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문제 정의
- 11,12 그러나 아직까지 유전자 요법만으로 암의 사멸을 유도할 수 있는 기술은 확립되어 있지 않고 다른 항암요법과 병행하여 치료효율을 증진시키는 연구가 활발히 진행되고 있다. 따라서 본 연구에서는 항암제와 유전자를 동시에 병소에 전달할 수 있는 리포솜을 전달체로 개발하고자 하였다. 현재까지 양이온성 리포솜을 유전자와 결합시키는 방법은 유전자만을 전달할 수 있는 방법으로서, 리포솜을 구성하고 있는 인지질에 비하여 상대적으로 분자량이 큰 DNA에 의하여 리포솜의 형태가 파괴될 수 있는 단점이 있고 리포솜의 내부에 항암제와 같은 약물을 봉입하는 것이 불가능하다13.
- 일반적인 리포솜은 체내 투여 시 구조적으로 불안정해질 수 있고 따라서 병소 이외의 부위에서 방출된 약물이 정상세포를 손상시키는 부작용을 나타낸다. 본 연구에서는 항암약물을 봉입한 리포솜의 안정성을 향상시키고 리포솜의 표면에 양이온성을 부여함으로써 DNA와 전기적으로 중성인 복합체를 형성하기 위하여 다가의 양이온성 고분자인 키토산으로 리포솜의 표면을 개질하고자 하였다. 따라서 제조된 음이온성 리포솜 중 DPPA가 9.
- 본 연구에서는 항암제와 유전자를 동시에 전달하기 위하여 항암제를 리포솜의 내부에 봉입시키고, 리포솜의 안정성을 향상시키고 유전자와의 정전기적 인력에 의해 복합체를 형성할 수 있도록 키토산으로 리포솜의 표면을 개질하였다. 또한 키토산으로 표면개질된 리포솜과 DNA의 복합체를 제조하여 복합체의 특성을 분석하고 인체유래 자궁암 세포주를 대상으로 리포솜/DNA 복합체의 세포 이입효과를 평가하였다.
제안 방법
- 키토산이 코팅된 리포솜과 DNA의 결합을 관찰하기 위하여 전기영동법과 형광측정법을 사용하였다. 1 μg/μl 농도로 제조한 DNA 용액 1μl와 키토산으로 코팅된 리포솜 용액 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 16.0 및 35.0 μl를 각각 혼합한 후, 3차 증류수를 이용하여 최종부피가 200 μl가 되도록 한 후, 복합체가 형성될 수 있도록 혼합용액을 상온에서 30분간 숙성하였다. 0.
- 전술한 바와 같이 체내에서 리포솜 입자가 간이나 비장에서 흡수되지 않고 혈액에서 장기간 순환할 수 있는 리포솜 입자의 임계크기는 300 nm 정도이다. 따라서 Liposome 4의 지질조성비를 갖는 음이온성 리포솜을 0.1%(w/v) 농도의 키토산 용액으로 반응시켜 표면개질하는 조건으로 제조된 리포솜을 DNA의 결합 실험에 적용하였다.
- 본 연구에서는 항암약물을 봉입한 리포솜의 안정성을 향상시키고 리포솜의 표면에 양이온성을 부여함으로써 DNA와 전기적으로 중성인 복합체를 형성하기 위하여 다가의 양이온성 고분자인 키토산으로 리포솜의 표면을 개질하고자 하였다. 따라서 제조된 음이온성 리포솜 중 DPPA가 9.58 mg/ml의 농도로 첨가되어진 표면전하가 가장 음의 값을 나타내는 리포솜4(Liposome 4)를 이용하여 키토산의 코팅 실험을 진행하였다.
- 본 연구에서는 항암제와 유전자를 동시에 전달하기 위하여 항암제를 리포솜의 내부에 봉입시키고, 리포솜의 안정성을 향상시키고 유전자와의 정전기적 인력에 의해 복합체를 형성할 수 있도록 키토산으로 리포솜의 표면을 개질하였다. 또한 키토산으로 표면개질된 리포솜과 DNA의 복합체를 제조하여 복합체의 특성을 분석하고 인체유래 자궁암 세포주를 대상으로 리포솜/DNA 복합체의 세포 이입효과를 평가하였다.
- 리포솜과 DNA의 복합체 형성에서 리포솜 용액과 DNA용액의 최적조성비를 확인하기 위하여 1 μg/μl 농도로 제조한 DNA 용액 1 μl와 키토산 코팅 리포솜 용액을 0.25-35.0 μl의 양으로 변화시켜 혼합한 후, 상온에서 30분간 반응시켜 리포솜/DNA 복합체를 제조하였다. Fig.
