한 결과 대사활성계 적용 여부와 관계없이 산삼배양추출물은 5개 시험 균주 모두에서 시험물질을 처리한 모든 군에서 양^ 판정 기 준을 만족할 정도의 집락수의 증가는 나타나지 않아서 음성으로 판정하였다.
- 이상의 결과를 종합할 때, 시험물질 산삼배양추출물은 본 시험조건 하에 사용한 시험균주들의 복귀돌연변이를 유발하 지 않는 것으로 사료된다.
- 항균성은 기본 성장균층이 엷어지거나 없어질 때 혹은 집락수가 음성대조군에 비해 현저하게 감소하는 것으로 판단하였다. 집락수의, 현저한 감소'에 대해서는 공통된 기준이 없으므로, 본 시험에서는 편의상 집락수가 음성대조군에서 나타난 집락 수 평균치의 50% 이하로 감소한 경우를 항균성으로 판단하였다.
후속연구
- 2)식물 세포 및 조직의 대량배양을 위한 생물반응기에 관한 연구가 최근 집중적으로 수행되고 있다.7)이러한 생물반응기를 이용하여 배 양된 산삼배양근은 산삼에 비해 재배 기간이 단축되며, 완전히 멸균된 환경에서 대량으로 배양됨으로서 건강보조식품 원료 및 의약품 원료로 사용할 수 있다.
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