피부세포 증식에 관여하는 실크단백질 탐색 Effect of Bombyx mori, Antheraea Yamamai and Antheraea pernyi Silk Protein in Skin Fibroblast Cell Proliferation After Injury원문보기
가잠과 천잠 및 작잠의 실크 단백질 분획물로부터 피부섬유아세포에 대한 증식 효과를 알아본 결과 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 1. 가잠 및 천${\cdot}$작잠 단백질로부터 다양한 분자량대의 실크 단백질을 순수 분리 분획화 하여 사람 피부세포(human skin fibroblast; CCD-986sk)에 기계적 상처를 준 후 처리한 결과, 평균분자량(Mw)이 300-500 및 950-1500 분획군이 세포 증식에 뛰어난 효과가 있음을 확인${\cdot}$선발하였다. 2. 가잠의 경우 평균 분자량 590(BM-1), 1400(BM-2)에서, 천잠은 340(AY-1), 940(AY-2), 작잠에서는 300(AP-1), 1440(AP-2)에서 $10\;{\mu}g/ml$의 농도로 처리했을 경우 피부섬유 아세포의 증식이 무처리구에 비하여 40% 이상의 증식 효과를 갖았다. 또한 유효 농도 범위에서 대식세포인 RAW 264.7 세포에 대해서는 세포독성을 지니지 않았다. 3. 아미노산 조성에 있어 저분자량 AY-1 분획의 전아미노산 및 유리아미노산은 Tyr 함량이 매우 높게(25-48 g/100g)나타났으며, 작잠의 저분자 분획인 AP-1에서는 Lys 함량이 높게(5.2 g/100g) 나타남을 확인하였다. 4. 동일한 실크 단백질일 경우 저분자량 분획물에서 피부 세포 증식에 좀 더 효과적이였다.
가잠과 천잠 및 작잠의 실크 단백질 분획물로부터 피부섬유아세포에 대한 증식 효과를 알아본 결과 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 1. 가잠 및 천${\cdot}$작잠 단백질로부터 다양한 분자량대의 실크 단백질을 순수 분리 분획화 하여 사람 피부세포(human skin fibroblast; CCD-986sk)에 기계적 상처를 준 후 처리한 결과, 평균분자량(Mw)이 300-500 및 950-1500 분획군이 세포 증식에 뛰어난 효과가 있음을 확인${\cdot}$선발하였다. 2. 가잠의 경우 평균 분자량 590(BM-1), 1400(BM-2)에서, 천잠은 340(AY-1), 940(AY-2), 작잠에서는 300(AP-1), 1440(AP-2)에서 $10\;{\mu}g/ml$의 농도로 처리했을 경우 피부섬유 아세포의 증식이 무처리구에 비하여 40% 이상의 증식 효과를 갖았다. 또한 유효 농도 범위에서 대식세포인 RAW 264.7 세포에 대해서는 세포독성을 지니지 않았다. 3. 아미노산 조성에 있어 저분자량 AY-1 분획의 전아미노산 및 유리아미노산은 Tyr 함량이 매우 높게(25-48 g/100g)나타났으며, 작잠의 저분자 분획인 AP-1에서는 Lys 함량이 높게(5.2 g/100g) 나타남을 확인하였다. 4. 동일한 실크 단백질일 경우 저분자량 분획물에서 피부 세포 증식에 좀 더 효과적이였다.
We have studied the effect of silk proteins to the cell proliferation of human skin fibroblast cells (CCD-986sk) after injury. Silk proteins were extracted treatment with enzyme or NaOH solution from raw silk and culled-cocoon shell of Bombyx mori, Antheraea yamamai and A. pernyi. The cell prolifera...
We have studied the effect of silk proteins to the cell proliferation of human skin fibroblast cells (CCD-986sk) after injury. Silk proteins were extracted treatment with enzyme or NaOH solution from raw silk and culled-cocoon shell of Bombyx mori, Antheraea yamamai and A. pernyi. The cell proliferation after in vitro injury are increased in treatment by Bombyx mori (BM-1,2), Antheraea yamami (AY-1,2) and A. pernyi (AP-1,2). The silk protein fractions-treated cells exhibited proliferation in a dose dependent between $0.1\;{\mu}g/ml$ and $10\;{\mu}g/ml$. But, the macrophage, RAW 264. 7 cell viability was unaffected by the silk protein fractions by MTT assay. The molecular weights of the silk protein fractions were from 300-600 to 900-1500. These results results that the silk protein fractions may function through skin fibroblast proliferation.
