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문제 정의
- 본 연구에서는 AHAs 함유 화장품 성분 중 그 함량이 제일 높고 가장 작은 크기로 피부 침투력이 높은 glycolic acid로 피부암 유발 각용이 알려진 UV에 의한 피부 자극에 의 한 세포 증식을 억제하고 과도한 세포사를 억제하는지를 UV를 처치한 가우스피부에서 연구하였고, kera- tinocyte에 UV 단독 치리와 UV와 glycolic acid를 병행 처리하여 세포 성장, apoptosis, apoptosis 관련 유전자(ca spase-3) 를 비교 분석함으로써 UV에 의한 표피세포의 변화과정에서 glycolic acid가 어떤 방어 역할을 하는지에 대하여 살펴보고 또한 그 작용기작에 대하여 규명하고자 하였다.
- 본 연구에서는 굉노화 실험동물인 hairless mouse에 UV를 조사하여 일어나는 광손상을 살펴보고, 이러한 광 손상 과정에서 자외선 조사 횟수의 차이가 어떠한 영향을 주는지와 광손성이 일어난 hairless mouse의 피부에 glycolic acid가 미치는 영향에 대하여 알아보고자 하였다. UV 조사에 따른 hairless mouse에서 .
- Immotalized keratinocyte 배양 세포에 U5B를 조사하여 UV에 대한 세포 증식에 glycolic acid가 어떠한 영향을 미치는가를 세포 수준에서 연구하였다. 세포증식은 UV에 의하여 억제듸었으며 glycoHc acid가 UVB의 세포증식 억제를 방어함을 확인하였다.
제안 방법
- 사용하였다. 사육환경은 온도 23 ± 2°C, 습도 50 士 10%, 12 h 조명 (AM 07:00 〜 PM 07:00) 하에 사육하였으며, 사료는 mouse용 고형사료를, 음용수는 상수를 제한 없이 섭취시켰다. 실험동물을 대조군(자외선 비조사군), 자외선 조사군 및 자외선조사 + glycolic acid 처리 군의 실험군으로 각각 15마리씩 나누었다.
- 사육환경은 온도 23 ± 2°C, 습도 50 士 10%, 12 h 조명 (AM 07:00 〜 PM 07:00) 하에 사육하였으며, 사료는 mouse용 고형사료를, 음용수는 상수를 제한 없이 섭취시켰다. 실험동물을 대조군(자외선 비조사군), 자외선 조사군 및 자외선조사 + glycolic acid 처리 군의 실험군으로 각각 15마리씩 나누었다. UV조사는 최초 UVA를 1.
- UV조사는 최초 UVA를 1.134 mj/cm?의 조사량으로 1회 조사하였으며, UVB 조사량 0.035 mJ/ciS으로 1주마다 10%씩 증가시켜주 5회 노출시켰으미, glycolic acid 처리군은 50% gly colic acid를 PEG (])olyethylene glycol) base cream으로 만들어 pH 3.0으로 보정하여 일회 처리 시 80 mg의 glycolic acid에 해당하는 양을 실험동물의 1x2 cm2 면적의 등 중앙부위에 주 2회로도포하였으며, UV 조사에 의한 피부세포 손상 및 이ycolic acid의 세포 손상억제 효과를 23주간 매주 관찰하였다.
- Louis, USA) 에서구입하였고, 등 부위에도포하기 용이하도록 PEG cream 을 만들어서 사용하였다. PEG cream은 PEG 8000 (Sig ma Co.)과 PEG 400 (USB CO.)을 1:2 (w/v)가 되도록 조제하였으며, PEG base cream은 D.W와 PEG cream의 비율을 2:1로 조제하였다. PEG base cream에 50% (w/v) 이되도록 glycolic acid를 넣어 용해시킨 후 pH 3.
- 조직을 10 두께로 cryostat section 하여 slide 상에서 4% paraformaldehyde 로 고정시키고 PBS에 30 min 담가둔 다음 3% 压以를첨가한 blocking serum solution (goat serum)으로 30 min간 반응시킨다. 또는 파라핀에 포맷된 슬라이드는 xylene 100%에 5 min씩 3회 세척한 후, 에탄올 100%, 95%, 80%에 5 min씩 담근 다음 증류수로 세척하여 파라핀 제거 과정을 거친 후 3% H2O2를 첨가한 blocking serum sohition으로 30 min간 반응시켰다. 여기에 PBS로 적당히 희석된 1차 항체를 떨어뜨리고 파라필름으로 덮은 후 4°C에서 ovemight 했다.
- 에탄올 80%, 95%, 100%에 5 min씩 순서대로 담근 다음 xylene 100%에 5 min씩 3회담근다. Mounting media (Fisher scientific)를 떨어뜨린 후 커버 슬라이드로 덮고 현미경상에서 세포핵이 갈색으로 염색된 것을 확인하고 촬영하였다. caspase-3 reactive cell의 확인도 같은 방법으로 실시하였으며, active caspase-3 antibody (1: 1000 희석) 사용하여 확인하였다.
