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문제 정의
- 본 연구에서는 A. awamori glucoamylase cDNA 유전자(G4Z) 를 도입하여 전분을 직접 포도당으로 전환할 수 있는 산업용 다 배체 S. cerevisiae 개발을 목적으로, A. awamori glucoamylase 유전자가 염색체에 다중 도입될 수 있는 6-Yip 벡터 시스템을 제조하였고 효모에 형질전환시켜 전분을 유일한 탄소원으로 하는 비선택배지에서 안정하게 glucoamylase를 생산하는 산업용 다 배체 S. cerevisiae 형질전환체 균주를 선발하였다. 또한 이 균주 들에 도입된 glucoamylase 활성과 유전자의 안정성을 비교, 조사 하였다.
제안 방법
- cerevisiae ATCC 4126(16)를 효모 형질전환 숙주로 이용하였다. 2-p, replication origin을 가지고 있는 YEp 벡터인 pGAC9(6)에 포함된 A. awamori GA1 유전자와 pAUR123(TaKaRa, Japan)을 골격으로 이용한 YIp6AURSA(8)에 존재하는 Ty retrotransposon 5, -말단의 6-서열을 재조합 벡터에 도입하였다. pGEM-T Easy 벡터(Promega, USA)는 PCR을 통해 증폭된 유전자의 클로닝에 이용하였다.
- ADC1 promoter-G4/ 유전자-CYC/ terminator를 증폭하기 위해 YIpAURSA의 염기서열을 이용하여 제작한 PCR primers의 정방향 염기서열은 S'-TTGCAGATCTGCATGCAACTrCITITCmTnT- 3'이고 역방향 서열은 5'-GGCCAGATCTTACGTAGGCCGCAA ATTAAAGCCTTCG-3, 이었다. 한편, 재조합 플라스미드에 삽입할 4서열의 증폭은 Choi 등(2)이 기술한 primer와 조건을 이용하여 실시하였다.
- cerevisiae 자체의 Aurl 유전자에서 유래한 우성유전자이므로 식품산업용 재조합 효모의 제조에 이용할 수 있다(4). AUR1-C 유전자와 GA1 유전자가 포함된 YIpAURGl의 Bg/II 부위를 Bg/H와 Klenow fragment로 처리하고 이 부위에 6-서열이 포함된 0.3 kb Smal DNA 단편을 삽입하여 YIpAURG2를 제조하였다(Fig. IB). YIpAURG2는 δ-서열 내에 하나의 Xho[ 부위가 있으므로 Xhol 처리로 선형화시켜 형질전환에 이용하면 homologous recombination0!] 의해 염색체에 산재해 있는 많은 6-서열에 다중 도입될 수 있다(2, 23).
- E. c* <에서 plasmid DNA의 주출은 Qiagen Plasmid Maxi kit (Qiagen, USA)를 이용하여 수행하였고, PCR 증폭 DNA는 QIAquick PCR purification kit와 QIAquick gel extraction kit를 이용하였다. 주형 DNA에 이용할 효모의 genomic DNA 추출은 Zhu 등의 방법(26)에 의해 실시하였다.
- Aureobasidin A (1 gg/ml, TaKaRa, Japan)가 첨가된 YPD 평판배지에서 생장한 효모 형질전환체는 YPS (3% soluble starch를 함유한 YP) 평판배지에 옮겨 3VC에서 5 - 7일간 배양한 후 4℃에서 2일간 유지시켰다. Glucoamylase 활성을 측정하기 위해 효모 형질전환체를 0.1 M sodium phosphate 완충용액(pH 6.0)이 함유된 YPS (BYPS, 2% soluble starch를 함유한 YP) 배지에서 30℃로 4 - 5일간 배양하였다. 배지의 잔존 전분함량은 Kim 등의 방법(9)에 따라 전분-요오드 반응에 의해 측정하였다.