We have studied the effect of silk proteins to the cell proliferation of human skin fibroblast cells (CCD-986sk) after injury. Silk proteins were extracted treatment with enzyme or NaOH solution from raw silk and culled-cocoon shell of Bombyx mori, Antheraea yamamai and A. pernyi. The cell proliferation after in vitro injury are increased in treatment by Bombyx mori (BM-1,2), Antheraea yamami (AY-1,2) and A. pernyi (AP-1,2). The silk protein fractions-treated cells exhibited proliferation in a dose dependent between $0.1\;{\mu}g/ml$ and $10\;{\mu}g/ml$. But, the macrophage, RAW 264. 7 cell viability was unaffected by the silk protein fractions by MTT assay. The molecular weights of the silk protein fractions were from 300-600 to 900-1500. These results results that the silk protein fractions may function through skin fibroblast proliferation.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 가잠과 천잠, 작잠 실크 단백질 로부터 다양한 분자량대의 실크 단백질 분획물을 얻어 피 부 섬유 아세포와 염증세포의 증식에 미치는 효과를 통해 피부 재생과 반흔 형성 감소의 약제로의 개발 가능성을 알아보았다.
이러한 결과로 미루어 가잠뿐 아니라 야잠과 천잠의 실크단백질도 우수한 피부세포 증식 효과를 갖고 있음이 확인되었다. 향후 실크 단백질을 이용한 인조피부 및 치료제로서의 가능성을 세포 단계에서 확인하였다.
제안 방법
CCD-986sk 세포주를 6 well plate에 5X 105 cell/ml로 하여 4 ml씩 분주하여 3일 동안 동안 배양하여 부착시킨후 바닥을 멸균된 이쑤시개를 사용하여 십자형 모양의 상처 를 낸 후 새로운 배지로 교환한 후 시료를 농도별로 처 리하였다. 3일 간격으로 시료와 새로운 배지로 교환하여 14일 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하며 세포 증 식을 관찰하였다.
RAW 264.7 세포는 96 wll plate에 1X105 cell/ml로 하여 100 ul씩 분주 후 농도별로 실크 단백질을 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 48시간 배양 후 세포 증식을 관찰하였다.
가잠과 천작, 작잠고치로부터 추출한 단백질은 분자량500 (Mw 500) 내외와 1,000 (Mw 1,000)내외에서 각기 분획화하여 상처후 피부세포 증식에 효과적인 분획물을 선 발하였다. 피부 섬유아세포에 기계적 상처를 준 후 시료를 농도별로 (0.
, 2000)등의 방법에 의해 제조 된 용액을 Sephadex G-25 Gel Filtration Chromatography (Pharamacia, GradiFrac, UV-1 detection, Sweden) 장치를 이용하여 피브로인과 염 을 완전히 분리하였다. 그 후, 3%(w/w>의 단백질 분해요 소를 첨가 및 효소 활성 극대화 처리를 한 후, 55℃에서 24시간 가수분해를 실시하였다. 그 후, 10(TC에서 5분간 효소의 불활성 처리를 하여 잔유물을 제거한 다음, 0.
Ltd) 가수 분 해의 경우, 액비 1:50의 조건하에 210℃ 및 110。(2에서 12 시간동안 가수 분해를 행하였다. 그 후, 중화 과정을 거친 후 Quick Filter (Microcloth Q-Filtration, Calbiochem, USA) 로 1차 및 Sephadex G-10 Gel Filtration Chromatography (Pharamacia, GradiFrac, UV-1 detection, Sweden) 장치를이용하여 염을 분리하였다. 효소 가수분해의 경우도 여 (Yeo et al.