- 한편 항암제의 로딩율은 음이온성 지질의 함유여부와 관계없이 70-80% 수준을 나타내었다. 리포솜의 안정성 향상과 DNA와의 전기적 중성 복합체 형성을 위해 음이온성 리포솜의 표면을 다가의 양이온성 고분자인 키토산으로 표면개질하여 입자크기가 평균 220 nm, 표면전하 값이 +30 mV인 리포솜을 제조하였다. 리포솜/DNA의 복합체 형성을 전기영동 시험과 EtBr 형광강도 측정 시험으로 확인한 결과, DNA와 키토산 코팅 리포솜의 최적조성비는 1:1(v/v)이었다.
- 본 연구에서는 리포솜 내부에 항암제를 함유함과 동시에 유전자와 복합체를 형성하는 항암제 함유 리포솜/DNA 복합체를 제조하고 물리화학적 특성 분석 및 세포이입 효과를 관찰하였다. 음이온성 지질인DPPA를 함유한 음이온성 리포솜의 입자크기는 평균 170 nm이었고 표면전하 값은 -50 mV였다.
- 선행 결과에서 표면전하가 가장 음의 값을 갖는 Liposome 4의 지질 조성비로 제조된 리포솜 입자를 키토산 수용액으로 코팅하고 키토산 농도에 따른 특성변화를 조사하였다. 키토산의 농도를 달리하여 표면처리한 리포솜 입자의 크기 변화를 Fig.
- 자궁암 세포주인 HeLa 세포를 이용하여 키토산 코팅 리포솜/DNA 복합체의 세포이입 효과를 관찰하였고 그 결과를 Fig. 6에 나타내었다.
- 음이온성 인지질인 DPPA를 첨가하여 리포솜 표면에 음전하를 도입한 후, 음이온성 리포솜 용액과 키토산 용액을 혼합하여 정전기적인 이온결합을 유도하였다. 키토산용액의 농도는 0.10, 0.25 그리고 0.50%(w/v)로서 상온에서 반응을 진행하였고, 리포솜에 결합되지 않은 키토산은 원심분리를(19000×g, 40분)하여 제거하였다. 한편, 음이온성 리포솜의 표면에 키토산의 코팅은 입자의 크기 변화와 표면전하를 측정하여 판단하였다.
대상 데이터
- 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 plasmid DNA(pcDNA-GFP)는 Qiagen mega kit(Qiagen, CA, USA)를 사용하여 정제하였다. Plasmid DNA의 정량은 최대 흡수파장 260 nm에서 UV-spectrophotometer를 사용하여 정량하였다.
- 리포솜과 DNA복합체의 세포 전달효과를 관찰하기 위하여 자궁암 세포주인 HeLa세포를 Korean Cell Line Bank(KCLB)에서 구입하여 사용하였다. 세포는 5% CO2 존재하의 숙성기에서 Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM) 용액과 소혈장 용액의 혼합 배지로 37 ℃에서 배양하였다.
- 시약. 리포솜을 제조하기 위한 지질로서 L-α-phosphatidylcholine(soyhydrogenated)(HSPC), Cholesterol(CHOL), 1-α-phosphatidylcholine-1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-n-[methoxy(polyethyleneglycol)-2000](DSPE-mPEG2000), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate acid(DPPA)는 Avanti Polar Lipids Inc.(Alabaster, AL, USA)에서 구입하여 사용하였다. 모델 약물로는 독소루비신(doxorubicin, DOX)을 보령제약(주)에서 구입하여 사용하였다.
- (Alabaster, AL, USA)에서 구입하여 사용하였다. 모델 약물로는 독소루비신(doxorubicin, DOX)을 보령제약(주)에서 구입하여 사용하였다. 키토산(저분자량, 점도 20000 cps, 탈아세틸화 80%)은 Sigma Aldrich Inc.
- 모델 약물로는 독소루비신(doxorubicin, DOX)을 보령제약(주)에서 구입하여 사용하였다. 키토산(저분자량, 점도 20000 cps, 탈아세틸화 80%)은 Sigma Aldrich Inc.(Milwaukee, USA)에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에서 사용한 지질과 독소루비신의 화학구조는 Fig.
이론/모형
- Plasmid DNA의 정량은 최대 흡수파장 260 nm에서 UV-spectrophotometer를 사용하여 정량하였다. DNA는 0.8% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동법에 의하여 확인하였다.
