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문제 정의
- 따라서 리포솜의 혈류 내 안정성을 증진시키기 위 하여 생체 적합성이 높고 생체 내 분해가 가능한 단 백질 분자를 리포솜의 표면에 결합시켜 혈장 단백질 의 흡착을 억제할 수 있는 약물전달체를 개발하고자 하였다. 알부민은 혈청에 존재하는 단백질 중 50~55% 를 차지하며 5.
- 본 연구에서는 리포솜의 혈류 순환시 혈장 단백질 과의 흡착을 억제하기 위하여 양이온성 리포솜에 알 부민을 정전기적 인력을 이용하여 코팅한 후, 리포솜 표면에 결합된 알부민을 열에너지에 의해 변성시켜 알부민이 결합된 리포솜을 제조하였다. 양이온성 리 포솜에 결합된 알부민의 양은 브래드포드 단백질정 량법으로 측정하였고, BSA-양이온성 리포솜을 랫트 혈장과 혼합하여 37T에서 시간에 따른 입자크기 변 화와 혈장 단백질 흡착량을 측정하여 대조 리포솜 및 양이온성 리포솜과의 혈장 단백질 흡착특성을 비교, 평가하였다.
가설 설정
- 2：Not determined; doxorubicin was not added to BSA solution.
제안 방법
- BSA를 리포솜의 표면에 정전기적 인력에 의해 결 합시키기 위하여 양이온성 리포솜을 제조하였고, 양 이온성 리포솜의 구성성분으로서 DSTAP을 함유하지 않고 HSPC와 CHOL만으로 제조한 대조 리포솜을 제 조하였으며 대조 리포솜과 양이온성 리포솜의 입자 크기, 표면전하값, 약물의 봉입률 및 삼투압을 Table 2 에 나타내었다. 대조 리포솜과 양이온성 리포솜의 입 자크기는 약 102〜107 nm 범위에서 분포하였고, 전기 적으로 중성인 대조리포솜의 표면전하값은 0.
- 열처리에 의한 알부민의 변성 여부는 BSA 용액 또 는 열처리한 BSA 용액의 표면전하값의 변화를 관찰 하여 확인호］였다. pH 7.4의 PBS 수용액에 BSA를 800 卩g/ml의 농도로 용해한 후 수용액을 4°C에서 30분간 보관한후 용액의 표면전하값과 위의 용액을 각각 60, 80 그리고 100 °C의 온도에서 30분간 열처리한 후 용액 의 표면전하값을 제타전위 측정기를 사용하여 측정 하였다. 또한 열처리 온도가 변성 알부민으로 코팅된 리포솜(BSA-양이온성 리포솜)의 혈장 단백질 흡착 특 성에 미치는 영향을 조사하기 위해 BSA를 양이온성 리포솜과 이온결합시킨 용액을 각각 60, 80 그리고 100 °C에서 30분 동안 열처리한 리포솜 용액을 랫트 혈장과 1:3 (v/v)의 비율로 혼합하고 37 °C에서 48시간동안 교 반하면서 시간에 따른 입자 크기 변화를 광산란 장치 를 이용하여 측정하였다.
- 4의 PBS 수용액에 BSA를 용해시켜 BSA분자가음이온으로 하전된 BSA 수용액을 제조하였고, 리포솜의 양이온과 BSA 분자 의 음이온간의 정전기적 인력에 의해 결합되도록 하 였다. pH 7.4의 PBS 수용액에 BSA의 농도가 각각 100, 200, 400, 600, 800 그리고 1000 卩g/ml가 되도록 제조한 BSA 수용액을 양이온성 리포솜 용액에 20 卩】/ min의 속도로 서서히 가하면서 37 °C에서 1시간 동안 교반하였고, 양이온성 리포솜 용액과 BSA 수용액이 최종적으로 1:1 (v/v)가 되도록 하였다. 리포솜의 표 면에 결합하지 않은 BSA는 Centricon®을 이용하여 4,000 rpm에서 2회 이상 원심분리하여 제거하였다.