위에서 얻어진 순수 실크 단백질의 용해는 여 등(2000) 의 방법에 따라 제조하였다. 두 가지 가수분해를 행하였 는데 , 염산 가수분해와 효소 가수분해를 행하였다. 먼저 ,염산(2N Guarantee! reagent, Junsei chem.
세포의 증식률은 methylthiazol-2-yl-2.5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 시약을 이용하여 측정하였다.
피부세포의 증식에 효과적인 가잠과 천잠 및 작잠 실크단백질의 분자량은 gel permeation chromatography (GPC, VISCOTEKX- 사용하였다. 측정온도는 37℃, 유속 5 ml/ min, TSK-CELL 컴럼을 사용하였고, pollulan standard series을 표준물질로 하여 검량선을 구하였다.
피부 섬유아세포 증식에 효과적인 실크단백질에 대하여 염증유발에 관련된 대식세포인 RAW 264.7에 대한 세포 독성을 확인하였다. 피부세포 증식에 효과적 이였던 0.
가잠과 천작, 작잠고치로부터 추출한 단백질은 분자량500 (Mw 500) 내외와 1,000 (Mw 1,000)내외에서 각기 분획화하여 상처후 피부세포 증식에 효과적인 분획물을 선 발하였다. 피부 섬유아세포에 기계적 상처를 준 후 시료를 농도별로 (0.1, 1, 10 ng/ml) 처리한 실험군과 무처리 군을 대조군으로 하여 14일간 배양하여 증식률을 구하였 다(Natulia et al., 2001). 그림 1은 대조군의 세포 증식을 100으로 한 후 상대적 인 세포 증식률을 표시하여 가잠과, 천잠, 작잠에서 각가 2개의 분획물을 선발하였다.
대상 데이터
얻어진 용액은 Quick Filter (Microcloth Q-Filtration, Calbiochem, USA)로 잔유물을 제거한 후 Sephadex G-10 Gel Filtration Chromatography (Pharamacia, GradiFrac, UV-1 detection, Sweden) 장치를 이용하여 순수 저분자화 된 작잠 및 천잠의 수용액을 얻었다. 그 후 얻어진 각 액상 시료를 챔버내 온도가 -5℃내외를 유지 하는 감압 건조 장치(삼원 냉열사, Model : Vacuum Freeze Dryer)를 이용하여 분말을 얻어 시료로 사용하였다.
본 연구에 사용한 원료는 가잠mori) 및 천잠 (Antheraea yamamai) 및 작잠pernyi) 고치를 사용하였다. 가잠의 정련은 액비 50: 1에서 5wt%의 마르셀 비누 및 3wt%의 Na2CO3 혼합 용액에 넣어 90。(:에서 40 분간 2회 처리한 후, 증류수로 3번 정도 같은 작업을 반 복하여 중분히 수세하여 사용하였다.
피부 섬유 아세포주인 CCD-986sk 세포와 염증유발 세 포인 대식세포로 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행으로 부터 분양 받아 사용하였으며, 10% FBS, 1% penicillin/ streptomycin을 포함하고 있는 DMEM으로 37℃, 5% CO2배양기에서 계대배양하여 실험에 사용하였다.
이론/모형
위에서 얻어진 순수 실크 단백질의 용해는 여 등(2000) 의 방법에 따라 제조하였다. 두 가지 가수분해를 행하였 는데 , 염산 가수분해와 효소 가수분해를 행하였다.
피부세포의 증식에 효과적인 가잠과 천잠 및 작잠 실크단백질의 분자량은 gel permeation chromatography (GPC, VISCOTEKX- 사용하였다. 측정온도는 37℃, 유속 5 ml/ min, TSK-CELL 컴럼을 사용하였고, pollulan standard series을 표준물질로 하여 검량선을 구하였다.
그 후, 중화 과정을 거친 후 Quick Filter (Microcloth Q-Filtration, Calbiochem, USA) 로 1차 및 Sephadex G-10 Gel Filtration Chromatography (Pharamacia, GradiFrac, UV-1 detection, Sweden) 장치를이용하여 염을 분리하였다. 효소 가수분해의 경우도 여 (Yeo et al., 2000)등의 방법에 의해 제조 된 용액을 Sephadex G-25 Gel Filtration Chromatography (Pharamacia, GradiFrac, UV-1 detection, Sweden) 장치를 이용하여 피브로인과 염 을 완전히 분리하였다. 그 후, 3%(w/w>의 단백질 분해요 소를 첨가 및 효소 활성 극대화 처리를 한 후, 55℃에서 24시간 가수분해를 실시하였다.
