[논문]항균 펩타이드의 구조와 활성에 관한 상관관계

박윤경; 함경수

문제 정의

항미생물 peptides가 생물계에 널리 분포하고 있는 것으로 미루어 이들이 많은 생물체들의 host defense system에 있어 매우 중요한 역할을 할 것이라는 사실은 쉽게 짐작할 수 있다. 본 내용에서는 항생제를 대체할 수 있는 포유류, 양서류, 곤충, 식물 및 세균에 존재하는 항균peptides에 관하여 기술하려 하는데 특히, 여러 종류의 peptide들이 지니는 구조적 유사성과 각각의 특이성에 대하여 중점적으로 다루고자 한다. 먼저 항균peptide들 간의 공통된 구조적 특성을 유추해내기 위해선 여러 다른 생물체들로부터 분리된 peptide들의 구조를 비교 분석해야 한다.
새로운 항생제로써peptides를 이용하기 위해선 이들의 작용 방식을 규명하는 일이 매우 중요하다. 이러한 맥락에서 자연에서 발견된 항균peptide들의 구조를 기초로 한 다양한 peptide들이 합성되어 항균 활성을 증가시키는 구조를 찾아내기 위해서나 혹은 작용기전을 밝히기 위한 연구에서 이용되었다. 이러한 synthetic peptide의 첫 번째 예는 항균 활성을 증가시키고 세포독성을 낮추기 위해 고안된 Cecropin-melittin의 hybrid form이 라고 할 수 있다.

제안 방법

그리고 활성 펩타이드의 기작은 인지질막 파괴능을 측정하여 연구하고 있다. 즉, 세 포의 모델막을 Phosphatidyl choline(PC) 및 phosphatidyl choline (PC)/ phosphatidyl serine(PS) (3:1)로 large unilamellar vesciles(LUVs)로 reverse phase ether evaporation method 에 의해 제조하고 제 조된 인지질막에 펩타이드를 처리 후 인지질막이 깨져 막내부의 형광성 물질이 방출되는 정도로인지질막 파괴능 활성을 측정한다. 그리고 생체 내 세포막의 유동성 변화(membrane dynamics)를 보기 위해 형광물질인 1, 6- diphenyl-l, 3, 5-hexatriene(DPH)을 이용하여 Fluorescence Spectrophotometer에서 펩타이드에 의한 세포막 유동성을 측정하여 항균 펩타이드가 어떠한 기작에 의해 활성을 나타내는지를 확인하고 있으며, 그 외 방법으로 펩타이드 처리 후 세포막의 보존 상태를 알아보기 위해 FACScan(Fluorescence Activated Cell Scanning and Sorting) analysis, SEM(Scanning Electron Microscopy) 그리고 CLSM(Confocal Laser Scanning Microscopy)을 이용하여 항균기작을 밝히고 있다.

이론/모형

첫째, 펩타이드의 분리, 정제 및 합성 방법으로써, 항균 활성을 보유하는 천연형 항균 펩타이드를 탐색하고 분리, 정제하기 위하여 FPLC(Fast Protein Liquid Chromatography) 및 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 신규 항생 펩타이드를 분리하고 있다. 또한 항균펩타이드의 합성은 Fmoc- chemistry를 이용한 고상법(solid phase method)으로 시행하며, 정제형 C18 column올 이용한 revesed-phase HPLC에 의하여 분리 정제한다 정제펩타이드들의 아 미노산 조성 및 정량은 펩타이드를 산가수분해 한 후 아미노산 분석에 의하여 확인하며, 합성 펩타이드의 분자량 확인은 Mass Spectroscopy에 의하여 확인한다.