- 购긔리포솜 표면에 결합된 변성 된 알부민의 양은 브래드포드 단백질정량법 (Bradford protein assay)으로 정량하였다.” 96 well plate의 각각 의 well에 알부민이 결합된 리포솜 용액 0.1 ml과 BioRad Protein Assay 시약 0.1 ml을 가한 후, ELISA로 최대 흡수파장 595 nm에서 흡광도를 측정하였고, BSA 의 검량선은 각각 대조 리포솜과 양이온성 리포솜 용 액에 BSA를 1mg/ml의 농도가 되도록 용해시키고 100*>C에서 30분간 열처리한 시료를 사용하여 작성하 였다.24
- 대조 리포솜, 양이온성 리포솜 및 BSA-양이온성 리 포솜의 혈장에서의 안정성을 비교하기 위하여 상기 변성 알부민으로 코팅된 리포솜의 혈장 내 안정성 평 가에서 제시한 것과 동일한 조건과 방법으로 입자크 기의 변화를 관찰하였고, 혈장 단백질의 흡착량을 브 래드포드 단백질정량법을 이용하여 리포솜 표면에 흡 착한 단백질의 양을 측정하였다.23 제조된 리포솜 용 액을 혈장과 1:3 (v/v)의 비율로 혼합하여 37 °C에서 교 반하면서 일정시간마다 시료를 1ml씩 채취한 후, Centricon®을 이용하여 4,000 rpm에서 원심분리하고 1 ml의 PBS로 세척하는 과정을 2회 반복하여 혈장 단 백질이 흡착된 리포솜과 혈장 단백질을 분리하였다.
- 대조 리포솜은 HSPC와 CHOL를 12.6:8.3 mM의 비 율로 제조하였고, 양이온성 리포솜은 HSPC오｝ CHOL 및 DSTAP을 11.3:8.3:1.4 mM의 비율로 제조하였으며 두 리포솜의 최종 지질 농도는 12.8mg/ml가 되도록 하였다. 리포솜의 제조는 각각의 지질을 클로로포름 에 용해시킨 후, 회전응축증발기를 사용하여 45*>C에 서 감압 증류하며 둥근 바닥 플라스크 내벽에 얇은 지질막을 형성시켰다.
- % 혈장은 6주령의 SpragueDawley 랫트에서 혈액을 채취한 뒤 헤파린 용액과 1:1 (v/v)로 혼합하고 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하 여 혈구를 제거한 혈장만을 얻어 사용하였다. 또한 리 포솜의 표면에 결합된 변성 알부민의 양이 혈장 단백 질의 흡착 특성에 미치는 영향을 알아보기 위해 각각 양이온성 리포솜을 100, 200, 400, 600, 800 그리고 1000 卩g/ml 농도의 BSA 수용액으로 코팅하고 열처리 한 BSA-양이온성 리포솜 용액을 혈장과 1:3 (v/v)로 혼합하여 37*>C에서 교반하면서 시간에 따른 입자 크 기 변화를 광산란 장치를 이용하여 측정하였다.%
- 4의 PBS 수용액에 BSA를 800 卩g/ml의 농도로 용해한 후 수용액을 4°C에서 30분간 보관한후 용액의 표면전하값과 위의 용액을 각각 60, 80 그리고 100 °C의 온도에서 30분간 열처리한 후 용액 의 표면전하값을 제타전위 측정기를 사용하여 측정 하였다. 또한 열처리 온도가 변성 알부민으로 코팅된 리포솜(BSA-양이온성 리포솜)의 혈장 단백질 흡착 특 성에 미치는 영향을 조사하기 위해 BSA를 양이온성 리포솜과 이온결합시킨 용액을 각각 60, 80 그리고 100 °C에서 30분 동안 열처리한 리포솜 용액을 랫트 혈장과 1:3 (v/v)의 비율로 혼합하고 37 °C에서 48시간동안 교 반하면서 시간에 따른 입자 크기 변화를 광산란 장치 를 이용하여 측정하였다.% 혈장은 6주령의 SpragueDawley 랫트에서 혈액을 채취한 뒤 헤파린 용액과 1:1 (v/v)로 혼합하고 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하 여 혈구를 제거한 혈장만을 얻어 사용하였다.
- 23 제조된 리포솜 용 액을 혈장과 1:3 (v/v)의 비율로 혼합하여 37 °C에서 교 반하면서 일정시간마다 시료를 1ml씩 채취한 후, Centricon®을 이용하여 4,000 rpm에서 원심분리하고 1 ml의 PBS로 세척하는 과정을 2회 반복하여 혈장 단 백질이 흡착된 리포솜과 혈장 단백질을 분리하였다. 리 포솜에 흡착된 단백질의 양은 상기 리포솜에 결합된 알 부민의 열 변성에 제시한 방법과 동일하게 실시하였다.