- 1% Triton XT00을 넣어준 뒤에 4°C 얼음에 2 min간 incubation시킨 후에 각각의 슬라이드에 TUNEL mixture 50 “L를 넣어 37°C에서 2 h 정도 둔다. 2 h 후에 PBS로 세척을 하고 convert-POD를 50 ㎕씩 넣고 37℃에서 1 h 정도 처리한 다음에 DAB solution으로 30 sec ~ 1 min간 발색시킨 뒤 cover glass 를 덮고 광학현미경으로 관찰하였다.
- 96 well plate에 1 x 10° cells/mL 의 세포를 100 “L씩 파종하여, 37°C, 5% CO2 incubator에서 하루 정도 배양한 후 혈청이 없는 배지로 바꾸어 24 h 이상을 배양하였다. Serum starvation을 한 후 실험물질이 함유된 혈청이 없는 배양액으로 교환하여 24 h 배양 후 상층의 배지를 제거한 후 세척하였으며 배지를 제거하기 1 h 전에 UV心를 조사하였다.
- )를 2 mg/mL의 농도로 준비하여 50 ㎕씩 첨가한 후 3 h에서 4 h 동안 반응을 시켰다. 각 well당 시 험물질 220 “L를 제거하고 보라색 물질 30 만 남긴 후 DMSO를 150 ㎕ 첨가하여 microplate mixer 상에서 10 min간 잘 혼합하여 침전물을 용해시킨 후 96 well plate ELISA reader에서 540 nm 흡광도로 O.D. (optical density) 값을 측정하였다. 모든 시험 결과는 세포를 배양하지 않은 대조well에서 측정된 흡광도에 대하여 보정한 값을 산출하였다.
- 실험동물의 피부조직을 잘라내어 슬라이드를 만든 후 PCNA 항체를 이용하여 효소 반응을 시켰다. PCNA 항체를 이용한 세포 증식의 양상은 immunohistochemical staining 방법으로 분한 결과 대조군에 비해 UV 단독 처리 군에서 갈색으로 관찰되는 PCNA 항체가 결합된 세포수가 현저히 증가되었으며 UV와 glycolic acid를 병행 처리한 군에서는 UV 단독 처리 군보다 전체적으로 PCNA가 관찰되는 세포 수가 감소되었다(Figure 1).
- In vivo에서 얻은 glycolic acid의 세포증식 효과가 in vitro 결과에서도 일치하는지와 더 구체적인 작용 기전 연구를 위하여 인체 피부세포를 배양하였다. 피부세포가 UV에 의해 증식되는 것을 농도별 glycolic acid로 처리했을 때 따른 피부세포 증식 억제 효과에 대한 실험을 하였다.
- 피부세포가 UV에 의해 증식되는 것을 농도별 glycolic acid로 처리했을 때 따른 피부세포 증식 억제 효과에 대한 실험을 하였다.
- HaCaT cells에서 정상 세포와 UVB (60 mj/cm?)만 단독으로 처리한 세포, 그리고 glycolic acid를 농도별로 UVB와 병행 처리 하여 apoptosis가 어떻게 변화하는지를 Tunel 염색약으로 세포 내 직접 염색하여 관찰하였다. 정상 세포에 glycolic acid 농도를 0.
- 정상 세포에 glycolic acid 농도를 0.1 〜1 mM로 처리한 후 24 h 동안 배양하여 세포를 회수하였으며 회수하기 1 h 전에 UVB (60 mj/cn?)를 조사하였다. 현미경상에서 염색질(chromatin)의 응축을 관찰하여 apoptosis의 경향을 보았으며, apoptotic body의 결정은 Tunel 방법에 의하여 염색질이 응축되어 진하게 염색된 곳(chromatin conden- sation)이 3〜4개 발견되는 시점으로 결정하였다.
- 1 〜1 mM로 처리한 후 24 h 동안 배양하여 세포를 회수하였으며 회수하기 1 h 전에 UVB (60 mj/cn?)를 조사하였다. 현미경상에서 염색질(chromatin)의 응축을 관찰하여 apoptosis의 경향을 보았으며, apoptotic body의 결정은 Tunel 방법에 의하여 염색질이 응축되어 진하게 염색된 곳(chromatin conden- sation)이 3〜4개 발견되는 시점으로 결정하였다.
- 표피층의 과증식을 유도하는 각질형성세포(keratinocyte) 를 glycolic acid가 영향을 주는지를 in uitro에서 실험하였다. Immotalized keratinocyte 배양 세포에 U5B를 조사하여 UV에 대한 세포 증식에 glycolic acid가 어떠한 영향을 미치는가를 세포 수준에서 연구하였다.
