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문제 정의
- 그래서 Cocker[5] 등은 발효기질에 따라 차 이느 있지만 구연산 생산 뿐만 아니라 균체증식에 미량의 금속이온이 중요한 역할을 한다고 보고하였다. 따라서 본 연구에서는 주정공장에서 배출되어 주된 수질오염원이 되고 있는 타피오카 주정 증류 폐기물을 발효기질로 해서 A. niger 균주를 사용하여 진탕배양기에서 배양온도, 초기 pH, NHNO3 농도, KH2PO4농도 Mn»농도 및 저분자 알코올류의 첨가물에 따른 구연산 생산의 영향 등의 제반 고찰을 통하여 주정 증류 폐기물의 양을 줄이는 동시에 구연산을 생산시킴으로서 폐수처리와 더불어 구연산을 생산하는 공정의 개발에 대한 기초연구를 수행하였다.
- 주정 증류 폐기물을 원료로 하여 구연산을 생산할 경우에는 배지 내의 무기염이 존재하므로 저분자 알코올류 등의 구연산 생산 촉진제를 첨가하여 구연산 생성을 촉진시킬 수 있을 것으로 생각되었다. 본 실험에서는 타피오카 주정 증류 폐기물을 기본 발효기질로 하여methanol, ethanol, isopropanol 및 u-propanol의 첨가가 구연산발효에 미치는 영향을 조사하였다. 메탄올의 농도를 각각 0, 1, 2, 3 및 4% (v/v)가 되도록 조절하여 A.
제안 방법
- 25 g의 3, 5- Dinitrosalicylic acid와 Rochelle Salt 75 g을 2 M NaOH (4 g NaOH를 5 ml 증류수에 녹임) 50 ml에 첨가하여 녹인 후, 증류수로 250 ml가 되게 희석해서 DNS시약을 만든다. 1 ml의 시료에 DNS 시 약 1 ml를 혼합하여 lOOC에서 10분 동안 가열하여 발색시킨 후, 실온으로 급냉하여 570 nm에서 자외선 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하고 그에 따른 환원당의 농도를 구하였다.
- 건조균체의 중량 측정 방법 -균체 건조 무게의 측정은 배양액중에서 시료를 취하여 원심분리한 후, 침전된 균체를 다시 0.85% NaCl 용액으로 2〜3번 세척하여 원심분리하고, 증류수로 다시 2〜3번 세척하여 105°C에서 24시간 건조한 다음, 데시케이터에서 30분간 방냉하여 무게를 측정하였다.
- 구연산 및 균체생산에 있어서 pH의 영향을 조사하기 위하여 타피오카 주정 증류 원 폐기물 (pH 4.3)을 1 N NaOH및 1 N HC1 를 사용하여 초기 pH를 2, 3, 5, 6으로 조절하여 A. niger ATCC 9142 균주를 30 °C에서 10일간 발효시켜 발효시간에 따른 구연산 및 균체농도를 측정하여 비교한 결과를 Fig. 3과 4에 나타내었다. Fig.
- 본 실험에서는 타피오카 주정 증류 폐기물을 기본 발효기질로 하여methanol, ethanol, isopropanol 및 u-propanol의 첨가가 구연산발효에 미치는 영향을 조사하였다. 메탄올의 농도를 각각 0, 1, 2, 3 및 4% (v/v)가 되도록 조절하여 A. niger ATCC 9142 균주를 30°C에서 10일간 진탕배양하면서, 발효시간 및 메탄올 농도 변화에 따른 구연산 및 균체농도의 변화를 관찰하여 Fig. 11 및 12에 나타내었다. 균체농도의 변화는 Fig.
- 본 연구에서는 망간을 0, 0.0125, 0.025, 0.0375 및 0.05 g/1 로 첨가하여 A niger ATCC 9142 균주를 이용하여 30 °C에서 10일간 진탕배양하여 그 결과를 Fig. 9와 10에 나타내었다. Mi?+를 첨가하지 않았을 때는 구연산 농도가 6.
- 인산염의 첨가가 구연산 및 균체 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 타피오카 주정 증류 폐기물에 인산칼륨을 각각 0, 0.5, 1, 2 및 3 g/l를 첨가하여 A. niger ATCC 9142 균주를 30°C에서 10일간 진탕배양한 결과를 Fig. 7과 8에 나타내었다. 구연산의 농도는 인산칼륨을 첨가하지 않았을 때 6.
- 주정공장에서 배출되는 타피오카 주정 증류 폐기물을 발효기질로 하여 플라스크 진탕 배양기에서 A. niger 균주를 이용하여 폐기물 처리 및 구연산을 생산하는 실험에서 다음과 같은 결과를 얻었다. A.