- 리포솜 표면에 혈장 단백질이 흡착되는 것을 억제 하기 위하여 양전하를 갖는 리포솜의 표면을 음전하 를 갖는 알부민으로 코팅하였으며, 알부민이 결합된 리포솜의 혈장 내 안정성을 강화하기 위하여 리포솜 표면에 결합된 알부민을 열에 의해 변성시켰다. 표면 이 알부민으로 개질된 리포솜의 혈장 내 안정성과 단 백질 흡착정도를 평가하기 위하여 대조 리포솜, 양이 온성 리포솜, 그리고 변성 된 알부민으로 개질된 리 포솜의 물리적 특성을 고찰하였고 랫트 혈장 내에서 의 시간에 따른 입자크기 변화와 단백질 흡착정도를 평가하여 알부민이 결합된 리포솜의 안정성을 확인 하였다.
- 리포솜에 결합된 알부민을 변성하기 위하여 BSA가 결합된 양이온성 리포솜 용액을 100*>C에서 30분간 열처리를 실시하였다.购긔리포솜 표면에 결합된 변성 된 알부민의 양은 브래드포드 단백질정량법 (Bradford protein assay)으로 정량하였다.
- 모델 약물인 DOX의 봉입은 리포솜 내부와 외부의 암모늄설페이트의 이온농도 구배를 이용한 리모트 로 딩법을 사용하였고, 암모늄설페이트가 봉입된 리포솜 용액과 DOX 수용액을 1:1 (v/v)로 혼합하여 60 °C에 서 2시간 동안 교반하여 DOX을 리포솜 내부에 봉입 시켰다. 봉입되지 않은 DOX는 4°C에서 48시간 동안 막투석을 실시하여 제거하였고, 독소루비신의 봉입효 율은 UV-VIS 분광광도계를 이용하여 최대 흡수파장 497 nm에서 DOX의 농도를 측정한 후 계산에 의해 산출하였다.끄 대조 리포솜과 양이온성 리포솜 용액을 20 mM의 L-histidine 완충용액(pH 6.
- 본 연구에서는 리포솜의 혈류 순환시 혈장 단백질 과의 흡착을 억제하기 위하여 양이온성 리포솜에 알 부민을 정전기적 인력을 이용하여 코팅한 후, 리포솜 표면에 결합된 알부민을 열에너지에 의해 변성시켜 알부민이 결합된 리포솜을 제조하였다. 양이온성 리 포솜에 결합된 알부민의 양은 브래드포드 단백질정 량법으로 측정하였고, BSA-양이온성 리포솜을 랫트 혈장과 혼합하여 37T에서 시간에 따른 입자크기 변 화와 혈장 단백질 흡착량을 측정하여 대조 리포솜 및 양이온성 리포솜과의 혈장 단백질 흡착특성을 비교, 평가하였다. 알부민이 결합된 리포솜은 혈장에서 48 시간동안 입자크기가 증가하지 않았고, 혈장 단백질 의 흡착양도 대조 리포솜 및 양이온성 리포솜에 비하 여 적었다.
- 양이온성 리포솜에 정전기적 인력에 의해 결합된 BSA를 변성시키는 열처리 온도가 BSA-양이온성 리 포솜의 혈장 내 안정성에 미치는 영향을 조사하기 위 하여 각각 60, 80 그리고 100 °C의 온도에서 30분간 열처리한 시료의 혈장 내에서의 입자 크기 변화를 관 찰하였다. Fig.
- 양이온성 리포솜을 각각 100, 200, 400, 600, 800 그 리고 1000 卩g/ml 농도로 PBS (pH 7.4)에 용해시킨 용 액으로 코팅한 BSA-양이온성 리포솜의 입자크기, 표 면전하값, 리포솜에 결합된 알부민의 양 및 약물봉입 률을 Fig. 1에 나타내었다. BSA의 등전점보다 높은 pH 7.
- 양이온성 리포솜의 표면에 알부민을 결합시키기 위 해 BSA의 등전점보다 높은 pH 7.4의 PBS 수용액에 BSA를 용해시켜 BSA분자가음이온으로 하전된 BSA 수용액을 제조하였고, 리포솜의 양이온과 BSA 분자 의 음이온간의 정전기적 인력에 의해 결합되도록 하 였다. pH 7.
- 리포솜 표면에 혈장 단백질이 흡착되는 것을 억제 하기 위하여 양전하를 갖는 리포솜의 표면을 음전하 를 갖는 알부민으로 코팅하였으며, 알부민이 결합된 리포솜의 혈장 내 안정성을 강화하기 위하여 리포솜 표면에 결합된 알부민을 열에 의해 변성시켰다. 표면 이 알부민으로 개질된 리포솜의 혈장 내 안정성과 단 백질 흡착정도를 평가하기 위하여 대조 리포솜, 양이 온성 리포솜, 그리고 변성 된 알부민으로 개질된 리 포솜의 물리적 특성을 고찰하였고 랫트 혈장 내에서 의 시간에 따른 입자크기 변화와 단백질 흡착정도를 평가하여 알부민이 결합된 리포솜의 안정성을 확인 하였다.