- YIpAURG2는 δ-서열 내에 하나의 Xho[ 부위가 있으므로 Xhol 처리로 선형화시켜 형질전환에 이용하면 homologous recombination0!] 의해 염색체에 산재해 있는 많은 6-서열에 다중 도입될 수 있다(2, 23). YIpAURGl CYC1 terminator (CYCE)에 존재하는 Hpal 부위에 또 하나의 δ-서열을 기존의 δ-서열과 방향성이 맞게 삽입하여 YIpAURG3< 제조하였다. 두 δ-서열을 가진 YIpAURGl Xhol으로 처리하면 ampicillin 저항성 유전자와 세균 origin을 포함한 2.
- YPS 평판배지에서 자란 형질전환체 중 콜로니주위로 투명환이 형성되지 않는 숙주 효모와 달리, 투명환이 형성된 클론을 1차적으로 glucoamylase 를 생산하는 형질전환체로 판정하였고 glucoamylase의 세포외 분비 유무를 알기 위해 숙주 효모와 형질 전환체들을 BYPS 배지에서 배양한 후 배양 상등액을 이용하여 glucoamylase 활성을 즉정하였다.
- cerevisiae 형질전환체 균주를 선발하였다. 또한 이 균주 들에 도입된 glucoamylase 활성과 유전자의 안정성을 비교, 조사 하였다.
- 산업용 다배체 S. cerevisiae6^ GA1 유전자를 도입하여 발현시킬 목적으로 선형화된 YIpAURGI, YIpAURG2 그리고 YIpAURG3 를 이용하여 aureobasidin A 저힝성(>1㎍/ml aureobasidin A)을 나타내는 형질전환체 ATCC 4126/YIpAURGl, ATCC 4126/ YIpAURG2 그리고 ATCC 4126/YIpAURG3를 얻었다. 형질전환 체 중 ATCC 4126/YIpAURG3는 YPS 평판배지에서 생장이 빠르고 콜로니 주위에 뚜렷한 투명환을 형성하여 glucoamylase의 생산이 가장 양호한 것으로 판단되었다(Fig.
- 1A). 염색 체 XI의 Aurl 부위에 homologous recombination에 의해 도입될 수 있도록 YIpAURGl의 aureobasidin A 저항성 유전자(AURI-C)내에 있는 Apal 부위를 Apal 처리하여 선형화하였다(2).
- 형질전환체를 Nieto 등의 방법(17)에 따라 5 ml YPD 배지에서 계대배양하면서 20, 40, 80, 100세대 후 세포를 취하여 YPD 평판배지에 단일 콜로니들이 형성되도록 도말하고 YPS 평판배지에 옮겨 전체 콜로니 중 주위에 투명환이 형성되는 GA1 유전자 보유 콜로니를 백분율로 산출하여 도입된 GA1 유전자의 안정성을 결정하였다.
- 형질전환체를 비선택 YPD 배지에서 100세대 동안 배양하면서 형질전환체에 도입된 Yip 벡터의 GA1 유전자 안정성을 YEp 벡터인 pGAC9과 비교하여 조사하였다(Fig. 5). 형질전환체 W3O3- lA/pGAC9에서는 배양이 지속되면서 pGAC9의 안정성은 급격히 감소했지만, 형질전환체 ATCC 4126/YIpAURGl에서는 YIpAURGl의 안정성이 95%이상 유지되었고 δ-서열이 도입된 YIpAURG2와 YIpAURGl 안정성이 증가하여 100% 유지되었다(2, 8).
대상 데이터
- E. coli 형질전환체는 50㎍/ml ampicillin0] 첨가된 Luria-Bertani (LB) 배지에서 배양하였고, 효모 배양에는 YPD 배지(1% yeast extract, 1% Bacto-peptone, 2% glucose)를 사용하였다. Aureobasidin A (1 gg/ml, TaKaRa, Japan)가 첨가된 YPD 평판배지에서 생장한 효모 형질전환체는 YPS (3% soluble starch를 함유한 YP) 평판배지에 옮겨 3VC에서 5 - 7일간 배양한 후 4℃에서 2일간 유지시켰다.