- 키토산이 코팅된 리포솜과 DNA의 결합을 관찰하기 위하여 전기영동법과 형광측정법을 사용하였다. 1 μg/μl 농도로 제조한 DNA 용액 1μl와 키토산으로 코팅된 리포솜 용액 0.
성능/효과
- 한편, EtBr을 이용하여 리포솜/DNA 복합체의 형광강도 감소 정도를 측정결과, 키토산 코팅 리포솜의 양이 증가함에 따라 형광강도가 감소하는 결과를 나타내어 키토산 코팅 리포솜과 DNA가 전기적으로 중성인 복합체를 형성함을 확인하였다. 결과적으로, DNA와 리포솜이 1:1(v/v) 이상의 비율로 혼합되었을 때 리포솜과 유전자가 복합체를 형성함을 알 수 있었다. 그러나 1:1(v/v)을 초과하는 비율로 키토산 코팅 리포솜 용액을 사용하는 경우 DNA가 리포솜과의 복합체 형성에 이용되지만 복합체 형성에 참여하지 않는 잉여의 양이온성 리포솜이 많아질수록 과도한 양이온성으로 인해 혈중에서 단백질 흡착 등의 문제를 발생시킬 수 있어서 정맥주사제로서는 부적절하다고 판단된다.
- 반면, (B)는 키토산 코팅 리포솜과 DNA의 복합체를 세포와 숙성시킨 결과로서, DNA가 HeLa 세포에 이입되어 GFP를 발현하고 있음을 알 수 있었다. 결과적으로, 키토산 코팅 리포솜과 DNA의 전기적 중성복합체가 세포에 이입되는 것을 확인할 수 있었으며, 유전자와 약물을 동시에 함유한 복합체를 리포솜을 중재하여 세포내부로 이입시킬 수 있음을 확인하였다.
- 결과적으로, DNA와 리포솜이 1:1(v/v) 이상의 비율로 혼합되었을 때 리포솜과 유전자가 복합체를 형성함을 알 수 있었다. 그러나 1:1(v/v)을 초과하는 비율로 키토산 코팅 리포솜 용액을 사용하는 경우 DNA가 리포솜과의 복합체 형성에 이용되지만 복합체 형성에 참여하지 않는 잉여의 양이온성 리포솜이 많아질수록 과도한 양이온성으로 인해 혈중에서 단백질 흡착 등의 문제를 발생시킬 수 있어서 정맥주사제로서는 부적절하다고 판단된다. 따라서 본 연구에서 키토산 코팅 리포솜과 DNA의 부피비를 1:1(v/v)로 유지하는 것이 최적임을 알 수 있었으며, 이 조건에서 제조된 리포솜/DNA 복합체를 사용하여 세포이입 효과를 관찰하였다.
- 5는 키토산 코팅 리포솜 용액의 양에 따른 DNA와의 복합체 형성 거동을 아가로스 겔에 의한 전기영동으로 분석한 결과(A)와 리포솜/DNA 복합체에 EtBr을 첨가한 후, EtBr의 형광 강도의 변화를 측정한 결과(B)를 나타낸다. 대조군으로서 복합체를 형성하지 않은 naked DNA가 전기영동에 의해 이동하는 것에 반하여 리포솜/DNA의 복합체를 형성시킨 시료는 키토산 코팅 리포솜의 양이 증가함에 따라 DNA와 전기적으로 중성인 복합체를 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 한편, EtBr을 이용하여 리포솜/DNA 복합체의 형광강도 감소 정도를 측정결과, 키토산 코팅 리포솜의 양이 증가함에 따라 형광강도가 감소하는 결과를 나타내어 키토산 코팅 리포솜과 DNA가 전기적으로 중성인 복합체를 형성함을 확인하였다.
- 그러나 1:1(v/v)을 초과하는 비율로 키토산 코팅 리포솜 용액을 사용하는 경우 DNA가 리포솜과의 복합체 형성에 이용되지만 복합체 형성에 참여하지 않는 잉여의 양이온성 리포솜이 많아질수록 과도한 양이온성으로 인해 혈중에서 단백질 흡착 등의 문제를 발생시킬 수 있어서 정맥주사제로서는 부적절하다고 판단된다. 따라서 본 연구에서 키토산 코팅 리포솜과 DNA의 부피비를 1:1(v/v)로 유지하는 것이 최적임을 알 수 있었으며, 이 조건에서 제조된 리포솜/DNA 복합체를 사용하여 세포이입 효과를 관찰하였다.