성능/효과

대부분의 peptide들은 Gram 음성균의 외막에 존재하는 LPS에서 결합된 후 self-promote [12] 방식에 따라 세균으로 들어가는 것으로 확인되었다. peptide가 LPS에 결합되는 친화력은 Ca2+, 와 Mg2+보다 최소 3배 이상 강한 것으로 측정되었다.
peptide?} membrane potential을 교란하는 정도를 측정한 연구에서는 일부peptides만이 MIC 농도에서 E. coliS] cytoplasmic membrane을 완전히 depolarite 시킬 수 있음을 확인하였고, MIC 이하의 농도에서도 membrane potential을 부분적으로 파괴시켰다. 이 사실을 peptide가 일정한 역치농도 이상에서만 막을 파괴 할 수 있다는 기존의 carpet model의 가설과 모순되는 결과이었다.
약간의 항균 활성이 나타나고 백혈병 세포주(AML-2) 및 위암세포주(SNU 601)를 사용하여 항암 활성을 측정하면, 2Arginine, 4Glutamic acid, 1'Serine, ^Glutamine을 Tryptophan (W) 잔기로 치환한 유사체 펩타이드의 경우 강력한 항암 활성을 나타내게 된다. 그리고 이러한 항생작용의 정확한 부위를 찾는 방법으로 DNA, RNA, protein^] 합성 효율 실험과 암세포에서 FACScan 분석을 이용한 apoptosis의 determination^}- 세포막의 integrity를 측정할 수 있고, 암세포를 이용한 Confocal Microscopy를 수행하여 암세포에서 펩타이드가 작용할 때 전형적인 apoptosis의 형태를 나타낸다는 것을 확인할 수 있다.
peptide의 양전하는 세균막과의 인력을 증가시키는 데에 중요하며 소수성은 막과의 소수성 결합력을 증가시켜줌으로써 막에 결합되는 데에 크게 기여한다. 대부분의 peptide들은 Gram 음성균의 외막에 존재하는 LPS에서 결합된 후 self-promote [12] 방식에 따라 세균으로 들어가는 것으로 확인되었다. peptide가 LPS에 결합되는 친화력은 Ca2+, 와 Mg2+보다 최소 3배 이상 강한 것으로 측정되었다.
둘째, 항생활성 측정을 위해 본 연구실에서 보유하고 있는 각종 박테리아(그람 양성균 및 음성균)와 병원성 진균의 생육을 완전히 억제시키는 . 최소한의 농도(MIC)를 정하며, 항바이러스 활성 측정은 Vaccinia virus 에 HIV 의 감염에 있어 중요한 역할을 하는 envelope protein인 gp 120, 41을 encode하는 gene을 도입한 vPE 16을 사용하며, fusion을 일으키는 상대 세포로는 CD4 receptor를 encode하는 gene을 발현시킨 변이 세 포 HeLa/CD4+ cell, 즉 HeLa S3 cell 표면에 CD4 receptor를 발현시킨 mutant cell 을 사용한다.
그런데 소수성 아미노산인 Trp나 Phe를 Leu으로 치환시키면 (즉, peptide의 소수성을 감소시키면) 세포 독성이 크게 줄어드나 항균력의 감소는 별로 없게 된다는 사실을 밝혀냈다. 또한 9〜10개의 아미노산으로 이루어진 peptide의 경우엔 매우 낮은 항균 활성을 갖게 되는데, 이peptide는 길이가 긴 peptide에 비해 매우 낮게 a-helix form을 이룬다는 사실을 알게 되었다. 그러나bactenecin (12개), indolicidin (14개), gramicidin (10개) 등은 비록 길이가 짧지만 우수하고 광범위한 항균력을 지니고 있는데, 이는 이peptide들이 길이가 긴 peptide들과 다른 방식으로 항균력을 갖게 됨을 의미하는 것이다.
Phagocytosis의 기능을 가진 것으로 알려진 neutophils은 여러 가지 다양한 항균 proteins 과 peptides를 포함하고 있는 것으로 알려져 있는데, 이들 중엔 bactericidal/permeabilty- increasing proteins(BPI), lysozyme, lactoferricin, bactenecins, defensins, indolicidins, cathelicidins 등이 있다. 또한 neutrophil 이외의 다른 세포들도 항균proteins을 만들어내는 것으로 확인되었다 (예: 상피세포는 g-defensin; 혈소판은 platelet microbicidal proteins). 포유류의 항균 peptides 중 가장 활발하게 연구된 것은 defensin 이라고 할 수 있다.
Cecropins 와 magainin은 박테리아, 섬유성균류, 원생동물, 후생동물을 포함한 넓은 범위의 미세생물체에 대항하는 활성이 있다. 마지막으로 두꺼비와 물고기의 표피로부터 최근 분리된 histone의 잘려진 형태와 상응흐}는 양이 온 펩타이드가 있는데 크기가 2.4 kDa으로 cecropin과 구조적으로 유사하고 박테리아, 균류에 대항하는 활성이 있다. 이런 분자들이 항미생활성이 있는 이유는 a-나선 분자가 박테리아 막을 관통한 뒤 핵산과 결합하여 세포대사를 막음으로써 빠른 세포 사멸을 이끌기 때문이다.
하지만 19개의 아미노산으로 구성된 이항균 펩타이드를 위에서 언급한 방법과 마찬가지로 트립토판을 이용한 소수성 증가 방법과 serine을 이용하여 소수성 부위를 감소시키는 방법으로 유사체 펩타이드를 설계하고 항균, 항진균 활성을 측정하면 소수성 부위를 가장 많이 증가시킨 유사체 펩타이드(Anal3)가 HP (2-20) 보다 항균활성이 10배 이상 증가되며 곰팡이에서는 4배 정도 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있다. 반대로 소수성 부분을 감소시키면 항생활성은 원래의 HP (2-20)보다 현저히 떨어지는 것을 확인할 수 있을 것이다. 또 펩타이드의 살균 속도를 배양시간에 따라 측정해보면, 소수성 부위를 가장 많이 증가시킨 Anal 3가 강력한 항균펩타이드로 알려진 Melittin 과 유사한 살균 속도를 나타낸다는 것을 확인할 수 있다 [19].
D-form의 아미노산들로만 구성된 magainin은 원래의 peptide (L- magainin)와 동일한 생물학적 활성을 보였다 [11].이 결과는 D-form의 아미노산들로 이루어진 peptide가 단백질 분해효소에 대해 안정하며 따라서 이론적으로 안정된 in vivo 활성을 지닐 수 있다는 점에서 매우 흥미로운 것이었다. 비록 많은 경우에 있어 synthetic peptide 들은 천연peptide의 구조를 근거로 하여 합성되지만 임의로 아미노산들을 배열시켜 합성하는 방식의 연구도 현재는 병행되고 있다.
이러한 경우의 가장 주목할 만한 단백질은 철운 반 기능을 가진 lactoferrin 이라고 할 수 있다[6], Lactoferrin 상에 존재하는 항균 활성 부위는 11개의 아미노산으로 구성된 peptide인 것으로 알려져 있는데, 이 부위는 위소화효소인 pepsin에 의한 가수분해로써 lactoferrin으로부터 떨어져 나오게 된다. 이 항균 활성부 위는 물론 lactoferrin에서 분리되어 나왔을 때에 보다 강력한 활성을 지니게 되는데, lactoferrin 구조에 포함되어 있을 경우에도 lactoferrin이 항균 활성을 갖는 데에 중요한 구조적 motif가 되는 것으로 확인되었다. Lactoferrin은 현재 위장소화에 의해 활성peptide가 만들어지도록 고안된 영양보조제로써 이용되고 있다.
사람의 위 점막에서 생존하는 것으로 알려진 Helicobacter py/o万로부터 HP (2-20)펩타이드가 1999년 Boman에 의해 분리되었고[18], 이 펩타이드는 강력한 항균 활성은 아니지만 넓은 범위의 항균 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 하지만 19개의 아미노산으로 구성된 이항균 펩타이드를 위에서 언급한 방법과 마찬가지로 트립토판을 이용한 소수성 증가 방법과 serine을 이용하여 소수성 부위를 감소시키는 방법으로 유사체 펩타이드를 설계하고 항균, 항진균 활성을 측정하면 소수성 부위를 가장 많이 증가시킨 유사체 펩타이드(Anal3)가 HP (2-20) 보다 항균활성이 10배 이상 증가되며 곰팡이에서는 4배 정도 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있다. 반대로 소수성 부분을 감소시키면 항생활성은 원래의 HP (2-20)보다 현저히 떨어지는 것을 확인할 수 있을 것이다.

