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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 Ti에 세포독성이 보고되지 않은 Nb, Ta을 합금원소로 첨가하여 새로운 타이타늄 합금을 제조하고, 이 합금을 여러 가지 조건으로 공기 중에서 산화하여 산화 거동을 관찰하고, 산화조건이 이 합금의 이온용출 특성과 세포독성 등에 미치는 효과를 조사하여 현재 널리 사용되고 있는 생체용 재료와 비교 검토하였다.
- 본 연구에서는 L929 섬유아세포(fibroblast)의 세포독성을 관찰하였다. 세포는 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum)을 포함하는Dulbecco`s Modified Eagle`s Medium(DMEM)에 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였고 세포가 80% 정도 증식되면 세포수를 측정하였다.
제안 방법
- 실험에 사용된 Ti-6Al-4V, Ti-10Ta-10Nb 합금은 99%이상의 순도를 지닌 각각의 원소를 무게비로 장입하여 소모식 진공 아크용해로(Consumable Vacuum Arc Furnace)에서 VAR(Vacuum Arc Remelting)법으로 제조하였으며, 균질화처리 및 열간 가공을 거쳐 제조한 시편에 대하여 각각 미세조직, 내식성 및 세포독성에 관한 실험을 수행하였다.
- 이상의 합금원소들은 용해하기 전에 시료 표면의 산화피막과 불순물을 제거하기 위해 5%HF+95%H2O용액에서 5분간 산세(pickling)한 후 알코올 용액에서 초음파 세척하였다. 시료의 용해는 먼저 장입재료를 비소모성 용해방법으로 용해하여 작은 막대 형태로 만들고, 이들을 접합하여 소모성 전극을 제조한 후 소모성 아크 용해 방법으로 제조하였다. 비소모성 아크로에서는 균일한 합금을 얻기 위하여 -400㎜Hg의 Ar 분위기하에서 4회 이상 재용해를 실시하였다.
- 비소모성 아크로에서는 균일한 합금을 얻기 위하여 -400㎜Hg의 Ar 분위기하에서 4회 이상 재용해를 실시하였다. 미세조직 관찰을 위한 시험편은 고속정밀 절단기를 이용하여 절단한 후 2000grit의 SiC 연마지까지 단계적으로 습식 연마하고, 최종적으로 1㎛의 알루미나 분말로 마무리 연마한 후 초음파 세척하였다. 준비된 시편은 Keller‘s Reagent인 2㎖HF+3㎖HCl+5㎖ HNO3+190㎖H3O의 혼합용액으로 에칭한 후 광학현미경(Japan, Olympus Co.
- 미세조직 관찰을 위한 시험편은 고속정밀 절단기를 이용하여 절단한 후 2000grit의 SiC 연마지까지 단계적으로 습식 연마하고, 최종적으로 1㎛의 알루미나 분말로 마무리 연마한 후 초음파 세척하였다. 준비된 시편은 Keller‘s Reagent인 2㎖HF+3㎖HCl+5㎖ HNO3+190㎖H3O의 혼합용액으로 에칭한 후 광학현미경(Japan, Olympus Co., PMG-3)을 이용하여 미세조직을 관찰하였다.
- 온도에 따른 합금의 산화거동을 알아보기 위해 TGA(Thermogravimetric Analysis, TA Instruments Co., TGA 2950) 열중량분석기를 이용하여 산화에 따른 중량변화를 측정하였다. 시편의 크기는 1×0.
- 온도 변화에 따른 산화막의 조성과 특성을 알아보기 위해 관상로를 이용하여 400℃, 650℃ 및 750℃에서 30분간 등온산화를 실시하였다. 관상노 내에 유입되는 공기 중의 수분은 산화양상에 영향을 미칠 수 있으므로 제올라이트(zeolite)가 충전된 건조탑에 공기를 통과시켜 수분을 제거하였다.
- 온도 변화에 따른 산화막의 조성과 특성을 알아보기 위해 관상로를 이용하여 400℃, 650℃ 및 750℃에서 30분간 등온산화를 실시하였다. 관상노 내에 유입되는 공기 중의 수분은 산화양상에 영향을 미칠 수 있으므로 제올라이트(zeolite)가 충전된 건조탑에 공기를 통과시켜 수분을 제거하였다. 관상노 내 공기 유입량은 약 10/min.