- 리포솜의 안정성 향상과 DNA와의 전기적 중성 복합체 형성을 위해 음이온성 리포솜의 표면을 다가의 양이온성 고분자인 키토산으로 표면개질하여 입자크기가 평균 220 nm, 표면전하 값이 +30 mV인 리포솜을 제조하였다. 리포솜/DNA의 복합체 형성을 전기영동 시험과 EtBr 형광강도 측정 시험으로 확인한 결과, DNA와 키토산 코팅 리포솜의 최적조성비는 1:1(v/v)이었다. 자궁암 세포주인 HeLa세포를 이용한 세포이입성 평가 결과, 리포솜/DNA 복합체는 세포이입에 효과적임을 확인하였다.
- 음이온성 지질인 DPPA가 첨가되지 않은 중성의 리포솜의 입자의 크기와 표면전하가 각각 120 nm와 0 mV인 반면, DPPA의 첨가에 의해 리포솜의 입자 크기는 170±10 nm로 증가하였고, 표면전하는 음의 값을 나타내었다. 리포솜의 표면전하가 음이온성 지질인 DPPA를 첨가함에 따라 음의 값으로 감소하는 결과는 표면전하가 음이온성인 리포솜의 제조에 효과적임을 나타낸다. 한편, DPPA의 농도가 3.
- 본 연구에서는 리포솜 내부에 항암제를 함유함과 동시에 유전자와 복합체를 형성하는 항암제 함유 리포솜/DNA 복합체를 제조하고 물리화학적 특성 분석 및 세포이입 효과를 관찰하였다. 음이온성 지질인DPPA를 함유한 음이온성 리포솜의 입자크기는 평균 170 nm이었고 표면전하 값은 -50 mV였다. 한편 항암제의 로딩율은 음이온성 지질의 함유여부와 관계없이 70-80% 수준을 나타내었다.
- 리포솜/DNA의 복합체 형성을 전기영동 시험과 EtBr 형광강도 측정 시험으로 확인한 결과, DNA와 키토산 코팅 리포솜의 최적조성비는 1:1(v/v)이었다. 자궁암 세포주인 HeLa세포를 이용한 세포이입성 평가 결과, 리포솜/DNA 복합체는 세포이입에 효과적임을 확인하였다. 따라서 본 연구의 키토산 코팅 리포솜은 항암제와 유전자를 동시에 전달할 수 있는 복합치료용 전달체로서 매우 유용하다고 판단되며, 현재 리포솜/DNA 복합체에 의한 세포이입효율과 세포독성 및 항암 치료 효과에 대한 평가를 진행 중이다.
- 음이온성 지질인DPPA를 함유한 음이온성 리포솜의 입자크기는 평균 170 nm이었고 표면전하 값은 -50 mV였다. 한편 항암제의 로딩율은 음이온성 지질의 함유여부와 관계없이 70-80% 수준을 나타내었다. 리포솜의 안정성 향상과 DNA와의 전기적 중성 복합체 형성을 위해 음이온성 리포솜의 표면을 다가의 양이온성 고분자인 키토산으로 표면개질하여 입자크기가 평균 220 nm, 표면전하 값이 +30 mV인 리포솜을 제조하였다.
- 대조군으로서 복합체를 형성하지 않은 naked DNA가 전기영동에 의해 이동하는 것에 반하여 리포솜/DNA의 복합체를 형성시킨 시료는 키토산 코팅 리포솜의 양이 증가함에 따라 DNA와 전기적으로 중성인 복합체를 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 한편, EtBr을 이용하여 리포솜/DNA 복합체의 형광강도 감소 정도를 측정결과, 키토산 코팅 리포솜의 양이 증가함에 따라 형광강도가 감소하는 결과를 나타내어 키토산 코팅 리포솜과 DNA가 전기적으로 중성인 복합체를 형성함을 확인하였다. 결과적으로, DNA와 리포솜이 1:1(v/v) 이상의 비율로 혼합되었을 때 리포솜과 유전자가 복합체를 형성함을 알 수 있었다.
후속연구
- 자궁암 세포주인 HeLa세포를 이용한 세포이입성 평가 결과, 리포솜/DNA 복합체는 세포이입에 효과적임을 확인하였다. 따라서 본 연구의 키토산 코팅 리포솜은 항암제와 유전자를 동시에 전달할 수 있는 복합치료용 전달체로서 매우 유용하다고 판단되며, 현재 리포솜/DNA 복합체에 의한 세포이입효율과 세포독성 및 항암 치료 효과에 대한 평가를 진행 중이다.
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