대상 데이터
- 또한 열처리 온도가 변성 알부민으로 코팅된 리포솜(BSA-양이온성 리포솜)의 혈장 단백질 흡착 특 성에 미치는 영향을 조사하기 위해 BSA를 양이온성 리포솜과 이온결합시킨 용액을 각각 60, 80 그리고 100 °C에서 30분 동안 열처리한 리포솜 용액을 랫트 혈장과 1:3 (v/v)의 비율로 혼합하고 37 °C에서 48시간동안 교 반하면서 시간에 따른 입자 크기 변화를 광산란 장치 를 이용하여 측정하였다.% 혈장은 6주령의 SpragueDawley 랫트에서 혈액을 채취한 뒤 헤파린 용액과 1:1 (v/v)로 혼합하고 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하 여 혈구를 제거한 혈장만을 얻어 사용하였다. 또한 리 포솜의 표면에 결합된 변성 알부민의 양이 혈장 단백 질의 흡착 특성에 미치는 영향을 알아보기 위해 각각 양이온성 리포솜을 100, 200, 400, 600, 800 그리고 1000 卩g/ml 농도의 BSA 수용액으로 코팅하고 열처리 한 BSA-양이온성 리포솜 용액을 혈장과 1:3 (v/v)로 혼합하여 37*>C에서 교반하면서 시간에 따른 입자 크 기 변화를 광산란 장치를 이용하여 측정하였다.
- (Milwaukee, USA)에서 구입하여 사용하였다. Bio-Rad Protein Assay 시약은 Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules California 94547 USA)에서 구입하여 사용하였고, 모델 약물로 사용한 독소루비신(doxorubicin, DOX)은 Boruyng Inc. (Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 투석막은 분획 분자 량 (molecular weight cut off, MWCO)이 12,000~14,000 인 것을 Viskase Co.
- 리포솜 제조는 회전응축증발기 (Rotavapor R-200, Buchi, Switzerland), 초음파 발생기 (Ultrasonicator, 500, Fisher Scientific, USA), 그리고 가압압출기 (Nothern Lipids Inc. Canada)롤 사용하였다. 제조된 리포솜의 입자크기는 광산란장치 (ELS-Z, OTUSKA Electronics Co.
- 리포솜 제조에 사용된 지질인 L-a-phosphatidylcholine (soy-hydrogenated) (HSPC), cholesterol (CHOL), 1,2- distearoyl-3-trimethylammonium-propane (DSTAP)은 Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL, USA)에서 구 입하여 사용하였다. 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)과 (S)-2-amino-3-(4-imidazolyl)propionic acid (Lhistidine)은 Sigma Aldrich Inc.
- (Alabaster, AL, USA)에서 구 입하여 사용하였다. 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)과 (S)-2-amino-3-(4-imidazolyl)propionic acid (Lhistidine)은 Sigma Aldrich Inc. (Milwaukee, USA)에서 구입하여 사용하였다. Bio-Rad Protein Assay 시약은 Bio-Rad Laboratories, Inc.
- Canada)롤 사용하였다. 제조된 리포솜의 입자크기는 광산란장치 (ELS-Z, OTUSKA Electronics Co., Japan)를 사용하였고, 제타전위 측정은 제타전위 즉정기 (ELS-Z, OTUSKA Electronics Co., Japan)를 사 용하였다. 리포솜 내의 약물 봉입률은 UV-VIS 분광 광도계(UV mini 1240, Shimadzu, Japan)을 사용하여 측정하였고, 제조된 리포솜 용액의 삼투압은 삼투압 측정기(Osmomat 030, GONOTEC GmbH.
- (Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 투석막은 분획 분자 량 (molecular weight cut off, MWCO)이 12,000~14,000 인 것을 Viskase Co. (Illinois, USA)에서 구입하여 사 용하였고, 정제에 이용한 Centricon® (MWCO 100,000) 은 Millipore Co., (Bedford, MA 01730, USA)에서 구 입하여 사용하였다. 그 밖에 실험에 사용한 용매 및 시약은 일급시약 및 특급시약을 그대로 사용하였다.
