본 연구는 위염, 위궤양, 위림프종 및 위암과 같은 소화기 질환의 원인균으로 알려진 H. pylori균을 항원으로 하여 젖소에 면역시킨 후 생산된 우유의 항원 항체의 특이성, H. pylori균 응집력, 항체의 산과 알칼리 및 열에 대한 안정성에 대해 조사하였다. Anti-H, pylori항체의 SDS-PAGE에 의한 분자량측정 결과 heavy chain은 50 kDa 정도, light chain은 24 kDa 정도로 확인되었다. H. pylori 항원 단백질의 분자량을 측정 한 결과 12개의 band가 확인되었고, anti-H, pylori의 항원 특이성을 알아보기 위해 western blotting을 한 결과 혈청, 혈청정제, 유청, 유청정제 모두 7개의 항원성 물질을 확인할 수 있었다. 그리고 주 항원성 물질은 분자량이 97, 66, 34 kDa이었다. 유청내 anti-H. pylori 특이 항체의 항균작용에 대해 알아보기 위해 실시한 균응집 반응결과 H. pylori 균에 대해 1/10의 높은 응집가를 나타내었다. 우유 및 유제품 생산시 발생할 수 있는 산${\cdot}$알칼리 및 열에 대한 anti-H, pylori항체의 안정성 실험결과 $pH5\~10$범위에서 안정한 상태로 $100\%$의 활성을 나타내었다. Anti-H, pylori 항체의 열에 대한 안정성 실험에서는 $60^{\circ}C$에서 60분간 안정한 상태를 보였고, $70^{\circ}C$에서도 비교적 안정한 상태였으나 60분 경과 후 $40\%$정도 활성이 감소하였다. $80^{\circ}C$에서는 4분간 처리 했을 때 $77\%$의 활성을 유지하였고, $100^{\circ}C$에서도 1분간은 비교적 안정한 상태였다.
본 연구는 위염, 위궤양, 위림프종 및 위암과 같은 소화기 질환의 원인균으로 알려진 H. pylori균을 항원으로 하여 젖소에 면역시킨 후 생산된 우유의 항원 항체의 특이성, H. pylori균 응집력, 항체의 산과 알칼리 및 열에 대한 안정성에 대해 조사하였다. Anti-H, pylori항체의 SDS-PAGE에 의한 분자량측정 결과 heavy chain은 50 kDa 정도, light chain은 24 kDa 정도로 확인되었다. H. pylori 항원 단백질의 분자량을 측정 한 결과 12개의 band가 확인되었고, anti-H, pylori의 항원 특이성을 알아보기 위해 western blotting을 한 결과 혈청, 혈청정제, 유청, 유청정제 모두 7개의 항원성 물질을 확인할 수 있었다. 그리고 주 항원성 물질은 분자량이 97, 66, 34 kDa이었다. 유청내 anti-H. pylori 특이 항체의 항균작용에 대해 알아보기 위해 실시한 균응집 반응결과 H. pylori 균에 대해 1/10의 높은 응집가를 나타내었다. 우유 및 유제품 생산시 발생할 수 있는 산${\cdot}$알칼리 및 열에 대한 anti-H, pylori항체의 안정성 실험결과 $pH5\~10$범위에서 안정한 상태로 $100\%$의 활성을 나타내었다. Anti-H, pylori 항체의 열에 대한 안정성 실험에서는 $60^{\circ}C$에서 60분간 안정한 상태를 보였고, $70^{\circ}C$에서도 비교적 안정한 상태였으나 60분 경과 후 $40\%$정도 활성이 감소하였다. $80^{\circ}C$에서는 4분간 처리 했을 때 $77\%$의 활성을 유지하였고, $100^{\circ}C$에서도 1분간은 비교적 안정한 상태였다.
This study has been carried out to examine the characteristics of anti-H. pylori antibodies of milk produced from cows immunized with antigen of Helicobacter pylori such as peculiarity of antigen antibody, agglutination of H. pylori strain, stability of antibody against acid, alkali and heat treatme...
This study has been carried out to examine the characteristics of anti-H. pylori antibodies of milk produced from cows immunized with antigen of Helicobacter pylori such as peculiarity of antigen antibody, agglutination of H. pylori strain, stability of antibody against acid, alkali and heat treatments. The molecular weight of anti-H. pylori antibody measured by SDS-PAGE were turned out as about 50 kDa in the heavy chain and about 24 kDa in the light chain. Twenty protein bands were visualized in H. pylori interacting with anti-H. pylori antibody which was made in dairy cow by immunization with H. pylori. The western blotting was peformed in order to examine the antigen peculiarity of anti-H. pylori, The results were all 7 antigen substances including serum, furified serum, whey and furified whey could be confirmed and the major antigen substances were 97, 66,34 kDa of molecular weight. As a result of agglutination response anti-H. pylori antibody in whey showed 1/10 agglutination value against H. pylori. In stability test about acid and alkali of antibody, there was $100\%$ activated at the range of $pH5\~pH10$. In stability test about heat, the antibody showed stable condition at $60^{\circ}C$ for 60 minutes and comparatively stable condition at $70^{\circ}C$, but reduced activation to $40\%$ after 60 minutes. It maintained $77\%$ activation at $80^{\circ}C$ for 4 minutes and comparatively stable at $100^{\circ}C$ for 1 minute.
