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가설 설정
- 첫째, 다른 3, UTR을 갖는 동일 유전자의 여러 전사체는 한가지 세포형에서만 존재한다는 것이다. 예를 들어, fragile-X syndrome과 관련있는 유전자인 FMRl(fragile X mental retardation protein 1 homolog) 과 상동형인 FXRl(fragile site mental retardation 1)의 경우 translation 과정을 조절할 수 있으며, 이는 신경세포 분화과정에 있어서 매우 중요한 작용을 하는 것으로 보고 되었다.
제안 방법
- CD34+ 및 CD15+ 세포로부터 각각 14, 212종류 및 13, 559종류의 단일 UniGene cluster와 염기서열이 일치하는 SAGE tag 을 동정하였다. 그리고 적어도 두 종류의 SAGE tag과 일치하는 3, 420개의 UniGene cluster를 동정하였으며(Eble IA), 총 39% 의 SAGE tag이 이들 cluster에 포함되었다.
- 사용되어 졌다. GLGI 후 얻어진 3 EST(expressed sequence tag)는 GenBank의 BLAST 서 비스(ht仕p://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 이용하여 비교, 분석하였다.
- mRNA는 D功nal(O이0, Norway)사의 방법에 따라 oligo(dT)25 bead를 사용하여 분리하였다. cDNA는 Invitrogen 사의 cDNA synthesis kit를 사용하였으며 , 제조사의 방법을 변형하여 분리하였다. 13)
- cDNA synthesis. lriozol(Invitrogen, CA USA) 을 사용하여 분리된 CD34+ 조혈모세포와 CD15+ my이oid 전구세포를 용질하였으며, Invitrogen사의 지침에 따라 total RNA를 추출하였다. mRNA는 D功nal(O이0, Norway)사의 방법에 따라 oligo(dT)25 bead를 사용하여 분리하였다.
- 그리고 UniGene database는 동종의 cDNA들을 묶어서 각각의 고유 유전자를 나타내는 cluster로 지정을 하는데, in s汤co상에서 이 UniGene cluster14^] 포함되어 있는 cDNA로 부터 SAGE tag들을 추출할 수 있다. 본 연구에서는 CD34+ 조혈모세포와 CD15+ myeloid 전구세포로부터 수집된 SAGE tag비교, 분석하여 발현 양상이 다른 전사체에 대한 정보를 획득하였고, 특히 in s湖7상에서 획득한 SAGE tag과 실제적으로 관찰된 SAGE tag을 비교 분석하여 동일유전자에서 발현되지만 다른 3' UTR을 가진 전사체를 확인하였다.
대상 데이터
- 그리고 3' UTR。] 마지막 exon32) 내에 주로 존재하기 때문에 3' UTR에서의 alternative splicinge 일반적인 exon-intron 기작을 사용하지 않고, 기존에 알려져 있지 않는 다른 기작을 사용할 것으로 판단된다. Differential polyadenylatione 3' UTR에 위치하는 다른 polyA 신호(AAUAAA)의 사용을 통하여 이루어 지는데, genomic mapping에 의해 확인된 198개의 cDNA 중 107개가 전사체의 3' 말단에서 5' 방향으로 50 bp 안에 polyadenylation 신호를 가지고 있었다.
- Genomic 위치에 대한 검증을 위하여, 100종류의 UniGene cluster를 무작위로 선택하였다. 이 100종류의 UniGene cluster 에서 281종류의 SAGE tag을 얻었으며, 이 SAGE tag에 일치가 되는 cDNA 염기서열을 250종류 선택하여 인간 유전체(human genome)와 염기서열을 비교한 결과, 244종류의 cDNA는 인간유전체에 일치 되었고 나머지 6종투류의 cDNA는 일치되는 염기서열이 인간유전체에서 발견되지 않았다.
데이터처리
- Comparison and Analysis of the SAGE tags. CD34+ 조혈모세포와 CD15+ my이oid 전구세포口, (2)로부터 획득한 SAGE 결과를 SAGEmap database와 비교하여 각가의 SAGE tag에 층H 당되는 유전자 정보를 얻었으며, IDEG6(http:〃telethonbio.imipd.il/ bioinfo, /IDEG6) 를 사용하여 통계적인 분석을 하였다.