- 리포솜의 제조는 각각의 지질을 클로로포름 에 용해시킨 후, 회전응축증발기를 사용하여 45*>C에 서 감압 증류하며 둥근 바닥 플라스크 내벽에 얇은 지질막을 형성시켰다. 형성된 지질막은 250 mM의 암 모늄설페이트 용액으로 지질막이 완전히 분산될 때 까지 수화하여 리포솜 용액을 제조하였다. 제조된 리 포솜 용액은 입자의 크기를 조절하기 위하여 가압압 줄기로 각각 200 nm, 100 nm, 그리고 80nm의 공극 을 갖는 폴리카보네이트 분리막(Whatman, USA)을 이 용하여 각각 5 회 이상 가압 압출하였고, 리포솜 내 부에 봉입되지 않은 암모늄설페이트는 4。。에서 48시 간 동안 막투석을 실시하여 제거하였다.
이론/모형
- 리포솜에 결합된 알부민을 변성하기 위하여 BSA가 결합된 양이온성 리포솜 용액을 100*>C에서 30분간 열처리를 실시하였다.购긔리포솜 표면에 결합된 변성 된 알부민의 양은 브래드포드 단백질정량법 (Bradford protein assay)으로 정량하였다.” 96 well plate의 각각 의 well에 알부민이 결합된 리포솜 용액 0.
- , Japan)를 사 용하였다. 리포솜 내의 약물 봉입률은 UV-VIS 분광 광도계(UV mini 1240, Shimadzu, Japan)을 사용하여 측정하였고, 제조된 리포솜 용액의 삼투압은 삼투압 측정기(Osmomat 030, GONOTEC GmbH., Germany)를 사용하였으며, 리포솜에 결합된 알부민의 정량분석은 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay, EL808, Bio-Tek Ins, USA)를 사용하였다.
- 모델 약물인 DOX의 봉입은 리포솜 내부와 외부의 암모늄설페이트의 이온농도 구배를 이용한 리모트 로 딩법을 사용하였고, 암모늄설페이트가 봉입된 리포솜 용액과 DOX 수용액을 1:1 (v/v)로 혼합하여 60 °C에 서 2시간 동안 교반하여 DOX을 리포솜 내부에 봉입 시켰다. 봉입되지 않은 DOX는 4°C에서 48시간 동안 막투석을 실시하여 제거하였고, 독소루비신의 봉입효 율은 UV-VIS 분광광도계를 이용하여 최대 흡수파장 497 nm에서 DOX의 농도를 측정한 후 계산에 의해 산출하였다.
성능/효과
- 이는 BSA 에 가해진 열에너지에 의해 BSA의 접힌 구조를 형성 하는 수소결합이 끊어져 소수성 잔기가 BSA의 표면 에 노출된 일차구조의 형태로 변성되었기 때문이고, 아미드기 및 카르복실기가 일차구조로 펼쳐진 BSA 분자의 표면으로 노출되어 표면전하값의 변화가 나 타난 것으로 생각된다.'2 이러한 결과로부터 BSA는 80OC의 온도에서 30분간 처리하여 변성을 일으킬 수 있으며 열처리 온도가 높을수록 변성을 크게 유도할 수 있음을 확인하였다. 따라서, DOX가 봉입된 양이 온성 리포솜에 800 卩g/ml 농도의 BSA 용액으로 코팅 한 BSA-양이온성 리포솜을 100 °C의 온도조건에서 열처리하였으며, 열처리하지 않고 4。0에서 보관한 시 료와 100 °C로 30분간 열처리한 시료의 입자크기, 표 면전하값 그리고 약물봉입률을 Table 1에 나타내었다.
- Fig. 1의 (a)에 제시한 바와 같이 100~1000 卩g/ml 농도의 BSA용액으로 코팅하고 열처 리한 BSA-양이온성 리포솜의 입자크기는 평균 110.8± 5.6 nm로 BSA를 코팅하지 않은 양이온성 리포솜에 비해 입자크기가 약 5 nm 정도 증가되었다. 또한 100~1000 卩gml 농도의 BSA용액으로 코팅하고 열처 리한 BSA-양이온성 리포솜은 평균 -1.
- 그러나 혈장 내에서 대조 리포솜 표면에 흡착되는 혈장 단백질은 변성이 일어나지 않 은 단백질이기 때문에 혈장 내에서 비가역적으로 흡 착되는 활성을 가지고 있지만, BSA-양이온성 리포솜 에 결합되어 있는 단백질은 변성된 단백질이므로 소 수성 잔기가 경계면을 형성하여 유체역학적으로 자 유에너지가 최소화되어 있기 때문에 친수성 그룹이 표면에 드러나 있는 혈장 단백질과 상호 흡착이 억제 되는 것으로 사료된다.13,14,26,27 이러한 결과로 인해 BSA-양이온성 리포솜 표면에 결합되어 있는 변성된 알부민은 혈장 내에서 혈장 단백질과 동등하게 존재 할 수 있고, 혈장 단백질과의 흡착을 억제시켜 단백 질이 흡착된 리포솜간의 상호 응집을 방지할 수 있다 는 것을 확인할 수 있었다.