- Escherichia coll JM83[tzra, Δ(lelac-proAB), rspL, Φ80d, lacZAM15]를 형질전환숙주와 플라스미드 제조 및 증폭에 사용하였으며, 실험실용 반수체 S. cerevisiae W303-1A(7)와 산업용 다배체 S. cerevisiae ATCC 4126(16)를 효모 형질전환 숙주로 이용하였다. 2-p, replication origin을 가지고 있는 YEp 벡터인 pGAC9(6)에 포함된 A.
- pGAC9의 2.1 kb A. awamori GA1 유전자를 AMY 유전자가 제거된 YIpAURSA (8)의 ADC1 promoter (ADCIp)에 존재하는 Smal 부위에 도입시켜 YIpAURGl를 제조하였다(Fig. 1A). 염색 체 XI의 Aurl 부위에 homologous recombination에 의해 도입될 수 있도록 YIpAURGl의 aureobasidin A 저항성 유전자(AURI-C)내에 있는 Apal 부위를 Apal 처리하여 선형화하였다(2).
- 전분을 탄소원으로 하는 배지(BYPS)에서 생장한 형질전환체의 배양 상등액을 이용하여 glucoamylase 활성을 측정하였는데 형질 전환체 중에서도 상대적으로 높은 glucoamylase 활성을 가진 균주들이 선별되었다. Table 1에서 보는 바와 같이 ATCC 4126/ ATCC 4126/YIpAURG3 genomic DNA.
이론/모형
- 주형 DNA에 이용할 효모의 genomic DNA 추출은 Zhu 등의 방법(26)에 의해 실시하였다. DNA 분석과 형질전환은 Sambrook과 Russell 방법(21)에 따라 실시하였다. 한편, 효모의 형질전환은 Hill 등의 lithium acetate/DMSO 방법(5)에 의해 실시하였다.
- Glucoamylase 활성은 Steyr과 Pretorius 방법(22)으로 측정하였다. 반응기질로서 50 mM sodium acetate 완충용액 (pH 4.
- 0)이 함유된 YPS (BYPS, 2% soluble starch를 함유한 YP) 배지에서 30℃로 4 - 5일간 배양하였다. 배지의 잔존 전분함량은 Kim 등의 방법(9)에 따라 전분-요오드 반응에 의해 측정하였다.
- c* <에서 plasmid DNA의 주출은 Qiagen Plasmid Maxi kit (Qiagen, USA)를 이용하여 수행하였고, PCR 증폭 DNA는 QIAquick PCR purification kit와 QIAquick gel extraction kit를 이용하였다. 주형 DNA에 이용할 효모의 genomic DNA 추출은 Zhu 등의 방법(26)에 의해 실시하였다. DNA 분석과 형질전환은 Sambrook과 Russell 방법(21)에 따라 실시하였다.
- ADC1 promoter-G4/ 유전자-CYC/ terminator를 증폭하기 위해 YIpAURSA의 염기서열을 이용하여 제작한 PCR primers의 정방향 염기서열은 S'-TTGCAGATCTGCATGCAACTrCITITCmTnT- 3'이고 역방향 서열은 5'-GGCCAGATCTTACGTAGGCCGCAA ATTAAAGCCTTCG-3, 이었다. 한편, 재조합 플라스미드에 삽입할 4서열의 증폭은 Choi 등(2)이 기술한 primer와 조건을 이용하여 실시하였다.
- DNA 분석과 형질전환은 Sambrook과 Russell 방법(21)에 따라 실시하였다. 한편, 효모의 형질전환은 Hill 등의 lithium acetate/DMSO 방법(5)에 의해 실시하였다.
성능/효과
- 15 U/ml이었다. ATCC 4126/ YIpAURG2와 ATCC 4126/YIpAURG3의 glucoamylase 활성은 ATCC 4126/YIpAURGl에 비해 각각 3 - 5배 증가하였다. 재조 합부위로 6-서열이 첨가된 YIpAURG2와 YIpAURGI 염색체 내에 많은 &서열(425 copies)(l, 11)에 GA1 유전자가 도입될 수 있어 copy 수 증가에 의해 발현율이 증가된 것으로 사료되었다 (2, 8, 12).