This study has been carried out to examine the characteristics of anti-H. pylori antibodies of milk produced from cows immunized with antigen of Helicobacter pylori such as peculiarity of antigen antibody, agglutination of H. pylori strain, stability of antibody against acid, alkali and heat treatments. The molecular weight of anti-H. pylori antibody measured by SDS-PAGE were turned out as about 50 kDa in the heavy chain and about 24 kDa in the light chain. Twenty protein bands were visualized in H. pylori interacting with anti-H. pylori antibody which was made in dairy cow by immunization with H. pylori. The western blotting was peformed in order to examine the antigen peculiarity of anti-H. pylori, The results were all 7 antigen substances including serum, furified serum, whey and furified whey could be confirmed and the major antigen substances were 97, 66,34 kDa of molecular weight. As a result of agglutination response anti-H. pylori antibody in whey showed 1/10 agglutination value against H. pylori. In stability test about acid and alkali of antibody, there was $100\%$ activated at the range of $pH5\~pH10$. In stability test about heat, the antibody showed stable condition at $60^{\circ}C$ for 60 minutes and comparatively stable condition at $70^{\circ}C$, but reduced activation to $40\%$ after 60 minutes. It maintained $77\%$ activation at $80^{\circ}C$ for 4 minutes and comparatively stable at $100^{\circ}C$ for 1 minute.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
따라서 본 연구에서는 위 염, 위 궤양의 원인균인 H. pylori 를 항원으로 하여 젖소에 면역시켜 특이항체가 함유된 면역 우유를 생산하여 건강보조식품으로 이용하고자 항원의 특성을 조사하고 우유내 anti-H. pylori 항체의 첨가제 에 따른 열에 대한 안정성, 산에 대한 안정성 등을 조사하였다.
Anti-77. pylori 항체의 산과 알칼리 처리에 대한 안정성을 알아보기 위해 원유에서 casein이 제거된 유청(whey) 단백질을 pH 1 ~12 범위에서 항체 활성을 측정하였다. Anti-H.
pylori 를 항원으로 하여 젖소에 면역시켜 특이항체가 함유된 면역 우유를 생산하여 건강보조식품으로 이용하고자 항원의 특성을 조사하고 우유내 anti-H. pylori 항체의 첨가제 에 따른 열에 대한 안정성, 산에 대한 안정성 등을 조사하였다.
0x25 cm)에 유속 2 mL/min로통과시 켜 그 fraction을 수집 하였다(11-13). 각 fraction의 단백질 함량을 측정하기 위해 OD = 280 nm에서 흡광도를 측정하고, specific anti-H pylori 항체를 분획하기 위해 405 nm에서 ELISA 측정하였다.
기질로 alkaline phosphatase substrate를 사용하여 3분 반응 시켜 X-ray 필름상에서 항원물질을 확인하였다.
유청(whey)을 분리하여 시료로 사용하였다. 또한, 첨가물 첨가에 따른 열에 대한 안정성변화를 알아보기 위해 whey, 20% maltose, 20% glycerol, 0.2% glutamic acid를 첨 가하여 0.5 mL centrifuge tube에 150 uL씩 나누어 담아 heating block (model: HF-21, Yamato Scientific Co., Ltd)으로 60℃, 70℃, 80℃, 100℃ 그리고 135℃에서 시간별로 처리한 다음 Fig. 2와 같이 ELISA reader로 anti-H. pylori 항체 활성을 측정하였다.
설탕용액을 IgG와 IgY에 첨가하였을 때 열에 대한 방어 효과가 있는 것으로 나타난 연구보고(11)에 따라 본 실험 에서 는 20% maltose, 20% glycerol, 0.2% glutamic acid를 첨가하여 열에 대한 안정성을 실험한 결과 Fig. 8과 같다. 항체는 60℃에서 는 각 첨 가물 유청 에서 모두 6。분간 비교적 안정성을 유지 하였고, 70℃에서는 시간이 경 과함에 따라 활성 이 떨어지기 시작하여 60분 경과 후 전체적으로 활성이 40% 감소하였다.