- 의 조건으로 일정하게 하였다. 산화표면의 형상은 주사전자현미경 (Phillips, XL30SFEG, FE-SEM)을 이용해 관찰하였다.
- 생체용으로 사용되는 재료의 표면특성은 생체 적합성과 깊은 관련이 있으므로 표면의 화학조성, 산화물 형태 및 결합특성을 이해하는 것이 중요하다. 따라서 타이타늄 합금의 표면특성을 전자분광화학분석기 (ESCA ; VG Sci. ESCA Lab 200R)을 이용하여 분석하였다.
- 생체용 금속재료는 인체 내에 이식되는 경우 금속이온의 체내 용출로 인해 주위 세포조직에 영향을 미치거나, 장기간 사용에 의해 해리 되는 현상이 발생될 수 있다. 따라서 본 연구에서는 0.9% NaCl, 1% Lactic Acid ,5% HCl 용액에서 시험편을 각각 35일간 침지시킨 후 ICP분석 장비(Jobin Yvon, JY 38 plus)를 이용하여 수용액 중에 용출된 금속이온을 정량분석하여 합금의 용출특성을 평가하였다. 이때 산화막이 용출특성에 미치는 영향을 조사하기 위해 650℃에서 30분 산화처리하여 비교하였다.
- 9% NaCl, 1% Lactic Acid ,5% HCl 용액에서 시험편을 각각 35일간 침지시킨 후 ICP분석 장비(Jobin Yvon, JY 38 plus)를 이용하여 수용액 중에 용출된 금속이온을 정량분석하여 합금의 용출특성을 평가하였다. 이때 산화막이 용출특성에 미치는 영향을 조사하기 위해 650℃에서 30분 산화처리하여 비교하였다. 시편은 20㎖ 용량의 바이알(vial)병에 넣고 부식용액을 10㎖ 채운 후 마개를 닫아 외부로부터의 산소 유입을 차단시켰으며, 시험이 끝난 시편은 꺼내어 광학현미경(Olympus Co.
- 이때 산화막이 용출특성에 미치는 영향을 조사하기 위해 650℃에서 30분 산화처리하여 비교하였다. 시편은 20㎖ 용량의 바이알(vial)병에 넣고 부식용액을 10㎖ 채운 후 마개를 닫아 외부로부터의 산소 유입을 차단시켰으며, 시험이 끝난 시편은 꺼내어 광학현미경(Olympus Co., PMG-3)으로 표면을 관찰하였다.
- 본 연구에서는 L929 섬유아세포(fibroblast)의 세포독성을 관찰하였다. 세포는 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum)을 포함하는Dulbecco`s Modified Eagle`s Medium(DMEM)에 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였고 세포가 80% 정도 증식되면 세포수를 측정하였다. 조직배양용 폴리스틸렌접시(96-well plate)의 각 well에 2×104 cell을 분주하고 각 추출 희석액을 100㎕ 씩 첨가하였다.
- USA)용액을 처리하고 4시간 동안 동일한 환경에서 배양하였다. 이 과정에서 빛을 차단하여 MTT 처리효과를 증대하고 배양 후 세포배양 상층액을 제거하여 DMSO와 Glysine buffer를 차례로 첨가한 후 570㎚의 파장에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 비교 분석하였다.
- <그림 5>는 Ti-6Al-4V 합금과 Ti-10Ta-10Nb 합금이 생체에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 세포배양액에 시편 추출액을 노출하여 48 시간 배양한 후 위상차 현미경 (Inverted microscope)을 이용하여 세포의 형태학적 변화를 관찰한 것이다. 그림에서 (a, b)는 control의 경우로 세포자체만을 배양한 것이며, (c, d)와 (e, f)는 각각 650℃와 750℃에서 30분 동안 산화시킨 시편에 배양한 것이다.
- 현재 생체용 재료로 널리 사용되고 있는 Ti-6Al-4V합금과 본 연구에서 VAR 법으로 제조한 Ti-10Ta-10Nb합금에 대하여 미세조직, 산화특성, 세포독성을 평가한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
- 시료용 합금을 제조하기 위한 Ti은 판상형태의 ASTM grade 2 CP Ti을 사용하였다. V, Al, Nb은 칩 형태의 시료를 사용하였으며, 고융점 금속인 Ta의 경우 용해를 용이하게 하기 위해 분말형태의 시료를 얇은 박판 형태의 칩으로 성형하여 사용하였다.