- 37 g/1 로 가장 높았다. 질소원, 인산원 및 금속이온이 구연산 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 NH4NO3, KH2PO4 및 Mif+를 첨가한 결과 이들 첨가물들이 구연산 생산을 감소시켰고, methanol, ethanol, isopropanol 및 n-pro- panol의 첨가가 구연산 발효에 미치는 영향을 알아보기 위한 실험에서는 methanol과 ethanol의 첨가가 구연산 생성을 촉진시켰다.
- 전 배양액은 본 배양 배지 부피비의 2% 이내가 되도록 접종시켰다. 타피오카 주정 증류 폐기물을 발효기질로 사용하여 총환원당 농도가 50 g/1 가 되도록 농축한 후, 진탕배양기에서 플라스크 배양을 행하였다. 발효실험장치는 플라스크 진탕배양기(Philip Harris Co.
대상 데이터
- 주정 증류 폐기물의 성상을 연구하기 위해서 사용한 시료는 부산 소재의 주정 생산업체에서 나온 타피오카(tapioca) 주정 증류 폐기물로서 Table 1과 같은 구성성분으로 이루어져 있었다. 본 실험에서 사용한 균주는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 분양받은 A. niger ATCC 9142로서 균주의 활성을 유지하기 위하여 potato dextrose agar (PDA, Difco Lab., Detroit, U.S.A.) 배지에서 7일마다 한 번씩 계대 배양하였다. 전 배양은 300 ml의 진탕 플라스크에 폐액을 100 ml정도 넣고 면전을 한 후, 121 °C에서 15분간 멸균하여 실온으로 냉각한 다음 무균실에서 PDA 배지로부터 포자를 접종하여 30°C에서 200 rpm의 조건으로 진탕배양기에서 2일간 배양하였다.
- 주정 증류 폐기물의 성상을 연구하기 위해서 사용한 시료는 부산 소재의 주정 생산업체에서 나온 타피오카(tapioca) 주정 증류 폐기물로서 Table 1과 같은 구성성분으로 이루어져 있었다. 본 실험에서 사용한 균주는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 분양받은 A.
이론/모형
- 구연산의 분석 방법 -구연산 분석은 Marier와 Boulet 방법 [10]을 이용했다. 즉 1 ml의 시료에 1.
- 본 실험에 사용된 시료 분석법은 미국 공중보건협회의 표준시험법을 기준으로 하였으몌1], 측정 방법과 기기는 Table 2에 나타내었다.
- 환원당의 분석 방법 -환원당 분석은 Dinitrosalicylic acid (DNS) 법[3]에 의하여 측정했으며 이 방법은 0.25 g의 3, 5- Dinitrosalicylic acid와 Rochelle Salt 75 g을 2 M NaOH (4 g NaOH를 5 ml 증류수에 녹임) 50 ml에 첨가하여 녹인 후, 증류수로 250 ml가 되게 희석해서 DNS시약을 만든다. 1 ml의 시료에 DNS 시 약 1 ml를 혼합하여 lOOC에서 10분 동안 가열하여 발색시킨 후, 실온으로 급냉하여 570 nm에서 자외선 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하고 그에 따른 환원당의 농도를 구하였다.
성능/효과
- 9와 10에 나타내었다. Mi?+를 첨가하지 않았을 때는 구연산 농도가 6.09 g/1로 가장 많이 생산되었고 Mn2+의 농도가 증가함에 따라 구연산 농도는 감소하였으며 균체농도는 거의 일정하게 얻어졌다. 타피오카 주정증류 폐기물은 원자흡광 광도법 (Atomic Absorption Spectrometer, Model; Varian Spectra A-30)으로 분석한 결과 타피오카 주정 증류 폐기물 자체에 0.
- niger 균주를 이용하여 폐기물 처리 및 구연산을 생산하는 실험에서 다음과 같은 결과를 얻었다. A. niger ATCC 9142 균주를 사용하여 배양온도를 25°C, 30°C 및 35°C로 변화하여 발효하였을 때 구연산 농도는 30°C에서 6.09 g/1 로 최대가 되었으며, 플라스크 진탕 배양기의 배양 온도를 30笆로 유지하면서 초기 pH를 조절하여 발효를 행한 결과, pH 4.3인 원 폐수에서 구연산 생성량이 6.37 g/1 로 가장 높았다. 질소원, 인산원 및 금속이온이 구연산 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 NH4NO3, KH2PO4 및 Mif+를 첨가한 결과 이들 첨가물들이 구연산 생산을 감소시켰고, methanol, ethanol, isopropanol 및 n-pro- panol의 첨가가 구연산 발효에 미치는 영향을 알아보기 위한 실험에서는 methanol과 ethanol의 첨가가 구연산 생성을 촉진시켰다.