- 5는 37 °C 배양기에서 리포솜 수용액을 랫트 혈장과 1:3 (v/v) 비율로 혼합하여 교반하면서 시간에 따른 단백질 흡착량을 브래드포드 단백질정량법으로 측정한 결과이다.23 모든 리포솜들의 표면에 흡착된 단백질의 양은 시간이 지남에 따라 점차 증가되는 것으로 관찰되었다. 특히 양이온성 리포솜은 입자크기 가 증가한 이유와 마찬가지로 모든 리포솜들 중에서 혈장 단백질이 가장 많이 흡착되는 것으로 나타났고, 48시간 경과 후 약 8mg/ml 리포솜의 단백질 흡착량 이 관찰되었다.
- 心 그러나 리포솜은 정맥 주사 투여시 간이나 비장의 세망내피계에 의해 흡수되고, 또한 대식세포에 의하여 쉽게 소실되어 혈 류 내 반감기가 짧아지는 단점을 가지고 있고, 혈장 단백질의 흡착 및 리포솜간의 응집현상에 의해 구조 적으로 불안정해지기 때문에 봉입된 약물이 누출되 어 정상세포에 독성을 미치는 문제를 가지고 있다 w 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 폴리에틸렌글 리콜과 같이 생체 적합성이 있고 유동성을 갖는 친수 성 고분자와 지질을 공유결합시킨 복합체를 리포솜 의 이중층에 도입하여 리포솜의 표면에 혈장 단백질 의 흡착을 방지함으로써 리포솜의 혈류 내 안정성을 향상시키는 방법이 사용되어 왔다.6$ 이와 같은 폴리 에틸렌글리콜-지질 유도체가 도입된 리포솜은 EPR (enhanced permeability and retention) 효과에 의해서 암 조직이나 염증 부위에 선택적으로 축적되어 결과 적으로 병소로의 약물전달 효율을 높이는 방법이었 다.6 그러나 폴리에틸렌글리콜-지질 유도체를 도입한 리포솜은 이러한 장점에 반해 생체 내 효소에 의해서 분해되지 않고 세포에 축적되어 세포 기능 장애를 유 발하거나, 표적부위에서 약물의 방출을 저해하여 치 료 효능이 감소되는 단점을 가지고 있다?"2
- 이는 열처리 온도가 높을수록 BSA의 변성이 크게 일 어나기 때문에 601나 80P로 열처리한 BSA-양이 온성 리포솜의 BSA는 소수성 잔기가 표면에 완전히 드러나 있지 않아 단백질 고유의 활성에 의해 혈장 단백질과 흡착이 일어나고 또한 혈장 단백질이 흡착 된 리포솜간에 상호응집이 일어나 입자크기가 증가 한 것으로 사료된다. 그러나 BSA-양이온성 리포솜의 표면에 결합되어 있는 BSA를 100。。로 30분간 열처 리한 시료의 경우 BSA의 접힘이 풀어진 일차구조로 변성되면서 소수성 잔기가 리포솜 표면에 드러나 있 는 형태가 되어 용해도와 혈장에서 활성이 감소되고, 따라서 친수성 그룹이 표면에 드러나 있는 혈장 단백 질과의 친화도가 감소하여 혈장 단백질의 흡착이 감 소하였기 때문인 것으로 사료된다「3』4 이상의 결과로 부터 100 °C, 30분의 열처리 조건은 BSA-양이온성 리 포솜의 표면에 결합되어 있는 BSA를 60 °C 또는 80 °C 의 조건보다 BSA의 변성을 크게 유도하고, 변성된 알 부민은 혈장 단백질 흡착을 효과적으로 억제함을 확 인하였다.
- 1의 (b)는 100~1000 卩gml 농도의 BSA용액으로 코팅하고 열처리한 BSA-양이 온성 리포솜의 표면에 결합된 BSA의 양과 약물봉입 률을 나타낸 것이다. 각각 100, 200, 400, 600, 800 및 1000 卩g/ml 농도로 PBS (pH 7.4)에 용해시킨 용액으로 코팅한 BSA-양이온성 리포솜의 표면에 결합된 BSA 의 양을 브래드포드 단백질정량법으로 측정한 결과, 각 각 28.9±7.7, 38.5±3.4, 32.4±9.5, 124.7±8.4, 147.3±18.5 및 368.9±44.6 卩g/ml 리포솜의 값을 나타내 었다. 양이온 성 리포솜에 100〜400 卩g/ml 농도의 BSA 용액으로 코 팅한 BSA-양이온성 리포솜은 BSA의 양과는 관계없 이 일정량의 알부민이 결합되 었고, 600~1000 卩gml 농도의 BSA 용액으로 코팅한 BSA-양이온성 리포솜 은 BSA 용액의 농도가 증가할수록 BSA-양이온성 리 포솜에 결합된 알부민의 양도 점차 증가되었다.
