[논문]개불 라이소자임 유래 항균성 모델 펩타이드(Uu-ilys-CF)의 재조합 단백질 생산 및 항균 활성

오혜영; 고혜진; 박남규

doi:10.5352/jls.2021.31.1.83

개불 라이소자임 유래 항균성 모델 펩타이드(Uu-ilys-CF)의 재조합 단백질 생산 및 항균 활성
Recombinant Production and Antimicrobial Activity of an Antimicrobial Model Peptide (Uu-ilys-CF) Derived from Spoon Worm Lysozyme, Uu-ilys 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.31 no.1, 2021년, pp.83 - 89

오혜영 (부경대학교 수산과학대학 생물공학과) , 고혜진 (부경대학교 수산과학대학 생물공학과) , 박남규 (부경대학교 수산과학대학 생물공학과)

초록
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개불 라이소자임(Uu-ilys)은 개불(Urechis unicinctus)로부터 정제된 무척추형 라이소자임으로 병원균에 대한 방어에 주요하게 작용하는 선천성 면역 물질이며, 비효소적 항균 활성을 가지고 있어 항균 활성을 지닌 유도체의 개발 가능성을 가지고 있다. 본 논문은 개불 라이소자임에서 유래된 항균 활성을 가지는 유도체의 디자인과 생산을 기술하고 있다. 여러 항균성 펩타이드(antimicrobial peptide, AMP) 데이터베이스에서 제공하는 항균성 펩타이드 예측 도구를 사용하여 개불 라이소자임에서 항균 활성을 가지는 부위를 예측하였다. 개불 라이소자임 C-말단의 절편이 항균 활성을 나타낼 것으로 예측되었으며, 이 펩타이드는 C-말단 절편, Uu-ilys-CF라 명명하였다. Uu-ilys-CF은 이형 발현 시스템인 TrxA-Uu-ilys-CF 퓨전 단백질을 사용하여 생산하였다. 만들어진 퓨전 단백질은 브롬화시안을 사용하여 메티오닌 잔기를 절단하였으며, 절단된 Uu-ilys-CF은 고성능액체크로마토그래피와 역상 컬럼인 CapCell-Pak C18을 사용하여 분리되었다. Uu-ilys-CF의 항균 활성을 조사하기 위해서 여러 균주(그람양성균 4개, 그람음성균7개, 진균 1개)를 사용하였다. Uu-ilys-CF의 항균 활성은 살모넬라에서 가장 높은 반응을 보였다. 비록 Uu-ilys-CF는 진균에 활성을 나타내지 않았지만, 사용한 균주들에서 넓은 범위의 항균 활성을 나타내었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Uu-ilys, an i-type lysozyme from spoon worm (Urechis unicinctus), is an innate immune factor that plays an important role in the defense against pathogens. It also possesses non-enzymatic antibacterial activity. Thus, there is a possibility to develop an antimicrobial model peptide from Uu-ilys. In this study, we report the design, production, and antibacterial activity of an Uu-ilys analog that exhibits antibacterial activity. The Uu-ilys structure was fragmented according to its secondary structures to predict the regions with antimicrobial activity using antimicrobial peptide (AMP) prediction tools from different AMP databases. A peptide containing the C-terminal fragment was predicted to exert antimicrobial activity. The chosen fragment was designated as an Uu-ilys analog containing the C-terminal fragment, Uu-ilys-CF. To examine the possibility of developing an AMP using the sequence of Uu-ilys-CF, recombinant fusion protein (TrxA-Uu-ilys-CF) was produced in an expression system that was heterologous. The produced fusion protein was cleaved after methionine leaving Uu-ilys-CF free from the fusion protein. This was then isolated through high performance liquid chromatography and reverse phase column, CapCell-Pak C18. The antibacterial activity of Uu-ilys-CF against different microbial strains (four gram-positive, six gram-negative, and one fungal strain) were assessed through the ultrasensitive radial diffusion assay (URDA). Among the bacterial strains tested, Salmonella enterica was the most susceptible. While the fungal strain tested was not susceptible to Uu-ilys-CF, broad spectrum antibacterial activity was observed.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. The amino acid sequence of Uu-ilys-CF. (A) The full amino acid sequence of the mature Uu-ilys (i-type lyso-zyme from U.unicinctus). The sequence of the analog is indicated in bold. (B) The amino acid sequence and the secondary structure of Uu-ilys-CF. The underlined letters are positively charged residues while italicized letters are negatively charged residues. Hydrophobic residues are in gray letters. The secondary structure showing the lo-cation of α-helix, which starts with Leu² and ends with Phe¹⁷, is drawn below the amino acid sequence.
그림 Fig. 2. Helical wheel projection and 3-dimentional model of Uu-ilys- CF. (A) Helical wheel projection of the analog. Resi-dues in octagon are positively charged while residues in rhombus are negatively charged. Residues in square indicate hydrophobic residues. (B) The 3D model of the analog. The first and the last residues are indicated with letters and numbers (P1 and C21). The start and the end residues of the α-helix are indicated (L2 and F17).
그림 Fig. 3. Recombinant production of Uu-ilys-CF. (A) Schematic diagram of recombinant TrxA-Uu-ilys-CF fusion protein. (B) Overexpression of the fusion protein induced by IPTG. (1: non-induced, insoluble; 2: non-induced, solu-ble; 3: induced, insoluble; 4: induced, soluble). The gray arrow indicates TrxA-Uu-ilys-CF, which is overexpre-ssed in insoluble form. (C) Affinity purified fusion pro-tein, TrxA-Uu-ilys-CF.
그림 Fig. 4. The HPLC chromatogram of Uu-ilys- CF purification. (A) The HPLC chromatogram of the CNBr treated re-combinant TrxA-Uu-ilys-CF fusion protein. The bar in the chromatogram indicates cleaved Uu-ilys-CF peaks. (B) The HPLC chromatogram of the DTT treated Uu-ilys- CF. The bar in the chromatogram indicates Uu-ilys- CF. (C) The final HPLC chramtogram of Uu-ilys-CF. The gray arrow indicates Uu-ilys-CF. (D) The molecular weight of Uu-ilys-CF was determined as 2405.1150 Da [M+H]⁺.
그림 Fig. 5. The antimicrobial activity of rUu-ilys and rUu-ilys-CF. (A) The antimicrobial activity of Uu-ilys-CF against eight different bacterial strains. 1: B. subtilis, 2. S. aureus, 3. S. enterica, 4. E. coli D31, 5. E. coli ML35, 6. S. sonnei, 7. S. flexneri, 8. E.tarda. The tested concentration is 0.5 mg/ml. The black bar indicates 5 mm. (B) The anti-microbial activity of rUu-ilys and rUu-ilys-CF against B. subtilis. The black bar indicates 5 mm.