이론/모형
- is 유전자의 생리학적 기능에 있어서 3' UTR의 중요성과 3' UTR의 변화로 인한 유전자의 병리학적인 연관성 등을 보여주는 연구도 진행되었다.6崩)유전자의 발현에 있어서 3' UTR의 관련성 정도를 genome 수준에서 조사하기 위하여, 인간 CD34+ 조혈모세포로부터 CD15+ myeloid 전구세포로 분화되는 과정에서 발현되는 유전자에 대한 정보를 SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)111 방법을 사용하여 획득하였다.以, *)일반적으로 SAGE는 주어진 시료로부터 genome-wide로 발현되는 유전자 정보를 정량적 뿐만 아니라 정성적我 분석할 수 있는 기법으로서 mRNA 또는 cDNA의 3' 말단으로부터 평균적 약 140 bp 상단 부분에 존재하는 최종 CATG 다음의 10 bp tag을 수집한다.
- GLGI confirmation. SAGE tag으로부터 이에 해당하는 3' cDNA 를 얻기 위하여 GLGI(Generation of longer cDNA fragments for Gene Identification) 를 사용하였다. 이 과정에서 SAGE tag 은 sense primer로 사용되고 cDNA의 3' 말단에 존재하는 universal anti-sense primer 부분이 PCR(polymerase chain reaction)을 위한 anti-sense primerS.
- lriozol(Invitrogen, CA USA) 을 사용하여 분리된 CD34+ 조혈모세포와 CD15+ my이oid 전구세포를 용질하였으며, Invitrogen사의 지침에 따라 total RNA를 추출하였다. mRNA는 D功nal(O이0, Norway)사의 방법에 따라 oligo(dT)25 bead를 사용하여 분리하였다. cDNA는 Invitrogen 사의 cDNA synthesis kit를 사용하였으며 , 제조사의 방법을 변형하여 분리하였다.
성능/효과
- 204종류의 cDNA 중에 197종류는 genomic 염기서열 100 kb 안에서 존재하였고, 나머지 7종류는 374 kb안에 존재하였다. 77종류의 cluster가 동일한 유전체 위치에 있는 cDNA를 보유하고 있었는데, 52종류의 clustere 각각 일치하는 하나의 cDNA를, 그리고 25종류의 cluster는 염기서열이 일치하는 두 종류 이상의 cDNA를 보유했다(Table Ⅲ). 이는 전체적으로 77% 의 UniGene cluster가 동일한 유전체 위치에 존재하는 것을 보여준 것이며, 종합적으로는 SAGE tag이 동일한 유전자에서 유래했지만 다른 3' UTR을 갖는 UniGene cluster의 대부분의 cDNA와 염기서열에 일치하는 것은 이러한 염기서열이 공통의 genomic origin으로부터 발생한 것임을 보여주는 것이다.
- 동정하였다. 그리고 적어도 두 종류의 SAGE tag과 일치하는 3, 420개의 UniGene cluster를 동정하였으며(Eble IA), 총 39% 의 SAGE tag이 이들 cluster에 포함되었다. 전체 3, 420 UniGene cluster 중 1, 159종류가 CD34+ data set에, 1, 089종류가 CD15+ data set에만 존재하였고, 1, 172종류가 두 가지 data set에 함께 존재하였다.
- 둘째, 동일한 유전자로부터 전사되어 동일한 3' UTR을 갖는 여러 전사체는 두 가지 세포 형태에서도 비슷한 수준의 발현 양을 나타내었다. 예를 들어, prothymosin a는 thymus에 존재하는 thymosin-a-1 의 전구체로서 이는 T 세포분화에 관여하는데, 細 본 연구에서는 prothymosin a에서 발현되는 7종류의 각기 다른 3' UTR을 가진 염기서열이 발견되었으며, 이들이 CD34+ 조혈모세포와 CD154- myeloid 전구 세포에서 동일한 수준으로 존재하고 있는 것을 보아, 이러한 각각의 전사체는 양쪽 세포의 기능에 필요한 역할을 하는 것으로 판단된다.