성능/효과
그림 1은 대조군의 세포 증식을 100으로 한 후 상대적 인 세포 증식률을 표시하여 가잠과, 천잠, 작잠에서 각가 2개의 분획물을 선발하였다. 가잠에서 선발한 실크단백질은 0.1 μg의 농도에서는 증식률이 크게 증가하지 않았으나, 10 μg의 농도에서는 무처리군에 비하여 40% 이상 증가되었으며, 분자량 500 이내의 BM-1이 다소 분자량이 큰 BM-2 보다 증가율이 높았다. 천잠 의 경우 분자량 500 이내의 AY-1은 0.
나타내었다. 아미노산 조성에 있어 저분자량대 인 천잠의 AY-I 분획물의 전아미노산 및 유리아미노산 모두 Tyr 함량이 매우 높게 (25-48 g/100g) 나타났으며, 작잠 의 AP-1 분획물에서는 Lys 함량이 높게 (5.2 g/100g) 나타 남을 확인 하였다.
이는 상처 후 실크 단백질이 섬유아세포의 증식을 촉진하여 콜라젠의 생성을 유도하여 피부 재생이 빠르게 진행되었음을 시사한다. 이러한 결과로 미루어 가잠뿐 아니라 야잠과 천잠의 실크단백질도 우수한 피부세포 증식 효과를 갖고 있음이 확인되었다. 향후 실크 단백질을 이용한 인조피부 및 치료제로서의 가능성을 세포 단계에서 확인하였다.
동일한 가 잠 단백질일 경우 분자량이 좀더 작은 BM-1에서 증식 효과가 다소 높게 나타남을 알 수 있었으며, 이는 천잠과 작잠에서도 비슷한 경향을 띄었다. 이러한 결과에서 분자 량이 작은 분획물이 피부 세포 증식에 좀 효과적임이며 또한 분자량의 차이는 단백질의 기능성에 영향을 줄 수 있음은 시사한다.
이러한 실험 결과들에서 피부 세포의 재생에 있어 가잠 은 물론 천잠과 작잠의 실크 단백질이 매우 효과적이었 으며 특히 저분자량대의 분획물들이 뛰어난 효과와 함께 다른 세포에 대한 세포독성도 갖지 않는다는 것을 확인 하였다. 이는 향후 피부 외상이나 화상 후 치료제로서의 가능성과 함께, 실크 단백질의 기능성과 구조의 상관관계를 밝힐 수 있는 중요한 연구의 기초 자료로서 활용을 기 대한다.
피부세포 증식에 효과적인 가잠의 실크 단백질은 여 등 (1999)의 방법과 동일하게 각각의 성분을 측정하였다. 평균 분자량(Mw)이 300-500 및 950-1500 분획군이 세포 증 식에 뛰어난 효과가 있음을 확인되었다(표 1). 동일한 가 잠 단백질일 경우 분자량이 좀더 작은 BM-1에서 증식 효과가 다소 높게 나타남을 알 수 있었으며, 이는 천잠과 작잠에서도 비슷한 경향을 띄었다.
후속연구
, 1991). 대식세포에서 실크단백질 처리 후 각각의 사이토카인 발현에 대한 구체적인 연구의 필요성이 요구된다.
이러한 실험 결과들에서 피부 세포의 재생에 있어 가잠 은 물론 천잠과 작잠의 실크 단백질이 매우 효과적이었 으며 특히 저분자량대의 분획물들이 뛰어난 효과와 함께 다른 세포에 대한 세포독성도 갖지 않는다는 것을 확인 하였다. 이는 향후 피부 외상이나 화상 후 치료제로서의 가능성과 함께, 실크 단백질의 기능성과 구조의 상관관계를 밝힐 수 있는 중요한 연구의 기초 자료로서 활용을 기 대한다.
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