- 55 g/1로 가장 많이 생성되었으나 2% 이상에서는 오히려 구연산 농도가 감소함을 알 수 있었다. Fig. 13과 14에서 알 수 있는 바와 같이 구연산 및 균체농도는 첨가물을 전혀 첨가하지 않았을 때 각각 6.41, 6.2 g/1이고 메탄올을 첨가하였을 때에는 8.97, 7.95 g/1, 에탄올을 첨가하였을 경우에는 9.82, 9.6 g/1로 전혀 첨가하지 않았을 때보다는 메탄올이나 에탄올을 첨가하였을 때 균체 농도 및 구연산 생성량이 향상됨을 알 수 있었다. 이는 Scragg의 보고［11］와 같이 메탄올과 에탄올은 균체 증식 및 구연산 생성에 나쁜 영향을 미치는 중금속 물질의 작용을 저해시키고 미생물의 투과성을 증가시 키기 때문에 구연산 생산을 증가시키는 것으로 여겨진다.
- 3과 4에 나타내었다. Fig. 3에 나타난 바와 같이 초기 pH 변화에 따른 구연산 농도는 pH가 4.3인 타피오카 주정 증류 원폐기물에서 발효하였을 때 구연산 생성량이 8일에 6.37 g/1 로 가장 많았으며, pH가 4.3에서 멀어질수록 구연산 생성량이 급격히 줄어 듬을 알 수 있었다. pH변화에 따른 균체농도는 pH 2와 3에서는 거의 증가하지 않으나 pH 4에서부터 균의 생육이 급격히 증가하여 pH 5에서 10.
- 3에서 멀어질수록 구연산 생성량이 급격히 줄어 듬을 알 수 있었다. pH변화에 따른 균체농도는 pH 2와 3에서는 거의 증가하지 않으나 pH 4에서부터 균의 생육이 급격히 증가하여 pH 5에서 10.55 g/1 로 생육이 가장 좋았으며, 그 이상의 pH에서는 균의 생육이 거의 일정함을 알 수 있었다. 따라서 최적 초기 pH는 원폐수의 pH와 거의 일치함으로 공장 규모의 운전시에는 pH를 조절하지 않고 배양이 가능하다고 생각 된다.
- 37 g/1 로 최대치를 보이며 인산칼륨의 농도가 증가할수록 구연산 생성량이 감소하는 경향을 보여준다. 균체농도는 인산칼륨의 농도가 증가하여도 별다른 변화가 없었으나 인산칼륨의 농도가 높은 3 g/1 에서는 균체농도가 줄어 듬을 알 수 있었다.
- 11 및 12에 나타내었다. 균체농도의 변화는 Fig. 12에서 보는 바와 같이 메탄올을 2% 첨가한 경우가 다른 경우보다 높았으며, 구연산 농도는 Fig. 11에서 보여지는 바와 같이 1%의 메탄올을 첨가하였을 때 7.55 g/1로 가장 많이 생성되었으나 2% 이상에서는 오히려 구연산 농도가 감소함을 알 수 있었다. Fig.
- 또한 균체 생성량은 온도가 높을수록 증가하였다. 따라서 당을 이용한 A niger 균주 발효시에는 높은 온도가 균체 생육을 빠른 속도로 증가시킬 뿐만 아니라 상당량의 당이 CO2로 산화되기 때문에 구연산 생산이 떨어진다고 생각 되었다.
- 巾炊, 에 의한 구연산 발효에서 배양 온도와 구연산 생성과의 관계는 사용균주, 배양 방법, 영양조건에 따라 약간의 차이가 있으나, 당질계의 구연산 발효에서는 일반적으로 25- 35°C가 최적 온도로 알려져 있으며, Doegler[6] 등은 26 - 28°C가 적당하다고 하였다. 본 연구에서는 구연산 생성에 대한 온 도 의존성을 알아보기 위하여 반응 온도를 각각 25°C, 30°C 및 35°C로 하여 A. niger ATCC 9142 균주로 타피오카 주정 증류 폐기물을 12일간 표면발효하면서 발효시간에 따른 구연산 및 균체농도를 측정하여 Fig. 1과 2에 나타난 바와 같이 배양온도를 25°C, 30°C 및 35°C로 증가시켰을 때 6일에서의 구연산 농도는 각각 5.1, 6.09 및 3.62 g/1 로 나타났고, 균체농도는 각각 4.9, 6.6 및 7.45 g/1 로 나타났다. 온도 변화에 따른 구연산 생성량은 6일까지는 온도가 30°C에서 가장 많았으며, 발효기간이 길어질수록 구연산 생성량의 증가는 아주 완만하였다.