- 시료용 합금을 제조하기 위한 Ti은 판상형태의 ASTM grade 2 CP Ti을 사용하였다. V, Al, Nb은 칩 형태의 시료를 사용하였으며, 고융점 금속인 Ta의 경우 용해를 용이하게 하기 위해 분말형태의 시료를 얇은 박판 형태의 칩으로 성형하여 사용하였다. 이상의 합금원소들은 용해하기 전에 시료 표면의 산화피막과 불순물을 제거하기 위해 5%HF+95%H2O용액에서 5분간 산세(pickling)한 후 알코올 용액에서 초음파 세척하였다.
- 이렇게 추출액에 노출한 세포를 37℃, 5% CO2 환경에서 48시간동안 배양하였다. 대조군으로는 신선한 배양액에 노출된 L929세포를 이용하였다. 48시간동안 배양된 세포에 Methylthiazoletetrazolium(MTT:Sigma.
성능/효과
- 13g으로 두 배 이상의 산화중량증가가 있었음을 알 수가 있다. 이와 같은 결과를 통하여 전반적으로 Ti-6Al-4V 합금에 비해 Ti-10Ta-10Nb 합금의 내산화성이 우수함을 알 수 있다. 이와 같은 결과는 Ti-10Ta-10Nb 합금의 경우 내산화성 원소인 Nb가 산화속도를 늦추는 역할을 한 것으로 생각되며, 이는 Peiying(2000)과 Yoshihara(1995)등이 Ti-5Nb의 합금에서 Nb가 첨가됨으로써 산화 중량증가를 감소시킬 수 있다고 제시한 결과와 일치한다.
- <그림 6>은 시편 추출액에 대해 MTT를 처리하여 세포의 Mitochondria Innermembrane에 존재하는 Succinate dehydrogenase의 활성도를 측정하여 세포의 생존율을 비교한 것으로 산화시키지 않은 시편의 경우 두 합금 모두 73%의 생존율을 보였으나 산화 처리를 한 시편에서는 Ti-10Ta-10Nb합금의 경우 그 생존율이 650℃의 산화온도까지는 증가되었으며, 반면에 Ti-6Al-4V 합금의 경우는 산화막을 형성시키면 오히려 그 생존율이 낮아지는 양상을 보여주고 있다. 이상의 연구 결과로부터 Ti-10Ta-10Nb합금에 산화막을 형성시키면 Ti-6Al-4V 합금보다 세포안정성이 높음을 확인 할 수 있었으며, 그 결과 생체 내에 식립되었을 때 골 유착 형성에 유리할 것으로 판단된다.
- <그림 6>은 시편 추출액에 대해 MTT를 처리하여 세포의 Mitochondria Innermembrane에 존재하는 Succinate dehydrogenase의 활성도를 측정하여 세포의 생존율을 비교한 것으로 산화시키지 않은 시편의 경우 두 합금 모두 73%의 생존율을 보였으나 산화 처리를 한 시편에서는 Ti-10Ta-10Nb합금의 경우 그 생존율이 650℃의 산화온도까지는 증가되었으며, 반면에 Ti-6Al-4V 합금의 경우는 산화막을 형성시키면 오히려 그 생존율이 낮아지는 양상을 보여주고 있다. 이상의 연구 결과로부터 Ti-10Ta-10Nb합금에 산화막을 형성시키면 Ti-6Al-4V 합금보다 세포안정성이 높음을 확인 할 수 있었으며, 그 결과 생체 내에 식립되었을 때 골 유착 형성에 유리할 것으로 판단된다.
- 1. TGA 분석 결과, Ti-6Al-4V합금은 650℃ 이상에서 Ti-10Ta-10Nb합금은 700℃이상에서 각각 지수적인 산화가 진행되었다.
- 2. XPS 분석결과, Ti 합금이 공기 중에서 산화에 따른 생성물은 TiO2와 Al2O3임을 알 수 있었다.
- 3. Ti-10Ta-10Nb합금 표면에 산화막을 형성 시킨 시편은 Ti-6Al-4V합금 표면에 산화막을 형성시킨 시편보다 낮은 세포독성을 나타내었다.
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