후속연구

이러한 기존의 항균 펩타이드를 이용한 소수성 영역의 증가 및 감소 또는 positive charge 의 증가 등으로 항생펩타이드를 설계를 할 수 있으며, 펩타이드 성 항생제, 항균제, 항암제 개발에 직접 이용할 수 있다. 그리고 항 균 펩타이드와 지질과의 상호작용 및 구조-항 생활성 상관관계 연구로부터 기존에 알려진 항균펩타이드의 항생활성을 증진시키며, 세포독성이 없는 약물을 제조할 수 있을 것이다. 이렇게 하여 개발된 펩타이드 항생제는 화학적 항생제를 대체함은 물론이고 항생제 내성을 지닌 세균들에 대해서도 응용 가능할 것으로 사료된다.
본 내용에서는 항생제를 대체할 수 있는 포유류, 양서류, 곤충, 식물 및 세균에 존재하는 항균peptides에 관하여 기술하려 하는데 특히, 여러 종류의 peptide들이 지니는 구조적 유사성과 각각의 특이성에 대하여 중점적으로 다루고자 한다. 먼저 항균peptide들 간의 공통된 구조적 특성을 유추해내기 위해선 여러 다른 생물체들로부터 분리된 peptide들의 구조를 비교 분석해야 한다. 공통적인 구조적 motif를 파악하게 되면 특정 병원체를 제어하기 위해서는 어떤 구조의 peptide가 효과적일 수 있는지를 가늠할 수 있게 될 것이다.
그리고 항 균 펩타이드와 지질과의 상호작용 및 구조-항 생활성 상관관계 연구로부터 기존에 알려진 항균펩타이드의 항생활성을 증진시키며, 세포독성이 없는 약물을 제조할 수 있을 것이다. 이렇게 하여 개발된 펩타이드 항생제는 화학적 항생제를 대체함은 물론이고 항생제 내성을 지닌 세균들에 대해서도 응용 가능할 것으로 사료된다.

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