- 45 g/1 로 나타났다. 온도 변화에 따른 구연산 생성량은 6일까지는 온도가 30°C에서 가장 많았으며, 발효기간이 길어질수록 구연산 생성량의 증가는 아주 완만하였다. 또한 균체 생성량은 온도가 높을수록 증가하였다.
- 주정 증류 폐기물을 원료로 하여 구연산을 생산할 경우에는 배지 내의 무기염이 존재하므로 저분자 알코올류 등의 구연산 생산 촉진제를 첨가하여 구연산 생성을 촉진시킬 수 있을 것으로 생각되었다. 본 실험에서는 타피오카 주정 증류 폐기물을 기본 발효기질로 하여methanol, ethanol, isopropanol 및 u-propanol의 첨가가 구연산발효에 미치는 영향을 조사하였다.
- 질소원으로서 질산암모늄을 첨가하였을 때의 구연산 및 균체 생성의 영향을 살펴보기 위해서 타피오카 주정 증류 폐기물에 질산암모늄을 각각 0, 1, 2, 3 및 4 g/1 를 첨가하여 A. niger ATCC 9142 균주를 30°C에서 10일간 진탕배양시켰을 때 구연산 및 균체농도의 변화를 Fig. 5와 6에 나타낸 바와 같이 질산암모늄을 전혀 첨가하지 않았을 때는 구연산 및 균체농도가 6.09 및 9.55 g/1 얻어졌고, 이때의 구연산 농도는 질산암모늄을 첨가 하였을 때보다 훨씬 많이 생성되었으며, 질산암모늄 농도가 증가할수록 구연산 생성량은 감소되었다. 이는 과량의 NH**이 Embden-Meyerhof-Pamas (EMP) 경로상의 fructose 6-phosphate에서 fructose 1, 6-diphosphate로 분해할 때 phosphofructose kinase의 활성을 저해시켜 구연산을 만드는 원료가 되는 피루브산의 생산을 중단시키기 때문이라고 생각되었다 [8].
- 09 g/1로 가장 많이 생산되었고 Mn2+의 농도가 증가함에 따라 구연산 농도는 감소하였으며 균체농도는 거의 일정하게 얻어졌다. 타피오카 주정증류 폐기물은 원자흡광 광도법 (Atomic Absorption Spectrometer, Model; Varian Spectra A-30)으로 분석한 결과 타피오카 주정 증류 폐기물 자체에 0.016 g/1의 망간이 존재하는 것을 알았으며, 의 농도가 낮은 경우는 구연산 생산이 망간의 영향을 전혀 받지 않으나 Mn저의 농도가 0.0375 g/1 이상에서는 구연산 생성량이 급격히 줄었는데 이는 Kisser[7] 등의 보고와 같이 망간 농도가 증가하면 미생물의 세포벽에 존재하는 ^glucan의 함량이 증가하기 때문으로 생각된다.
- 이는 Scragg의 보고［11］와 같이 메탄올과 에탄올은 균체 증식 및 구연산 생성에 나쁜 영향을 미치는 중금속 물질의 작용을 저해시키고 미생물의 투과성을 증가시 키기 때문에 구연산 생산을 증가시키는 것으로 여겨진다. 한편 ispropanol 및 i-propanol은 kojic산 발효에서는 매우 유용한 물질로 알려져 있지만 구연산 생성에 있어서는 이들을 첨가하지 않은 경우보다 구연산 생성을 저해하는 것을 알 수 있었다. 이는 저분자 알코올류는 구연산 생성을 촉진시키는 반면 긴 사슬의 알코올류는 A.
후속연구
- 또한 공장이 도심지에 위치한 경우에는 수질오염 방지시설을 위한 폐수처리 부지 확보의 어려움 등으로 인하여 산업체에서는 이를 완벽하게 처리하지 못하므로 중대한 환경오염의 원인이 되고 있다. 또한 이들 폐기물을 이용한 발효공정의 개발이 폐기물의 양을 줄이고 부산물로 구연산을 얻을 수 있기 때문에 연구가 진행되고 있으나 아직까지 산업체에서 응용되지는 않고 있으므로 앞으로 이에 대한 많은 연구가 필요하다. 그리고 구연산 생산의 경제성을 높이기 위한 연구들도 많이 있지만 이러한 폐기물에는 미생물이 분해하기 힘든 질소, 인 등을 함유한 난 분해성 유기물과 구연산 발효에 나쁜 영향을 미치는 것으로 알려진 금속이 온들이 존재하고 있다.
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