AI 본문요약
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제안 방법

간략히 설명하면, 3개의 데이터베이스 Antimicrobial Peptide Database (APD, http://aps.unmc.edu/AP/prediction/prediction_main.php), Collection of Anti-Microbial Peptides (CAMP, http://www.camp.bicnirrh.res.in/prediction.php), Database of Antimicrobial Activity and Structure of Peptides (DBAASP, https://dbaasp.org/prediction)에서 제공되는 항균 활성 펩타이드 예측 기구를 사용하여 유도체의 소수성도, net charge, 항균 활성 펩타이드로서의 가능성, 그리고 α-helix 생성 여부를 조사하였다
여러 데이터베이스를 사용하여 개불 라이소자임의 아미노산 서열로부터 항균 활성을 가진 부위를 예측하였던 이전 연구 데이터를 활용하여 항균 활성을 가질 것으로 예측되는 개불 라이소자임 유래 유도체를 디자인하였다. 간략히 설명하면, 3개의 데이터베이스 Antimicrobial Peptide Database (APD, http://aps.
유도체를 생산하기 위하여 먼저 polymerase chain reaction (PCR)을 통해 유도체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 Uu- ilys-BamHI-M-CF (5’-CTAGGGGGGGATCCATGCCTCTGG- 3’)와 Uu-ilys-CF*-XhoI (5’-ggtggtgctcgagtcagcatctcccg-3’) pri- mer를 사용하여 증폭하였다

이론/모형

Uu-ilys-CF의 항균 활성은 ultrasensitive radial diffusion assay (URDA) 방법을 사용하여 측정하였다(Fig. 5A).
예측한 유도체 서열의 α-helix 특성을 설명하기 위하여 EMBOSS pepwheel (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/pepwheel)을 사용하여 helical wheel을 나타내었다
nl/cgi-bin/emboss/pepwheel)을 사용하여 helical wheel을 나타내었다. 유도체의 구조를 예측하기 위하여 de novo 펩타이드 구조 예측 도구(PEPFOLD 3, https://bioserv.rpbs.univ-paris-dider-ot.fr/services/PEP-FOLD3/)를 사용하여 3D 모델을 생성하였다.