계대배양으로 활성화된 균주는 56℃에서 30분간 불활성화시킨 fetal bovine serum(FRS) 이 5% 첨가된 MHB(Mueller Hinton Broth)배지에서 48시간 동안 액체 배양하였다. 실험 균주의 검 정 은 현 미 경 적 관찰, Gram염 색 과 urease test를 통해 실 시하였다.
Marker는 wide range(Sigma M4038)와 low range (Sigma M3913) 두 종류를 5 虬씩 loading하였다. 전기 영동 후 겔은 Coomassie blue로 염 색하여 단백질 band를 확인하였다.
초산에서 3산차에 이르는 착유우 흘스타인(Holstein) 6두를 대상으로 백신투여하였으며, 면역횟수는 총 4회 실시하였다. 1차 면역은 H pylori 항원을 Freund's incomplete adju-vant(Sigma F-5881)오+ 1 : 1 비 율로 유화(5,000 rpm, 5 min) 한 다음 젖소의 양쪽어깨 견갑골(scapula)부위 근육에 20 mL을 각각 4곳에 동일 량으로 나누어
침전된 caseine 실온에서 3, 000 rpm으로 10분 동안 원심 분리 하여 상등액 65mL에 포화 ammonium sulf가免((NH4)2SO4) 35 mL를 가하여 침전시키는 것을 3회 반복하였다. 침전된 단백질은 borated-bufferd saline(BBS, pH 8.4)에 투석 막으로 투석하여 동결건조하였다.
대상 데이터
0.5 M Tris-HCl 과 10% SDS, 30% acrylamide!- 함유한 4.0% (v/v) 농축 겔(stacking gel)을 사용하고, 분리 겔(separating gel)은 1.5 M Tris-HCl과 10% SDS, 30% acrylamide을 함유한 10% (v/v) 겔을 사용하였다. 분리정제된 항체단백질 30 Ug/11L (DW)를 sample buffer로 1 : 4로 희 석 하여 각 w이1에 20 μL 씩 loading하였다.
pylori 항체를 정 제 및 분획 하기 위해 PBS로 anti-H pylori 항체를 40 mg/mL로 녹인 후 총량 45 mL되게 하였다. 만들어진 시료는 Bio-Gel A-1.5 m Gel이 충전된 column(W 2.0x25 cm)에 유속 2 mL/min로통과시 켜 그 fraction을 수집 하였다(11-13). 각 fraction의 단백질 함량을 측정하기 위해 OD = 280 nm에서 흡광도를 측정하고, specific anti-H pylori 항체를 분획하기 위해 405 nm에서 ELISA 측정하였다.
2)으로 3회 세척하였다. 세척된 균은 얼음물에서 5분간 sonicate(pulse 20, duty cycle 50)하여 파장 667 nm에서 OD = 1.0이 되도록 맞춘 후 백신용 항원으로 사용하였고, 파장 405 nm에서 OD=0.5로 맞춘 것은 ELISA 분석용 항원으로 사용하였다.
우유중에 생성된 항체의 열에 대한 안정성을 알아보기 위해 유청(whey)을 분리하여 시료로 사용하였다. 또한, 첨가물 첨가에 따른 열에 대한 안정성변화를 알아보기 위해 whey, 20% maltose, 20% glycerol, 0.
한국유전자은행 으로부터 분양받은 H pyZon(KCTC12083) 균주는 아}eep blood agar(SBA) plate를 사용하여 CO2 농도 10%, 37℃에서 2~3일 간격으로 계대배양하였다. 계대배양으로 활성화된 균주는 56℃에서 30분간 불활성화시킨 fetal bovine serum(FRS) 이 5% 첨가된 MHB(Mueller Hinton Broth)배지에서 48시간 동안 액체 배양하였다.
성능/효과
Q0而균의 SDS-PAGE로 분자량 측정 결과 항원 단백질은 12개 band를 형성하였다. 12개의 단백질 가운데 1차 항체 (primary antibody)로 혈청, 혈청정제, 유청, 유 청정제물을 이용하여 western blotting한 결과 7개의 항원성 물질을 확인할 수 있었고, 그 중 주 항원성 물질은 분자량이 97, 66, 34kDa인 3개의 band를 확인할 수 있었다.
Anti-H. pylori 항체 의 활성을 측정한 결과 pH 5 ~ 10 범 위에 100%의 활성을 나타내었으나, pH 4 및 pH 11에서는 항체활성이 70%로 감소하였다. 그리고 pH 1~3 및 pH 12에서는 거의 활성을 나타내지 않았다(Fig.