- 5 mV로 4*>C에 보관한 BSA 수용액과 차이를 나타내지 않았 다. 그러나 각각 80 °C와 100 °C로 30분간 열처리한 BSA 수용액의 표면전하값은 각각 -8.8±1.7mV와 - 0.3±0.1 mV로 열처리 온도가 높을수록 표면전하값이 점차 중성으로 변화되는 것이 확인되었다. 이는 BSA 에 가해진 열에너지에 의해 BSA의 접힌 구조를 형성 하는 수소결합이 끊어져 소수성 잔기가 BSA의 표면 에 노출된 일차구조의 형태로 변성되었기 때문이고, 아미드기 및 카르복실기가 일차구조로 펼쳐진 BSA 분자의 표면으로 노출되어 표면전하값의 변화가 나 타난 것으로 생각된다.
- 5 卩g/ml 리포솜의 알부민이 결합되어 있는 BSA-양이온 성 리포솜을 랫트 혈장과 1:3 (v/v) 비율로 혼합한 후 37P에서 교반하며 시간에 따른 입자크기를 측정한 결과이다. 대조 리포솜은 시간이 흐를수록 입자크기 가 점차 비례적으로 증가하는 경향을 나타내었고, 양 이온성 리포솜은 혈장과 혼합되자마자 입자크기가 급 격하게 증가하는 것으로 나타났다. 대조 리포솜과 양 이온성 리포솜은 시간이 지날수록 혈장 단백질이 리 포솜 표면에 흡착되고, 혈장 단백질이 흡착된 리포솜 상호간의 응집현상에 의해서 입자크기가 증가된 것 으로 사료된다.
- 3에 나타내었다. 모든 BSA양이온성 리포솜은 48시간 후 평균 122.2±4.3 nm의 입자크기를 나타내어 48시간동안 입자크기가 거의 증 가하지 않았다. 이와 같은 결과로 인해 리포솜 표면 에 결합되어 있는 변성된 알부민이 단백질 흡착을 억 제함을 확인하였고, 특히 800 |ig/ml 농도의 BSA 용 액으로 코팅하여 147.
- 6 卩g/ml 리포솜의 값을 나타내 었다. 양이온 성 리포솜에 100〜400 卩g/ml 농도의 BSA 용액으로 코 팅한 BSA-양이온성 리포솜은 BSA의 양과는 관계없 이 일정량의 알부민이 결합되 었고, 600~1000 卩gml 농도의 BSA 용액으로 코팅한 BSA-양이온성 리포솜 은 BSA 용액의 농도가 증가할수록 BSA-양이온성 리 포솜에 결합된 알부민의 양도 점차 증가되었다. BSA양이온성 리포솜에 결합된 BSA는 열처리에 의해 그 구조가 구상에서 선형의 일차구조로 변성되어 아미 노산의 소수성 잔기가 분자의 표면에 드러나고, 수용 액에서 용해도가 낮아지며 펼쳐진 선형의 분자가 리 포솜 표면에 정전기적 인력과 소수성 인력에 의해 결 합되어 있을 것으로 사료된다.
- 4)에 용해시킨 800 卩g/ml 농도의 BSA 수용액을 4。。에서 30분간 보관한 시료의 표면전하값 과 각각 60, 80 그리고 100 °C의 온도에서 30분간 열 처리한 시료의 표면전하값을 Table 1에 나타내었다. 열처리를 하지 않고 4 °C에 보관한 BSA 수용액은 BSA 의 등전점보다 높은 pH 7.4의 조건에서 -23.8±8.4mV 의 표면전하값을 나타내었고, 60OC에서 30분간 열처 리한 BSA 수용액의 표면전하값은 -21.9±2.5 mV로 4*>C에 보관한 BSA 수용액과 차이를 나타내지 않았 다. 그러나 각각 80 °C와 100 °C로 30분간 열처리한 BSA 수용액의 표면전하값은 각각 -8.