- 이 100종류의 UniGene cluster 에서 281종류의 SAGE tag을 얻었으며, 이 SAGE tag에 일치가 되는 cDNA 염기서열을 250종류 선택하여 인간 유전체(human genome)와 염기서열을 비교한 결과, 244종류의 cDNA는 인간유전체에 일치 되었고 나머지 6종투류의 cDNA는 일치되는 염기서열이 인간유전체에서 발견되지 않았다. 또한 244종류의 일치되는 cDNA 중에는 40종류가 같은 cluster에 속한 염기서열과 달리 각기 다른 염색체에 위치하였으며, 204종류의 cDNA는 같은 duster안의 다른 염기서열과 같은 염색체 상에 위치한 것으로 나타났다. 204종류의 cDNA 중에 197종류는 genomic 염기서열 100 kb 안에서 존재하였고, 나머지 7종류는 374 kb안에 존재하였다.
- CD45 분자는 신호전달 체계에 있어서 음성적 조절을 하는 tyrosine phosphatase로서'"'°)이 유전자는 coding region 내부에서의 alternative splicing로 인하여 여러 종류의 전사체을 가진다. 본 연구에서는 유일하게 CD15+ 세포에서만 존재하는 3종류의 3' UTR을 가진 염기서열을 분리하였는더Kibble IV), 여기서 CD45 유전자는 CD34+ 세포에서는 전사가 이뤄지지 않는 반면, myeloid 계통 세포로 분화될 시에는 각기 다른 세 가지 3' UTR을 갖는 multiple isoform으로 발현되었다.
- 셋째, 동일한 유전자에서 전사되어 동일한 3' UTR을 갖거나 혹은 다른 3 UTR을 갖더라도 매우 다른 수준으로 발현되는 유전자의 경우는 두 가지 세포형 모두 에서 존재한다. 예를 들어, cathepsin S는 MHC class U 분자의 peptide 항원을 T 세포에 전달 하는데 있어서 중요한 분자로서, 2122)본 실험에서는 cathepsin S에 대한 각기 다른 3' UTR을 가지는 4종류의 염기서열이 분리되어 졌으며, 이들 중 2가지 종류는 오직 CD15+ 세포에서만 존재하였다(ATTAATGTGT; 3 copy, GTGTACTTGT; 35 copy).
- 무작위로 선택하였다. 이 100종류의 UniGene cluster 에서 281종류의 SAGE tag을 얻었으며, 이 SAGE tag에 일치가 되는 cDNA 염기서열을 250종류 선택하여 인간 유전체(human genome)와 염기서열을 비교한 결과, 244종류의 cDNA는 인간유전체에 일치 되었고 나머지 6종투류의 cDNA는 일치되는 염기서열이 인간유전체에서 발견되지 않았다. 또한 244종류의 일치되는 cDNA 중에는 40종류가 같은 cluster에 속한 염기서열과 달리 각기 다른 염색체에 위치하였으며, 204종류의 cDNA는 같은 duster안의 다른 염기서열과 같은 염색체 상에 위치한 것으로 나타났다.
- 이 연구는 조혈세포 분화과정에서 발현되는 유전자의 3' UTR 을 genome-wide하게 조사한 것으로, SAGE tag이 주로 전사체의 3' 말단으로부터 평균적으로 약 140 bp 정도 upstream에 위치하기 때문에 3' UTR로부터 더 upstream 지역에서 일어나는 많은 염기적 변화는 SAGE로는 확인할 수가 없다. 그러므로 같은 유전자로부터 다른 3' UTR을 가지고 발현되는 전사체의 실제적인 숫자는 더 많으리라 사료된다.
- 77종류의 cluster가 동일한 유전체 위치에 있는 cDNA를 보유하고 있었는데, 52종류의 clustere 각각 일치하는 하나의 cDNA를, 그리고 25종류의 cluster는 염기서열이 일치하는 두 종류 이상의 cDNA를 보유했다(Table Ⅲ). 이는 전체적으로 77% 의 UniGene cluster가 동일한 유전체 위치에 존재하는 것을 보여준 것이며, 종합적으로는 SAGE tag이 동일한 유전자에서 유래했지만 다른 3' UTR을 갖는 UniGene cluster의 대부분의 cDNA와 염기서열에 일치하는 것은 이러한 염기서열이 공통의 genomic origin으로부터 발생한 것임을 보여주는 것이다.
후속연구
- 급성 myeloid성 백혈병이 나타날 수 있다. 본 실험에서 획득한 결과는 그러한 백혈병과 관계된 유전자를 동정하는데 있어서 적절한 비교물로 사용될 수 있을 것이다.
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