8과 같다. 항체는 60℃에서 는 각 첨 가물 유청 에서 모두 6。분간 비교적 안정성을 유지 하였고, 70℃에서는 시간이 경 과함에 따라 활성 이 떨어지기 시작하여 60분 경과 후 전체적으로 활성이 40% 감소하였다. 항체는 80℃에서는 4분간 77%의 활성을 유지하였고, 시간이 지남에 따라 활성이 떨어져 8분 이후에는 모두 활성이 나타나지 않았다.
있다. 우유는 100℃에서도 1분 동안 어느 정도 안정성을 나타내는 결과를 볼 때 IgY보다 더 큰 안정성을 보이는 것으로 판단된다. 또한 항체에 첨가물 첨가가 열에 대해 안정성 에 영향을 끼 친다는 보고(21)가 있다.
유청 단백질의 열에 대한 변성을 전기영동법으로 조사한 결과에 따르면 immunoglobulin, serum albumin, P - lactoglobulin, a -lactalbumin 순으로 열 에 대해 안정 한 것 으로보고된 결과가 있으며, 또한 70℃에서 3분간 열처리에서도 안정성 이 11%, 48%, 68%, 95%정도로 감소한 연구결과(20) 를 볼 때 본 실험에서도 열에 대해 비교적 안정한 것으로 나타났다.
이상의 열에 대한 안정성 실험결과를 볼 때 우유살균 처리 방법 중 저 온유지 살균법 (62~65℃, 30분), 고온살균법 (HTST, 70℃~75℃, 15초), 초고온살균법 (UHT, 130℃~135℃, 1 ~5 초) 가운데 저온 및 고온살균법 에 의한 살균방법을 선택함으로 열처리로 인한 anti-H pylori 항체의 활성변화를 어느 정도 방지할 수 있을 것으로 판단된다.
후속연구
6과 같이 H. p이。ri균의 응집반응 결과를 볼 때 우유를 섭취함으로써 H. pylori 감염예방 및 치료효과가 가능할 것으로 판단된다.
참고문헌 (21)
Marshall BJ, Warren JR. 1984. Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet 323: 1311-1315
Michetti P, Kreiss C, Kotloff KL, Porta N, Blanco JL, Bachmann D, Herranz M, Saldinger PF, Corthesy-Theulaz I, Losonsky G, Nichols R, Simon J, Stolte M, Ackerman S, Monath TP, Blum AL. 1999. Oral immunization with urease and Escherichia coli heat-labile enterotoxin is safe and immunogenic in Helicobacter pylori-infected adults. Gastroenterology 116: 804-812
Kim BJ, Kang JH, Kim TY, Kim TH, Kim KW. 1997. Production and characterization of IgY specific to Helicobacter pylori. Kor J Appl Microbiol Biotechnol 25: 612-616
Mysore JV, Wigginton T, Simon PM, Zopf D, HemanAckam LM, Dubois A. 1999. Treatment of Helicobacter pylori infection in Rhesus monkeys using a novel anti adhesion compound. Gastroenterology 117: 1316-1325
Simon PM, Goode PL, Mobasseri A, Zopf D. 1997. Inhibition of Helicobacter pylori vinding to gastrointestinal infect. Immun 65: 750-757
Mabe K, Yamada M, Oguni I, Takahashi T. 1999. In vitro and in vivo activities of tea catechins against Helicobacter pylori. Antimicrob Agents Chemother 43: 1788-1791
Mobley HL, Jarvis KG, Elwood JP. 1993. Osogenic P-fimbrial deletion mutants of pyelonephritogenic Escherichia coli: the role of alpha Gal(1-4) beta Gal binding in virulence of a wild-type strain. Mol Microbiol 10: 143-155
Roe IH, Nam SW, Yang MR, Myung NH, Kim JT, Shim JY, 2002. The promising effect of egg yolk antibody (immunoglobulin yolk) on the treatment of Helicobacter pylori-associated gastric diseases. Kor J Gastroenterology 39: 260-268
Early EM, Hady H. 2001. Bactericidal effect of a whey protein concentrate with anti-Helicobacter pylori activity. J Appl Microbiol 90: 741-748
Shin NR, Kim JM, Yoo HS. 2001. Control of swine respiratory disease using egg yolk antibodies ill. Immunoprophylactic effect of IgY in mouse model. Kor J Vet Res 41: 351-356
Mulcahy G, O'Connor F, McGonigle S, Dowd A, Clery DG, Andrews SJ, Dalton JP. 1998. Correlation of specific antibody titre and avidity with protection in cattle immunized against Fasciola hepatica. Vaccine 16: 932-939
Chen CC, Tu YY, Chang HH. 2000. Thermal stability of bovine milk immunoglobulin G (IgG) and the effect of added thermal protectants on the stability. J Food Sci 65: 188-193
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.