- 사용된 S. cerevisiae는 다배체 효모이므로 염색체에 도입된 GA1 유전자의 copy 수 측정은 할 수 없었으나 형질전환체(ATCC 4126/YIpAURGl, ATCC 4126/YIpAURG2 및 ATCC 4126/ YIpAURG3) 염색체 내에 이들 Yip 벡터의 도입여부를 알기 위해 ADC1 promoter와 CYC1 terminator의 염기서열에 의해 제작된 primer를 이용하여 PCR을 실시한 결과, S. cerevisiae ATCC 4126의 genomic DNA와 형질전환체의 genomic DNA를 주형 DNA로 이용하였을 때 형질전환체의 genomic DNA에서만 Yip 벡터내에 존재하는 ADClp-GAI-CYCh<^ 해당된 2.8 kb DNA 밴드가 증폭되어 형질전환체의 염색체 내에 Yip 벡터가 도입되었음이 확인되었다(Fig. 2).
- cerevisiae6^ GA1 유전자를 도입하여 발현시킬 목적으로 선형화된 YIpAURGI, YIpAURG2 그리고 YIpAURG3 를 이용하여 aureobasidin A 저힝성(>1㎍/ml aureobasidin A)을 나타내는 형질전환체 ATCC 4126/YIpAURGl, ATCC 4126/ YIpAURG2 그리고 ATCC 4126/YIpAURG3를 얻었다. 형질전환 체 중 ATCC 4126/YIpAURG3는 YPS 평판배지에서 생장이 빠르고 콜로니 주위에 뚜렷한 투명환을 형성하여 glucoamylase의 생산이 가장 양호한 것으로 판단되었다(Fig. 3).
- 5). 형질전환체 W3O3- lA/pGAC9에서는 배양이 지속되면서 pGAC9의 안정성은 급격히 감소했지만, 형질전환체 ATCC 4126/YIpAURGl에서는 YIpAURGl의 안정성이 95%이상 유지되었고 δ-서열이 도입된 YIpAURG2와 YIpAURGl 안정성이 증가하여 100% 유지되었다(2, 8). 이러한 결과는 rDNA 중개 다중 도입에 의한 GA1 유전자 안정성이 50세대까지 유지되었다는 Lin 등의 보고(13)와 비교하여 볼 때 6-서열이 rDNA 서열보다 염색체에 존재하는 copy 수가 많고 δ-서열 중개 다중 도입이 rDNA 중개 다중 도입보다 nontandem 한 염색체 도입가능성이 크므로 도입 유전자의 안정성에 더 크게 기여할 수 있다는 보고(1, 11, 23)와 일치하였다.
후속연구
- 산업용 야생형 다배체 효모에 외래 유전자를 도입시키고 발현시키는 데는 일반적으로 이들 효모가 항생제 혹은 항대사물질 저항성 유전자가 없으므로 특정 항생제 혹은 항대사물질에 민감하다는 특성을 이용할 수 있다(15). 그러므로 이러한 저항성 유전자가 우성 선별 표지유전자로 포함된 Yip 벡터를 제조하고 숙주 효모에 도입시키면 외래 유전자 산물을 생산 분비하는 산업용 S. cerevisiae 선발이 가능할 것이다. 산업용 S.
- 또한 세균 plasmid DNA 부분이 제거된 YlpAURG3에 의한 glucoamylase 활성이 YIpAURG2보다 높은 결과는 염색체에 도입되는 DNA크기의 축소와 6-서열에 도입되는 copy 수의 증가와 관련이 있다는 Lee와 Da Silva의 보고(11)와 일치하였다. 또한 YIpAURG3는 세균항생제 저항성 유전자를 포함한 원핵성 plasmid DNA가 제거되어 있으므로 이를 이용한 재조합 맥주효 모나 제빵용 효모 균주개발이 가능할 것이다(15, 17).
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