- 따라서, DOX가 봉입된 양이 온성 리포솜에 800 卩g/ml 농도의 BSA 용액으로 코팅 한 BSA-양이온성 리포솜을 100 °C의 온도조건에서 열처리하였으며, 열처리하지 않고 4。0에서 보관한 시 료와 100 °C로 30분간 열처리한 시료의 입자크기, 표 면전하값 그리고 약물봉입률을 Table 1에 나타내었다. 열처리하지 않고 ¥C에 보관한 BSA-양이온성 리포 솜의 입자크기, 표면전하값 그리고 약물봉입률은 각 각 120.8±9.8nm, -3.6±4.6 mV, 그리고 93.8%이었고, 100 °C로 30분간 열처리한 BSA-양이온성 리포솜의 입 자크기, 표면전하값 그리고 약물봉입률은 각각 107.8 ±2.4 nm, -1.5±0.23mV 그리고 83.8%로 측정되었다. 100 °C로 30분간 열처리에 의해 리포솜의 입자크기와 표면전하값은 큰 변화를 나타내지 않았으나 약물봉 입률은 약 10% 정도 감소하였는데 이는 열처리 후 BSA-양이온성 리포솜을 Centricon®으로 정제하는 과 정에서 발생한 손실로 사료된다.
- 4 卩gml 리포솜으로 가장 적은 단백질 흡착량이 측정되었다. 이러한 결과로 인해서 BSA-양이온성 리포솜은 대조 리포솜과 양이온성 리포솜보다 혈장 내에서 입자크 기 변화가 가장 적고, 흡착된 단백질의 양도 가장 적 은 것으로 나타나 안정성이 가장 뛰어난 것으로 관찰 되었다.
- 100 °C로 30분간 열처리에 의해 리포솜의 입자크기와 표면전하값은 큰 변화를 나타내지 않았으나 약물봉 입률은 약 10% 정도 감소하였는데 이는 열처리 후 BSA-양이온성 리포솜을 Centricon®으로 정제하는 과 정에서 발생한 손실로 사료된다. 이러한 결과로부터 본 연구에서 이용한 열처리법은 리포솜 표면의 BSA 를 변성시키면서 리포솜의 물리적 특성과 약물 봉입 률에는 큰 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
- 9%의 약물봉입률을 나타내었다. 이상의 결 과로부터 대조 리포솜, 양이온성 리포솜 그리고 BSA양이온성 리포솜은 110 nm 이하의 입자크기를 나타 내어 암의 신생혈관의 세포간극을 투과할 수 있는 약 물전달체로로 이용될 수 있을 것으로 판단하였다.
- 3 nm의 입자크기를 나타내어 48시간동안 입자크기가 거의 증 가하지 않았다. 이와 같은 결과로 인해 리포솜 표면 에 결합되어 있는 변성된 알부민이 단백질 흡착을 억 제함을 확인하였고, 특히 800 |ig/ml 농도의 BSA 용 액으로 코팅하여 147.3±18.5 卩g/ml 리포솜의 알부민 이 결합된 BSA-양이온성 리포솜은 48시간동안 입자 크기 증가가 가장 적게 나타나 각 농도의 BSA 용액 으로 코팅한 BSA-양이온성 리포솜 중에서 안정성이 가장 우수한 제형 임을 확인할 수 있었다.
- 23 모든 리포솜들의 표면에 흡착된 단백질의 양은 시간이 지남에 따라 점차 증가되는 것으로 관찰되었다. 특히 양이온성 리포솜은 입자크기 가 증가한 이유와 마찬가지로 모든 리포솜들 중에서 혈장 단백질이 가장 많이 흡착되는 것으로 나타났고, 48시간 경과 후 약 8mg/ml 리포솜의 단백질 흡착량 이 관찰되었다. BSA-양이온성 리포솜의 경우에는 리 포솜 표면에 결합되어 있는 변성된 알부민이 경계면을 형성하고 있기 때문에 48시간 이후 437.
후속연구
- 이와 같이 변성된 알부민으로 결합 된 리포솜은 일반 리포솜이 혈류 내에서의 불안정성 으로 인해 봉입된 약물이 누출되거나 혈장 단백질의 흡착으로 인해 입자크기가 증가되어 간이나 비장의 세망내피계에 존재하는 대식세포에 의해 쉽게 소실 되는 단점을 극복할 수 있고, 리포솜 내부에 봉입되 어 있는 약물을 안정하게 전달할 수 있으므로 정상세 포에 독성을 끼치는 문제점도 극복할 수 있을 것이다. 따라서 혈장 내에서 입자의 크기 변화가 없고, 단백 질 흡착을 억제하는 BSA-양이온성 리포솜은 혈류 내 에서 장기 순환 할 수 있는 안정한 약물전달체로서 응용할 수 있을 것으로 생각된다.
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