성능/효과

Uu-ilys-CF (0.5 mg/ml)를 5 μl 사용하여 항균 활성을 확인한 결과, 가장 강한 항균 반응을 나타낸 균주는 그람 음성균인 S
subtilis에서 재조합 개불 라이소자임(rUu-ilys)과 Uu-ilys-CF의 활성을 비교하여 본 결과, 같은 농도(100 μg/ml)에서 개불 라이소자임이 Uu-ilys-CF보다 1.94배 더 큰 clear zone을 나타내었다
결론적으로 본 연구에서 개불 라이소자임의 C-말단 영역에 해당되는 유도체(Uu-ilys-CF)는 그람 양성균과 음성균에 대해 항균 활성을 나타내었다. 이 모델 펩타이드는 +2의 net charge, 42%의 소수성도를 가지는 양친매성 α-helix 구조를 가진다.

후속연구

coli BL21 (DE3)에서 TrxA가 연결된 퓨전 단백질로 과발현되어 BrCN처리에 의해 분리되었다. 본 논문의 결과를 토대로 Uu-ilys-CF와 개불 라이소자임의 항균 활성에 대한 시너지 효과를 추후 확인할 계획이다.

참고문헌 (34)

Andreu, D. and Rivas, L. 1998. Animal antimicrobial peptides: an overview. Biopolymers 47, 415-433.

상세보기
Bellamy, W., Takase, M., Wakabayashi, H., Kawase, K. and Tomita, M. 1992. Antibacterial spectrum of lactoferricin B, a potent bactericidal peptide derived from the N-terminal region of bovine lactoferrin. J. Appl. Bacteriol. 73, 472-479.

상세보기
Carrillo, W. and Ramos, M. 2018. Identification of antimicrobial peptides of native and heated hydrolysates from hen egg white lysozyme. J. Med. Food 21, 915-926.

상세보기
Epand, R. M. and Vogel, H. J. 1999. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 1462, 11-28.

상세보기
Gifford, J. L., Hunter, H. N. and Vogel, H. J. 2005. Lactoferricin: a lactoferrin-derived peptide with antimicrobial, antiviral, antitumor and immunological properties. Cell. Mol. Life Sci. 62, 2588-2598.

상세보기
Go, H. J., Kim, C. H., Park, J. B., Kim, T. Y., Lee, T. K., Oh, H. Y. and Park, N. G. 2019. Biochemical and molecular identification of a novel hepcidin type 2-like antimicrobial peptide in the skin mucus of the pufferfish Takifugu pardalis. Fish Shellfish Immunol. 93, 683-693.

상세보기
Hancock, R. E. W. and Diamond, G. 2000. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol. 8, 402-410.

상세보기
Ibrahim, H. R., Imazato, K. and Ono, H. 2011. Human lysozyme possesses novel antimicrobial peptides within its N-terminal domain that target bacterial respiration. J. Agric. Food Chem. 59, 10336-10345.

상세보기
Ibrahim, H. R., Thomas, U. and Pellegrini, A. 2001. A helix-loop-helix peptide at the upper lip of the active site cleft of lysozyme confers potent antimicrobial activity with membrane permeabilization action. J. Biol. Chem. 276, 43767-43774.

상세보기
Izadpanah, A. and Gallo, R. L. 2005. Antimicrobial peptides. J. Am. Acad. Dermatol. 52, 381-390.

상세보기
Lei, J., Sun, L., Huang, S., Zhu, C., Li, P., He, J., Mackey, V., Coy, D. H. and He, Q. 2019. The antimicrobial peptides and their potential clinical applications. Am. J. Transl. Res. 11, 3919-3931.
Lopez-Exposito, I., Minervini, F., Amigo, L. and Recio, I. 2006. Identification of antibacterial peptides from bovine kappa-casein. J. Food Prot. 69, 2992-2997.

상세보기
Mak, P., Wojcik, K., Silberring, J. and Dubin, A. 2000. Antimicrobial peptides derived from heme-containing proteins: hemocidins. Antonie Van Leeuwenhoek 77, 197-207.

상세보기
Malmsten, M., Davoudi, M., Walse, B., Rydengard, V., Pasupuleti, M., Morgelin, M. and Schmidtchen, A. 2007. Antimicrobial peptides derived from growth factors. Growth Factors 25, 60-70.

상세보기
Mine, Y., Ma, F. and Lauriau, S. 2004. Antimicrobial peptides released by enzymatic hydrolysis of hen egg white lysozyme. J. Agric. Food Chem. 52, 1088-1094.

상세보기
Nguyen, L. T., Haney, E. F. and Vogel, H. J. 2011. The expanding scope of antimicrobial peptide structures and their modes of action. Trends Biotechnol. 29, 464-472.

상세보기
Oh, H. Y., Kim, C. H., Go, H. J. and Park, N. G. 2018. Isolation of an invertebrate-type lysozyme from the nephridia of the echiura, Urechis unicinctus, and its recombinant production and activities. Fish Shellfish Immunol. 79, 351-362.

상세보기
Papareddy, P., Rydengard, V., Pasupuleti, M., Walse, B., Morgelin, M., Chalupka, A., Malmsten, M. and Schmidtchen, A. 2010. Proteolysis of human thrombin generates novel host defense peptides. PLoS Pathog. 6, e1000857.

상세보기
Park, I. Y., Park, C. B., Kim, M. S. and Kim, S. C. 1998. Parasin I, an antimicrobial peptide derived from histone H2A in the catfish, Parasilurus asotus. FEBS Lett. 437, 258-262.

상세보기
Pellegrini, A., Thomas, U., Bramaz, N., Klauser, S., Hunziker, P. and von Fellenberg, R. 1997. Identification and isolation of a bactericidal domain in chicken egg white lysozyme. J. Appl. Microbiol. 82, 372-378.

상세보기
Pellegrini, A., Thomas, U., Wild, P., Schraner, E. and von Fellenberg, R. 2000. Effect of lysozyme or modified lysozyme fragments on DNA and RNA synthesis and membrane permeability of Escherichia coli. Microbiol. Res. 155, 69-77.

상세보기
Powers, J. P. and Hancock, R. E. 2003. The relationship between peptide structure and antibacterial activity. Peptides 24, 1681-1691.

상세보기
Seo, J. K., Crawford, J. M., Stone, K. L. and Noga, E. J. 2005. Purification of a novel arthropod defensin from the American oyster, Crassostrea virginica. Biochem. Biophys. Res. Commun. 338, 1998-2004.

상세보기
Stark, M., Liu, L. P. and Deber, C. M. 2002. Cationic hydrophobic peptides with antimicrobial activity. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 3585-3590.

상세보기
Thammasirirak, S., Pukcothanung, Y., Preecharram, S., Daduang, S., Patramanon, R., Fukamizo, T. and Araki, T. 2010. Antimicrobial peptides derived from goose egg white lysozyme. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 151, 84-91.

상세보기
Valero, Y., Saraiva-Fraga, M., Costas, B. and Guardiola, F. A. 2020. Antimicrobial peptides from fish: beyond the fight against pathogens. Rev. Aquac. 12, 224-253.

상세보기
van't Hof, W., Veerman, E. C., Helmerhorst, E. J. and Amerongen, A. V. 2001. Antimicrobial peptides: properties and applicability. Biol. Chem. 382, 597-619.

상세보기
van der Kraan, M. I., Groenink, J., Nazmi, K., Veerman, E. C., Bolscher, J. G. and Nieuw Amerongen, A. V. 2004. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides 25, 177-183.

상세보기
Viejo-Diaz, M., Andres, M. T., Perez-Gil, J., Sanchez, M. and Fierro, J. F. 2003. Potassium efflux induced by a new lactoferrin-derived peptide mimicking the effect of native human lactoferrin on the bacterial cytoplasmic membrane. Biochem. Mosc. 68, 217-227.
Wang, G. 2015. Improved methods for classification, prediction and design of antimicrobial peptides. Methods Mol. Biol. 1268, 43-66.

상세보기
Yeaman, M. R. and Yount, N. Y. 2003. Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance. Pharmacol. Rev. 55, 27-55.

상세보기
Zasloff, M. 2002. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415, 389-395.

상세보기
Zavalova, L. L., Yudina, T. G., Artamonova, I. I. and Baskova, I. P. 2006. Antibacterial non-glycosidase activity of invertebrate destabilase-lysozyme and of its helical amphipathic peptides. Chemotherapy 52, 158-160.

상세보기
Zhang, L. J. and Gallo, R. L. 2016. Antimicrobial peptides. Curr. Biol. 26, R14-19.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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