- 1% lithium carbonate solution에 약 15 sec 정도 담가 둔 후 다시 증류수로 세척하였다. 에탄올 80%, 95%, 100%에 5 min씩 순서대로 담근 다음 xylene 100%에 5 min씩 3회담근다. Mounting media (Fisher scientific)를 떨어뜨린 후 커버 슬라이드로 덮고 현미경상에서 세포핵이 갈색으로 염색된 것을 확인하고 촬영하였다.
- In vitro 배양시험은 immortalized human keratinocyte 인 HaCaT cell을 이용하여 세포 증식에 glycolic acid가 어떠한 영향을 미치는가를 세포 수준에서 연구하였다.
대상 데이터
- 실험동물은 국립독성연구원에서 생산한 6주령의 SPF (specific pathogen free) hairless mice (femaleX 7일 이상의 기간 동안 매일 관찰하여 건강한 동물만을 선발하여 실험에 사용하였다. 사육환경은 온도 23 ± 2°C, 습도 50 士 10%, 12 h 조명 (AM 07:00 〜 PM 07:00) 하에 사육하였으며, 사료는 mouse용 고형사료를, 음용수는 상수를 제한 없이 섭취시켰다.
- 실험물질로는 glycolic acid와 UV를 사용하였으며, gly colic acid는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA) 에서구입하였고, 등 부위에도포하기 용이하도록 PEG cream 을 만들어서 사용하였다. PEG cream은 PEG 8000 (Sig ma Co.
- 본 실험에 사용된 세포주는 독일의 krebsforschung- szentrum 암연구소의 Norbert 박사로부터 분양받은 사람 피부 세포주(HaCaT cell)를 사용하였다.
- 이용된다. 배양액은 10% fetal bovine serum (FBS) 과 1%의 penicillin-streptomycin을 포함한 DMEM (Dul- beccos Modified Eagles Medium), F-12 Nutrient mix ture, NaHCQ을 사용하였다. 약 85%의 습도하에서 5% CO를 공급하는 37°C incubator (Sanyo Co.
데이터처리
- (optical density) 값을 측정하였다. 모든 시험 결과는 세포를 배양하지 않은 대조well에서 측정된 흡광도에 대하여 보정한 값을 산출하였다.
- Sigmastat 프로그램 (Version 2.03, J Scientific Co)을이용하여 MTT assay, apoptosis 시험 결과치를 one way ANOVA 검정을 실시한 후 multiple comparison test (Dunnett's method)를 실시하여 p값이 0.05 이하인 것을 유의성 있는 것으로 "로 표시하였다.
이론/모형
- Mounting media (Fisher scientific)를 떨어뜨린 후 커버 슬라이드로 덮고 현미경상에서 세포핵이 갈색으로 염색된 것을 확인하고 촬영하였다. caspase-3 reactive cell의 확인도 같은 방법으로 실시하였으며, active caspase-3 antibody (1: 1000 희석) 사용하여 확인하였다.
- 이와 같이 UV에 의해 유도된 변화는 다른 연구자들에서 보고된 관찰소견과 유사하다. UV에 의한 피부세포 손상은 표피와 진피층의 세포 증식의 과도한 증가가 원인이며 이를 glycolic acid가 억제하는지를 proliferating cell nuclear antigen (PCNA) 방법으로 확인하였다. 그 결과 UV에 의하여과증식된 표피층이 glycolic acid 처리 군에서는 현저히 감소함을 확인하였다.
- 억제함을 알 수 있었다. 따라서 다음 실험으로 Tunel staining 방법으로 세포 사멸에 대하여 분석하였다. 조직 세포에 UV를 조사한 경우 세포 증식과 더불어 세포사멸도 함께 증가하는 것을 확인하였고 UV에 glycoHc acid를 병행처리 하면 Tunel staining 방법에 의하여 염색되는 수 (세포사멸 수)가 급격히 줄어드는 것을 확인하였다.
성능/효과
- 결과적으로 자외선은 생리화학적인 변화를 겪으면서 세포증식 이나 돌연변이, 각질 형 성 세포, Langerhans cells, 멜라닌세포, 비만 세포, 혈관 내피세포, 섬유아세포, 면역세포 등의 변화 및 파괴가 일어나며, 피부 표면의 변화로는 sun bum, sun tan, 그리고 홍반(erythema) 등의 임상적인 광노화(photo-aging) 현상을 겪게 된다.
- UV에 의한 피부세포 손상은 표피와 진피층의 세포 증식의 과도한 증가가 원인이며 이를 glycolic acid가 억제하는지를 proliferating cell nuclear antigen (PCNA) 방법으로 확인하였다. 그 결과 UV에 의하여과증식된 표피층이 glycolic acid 처리 군에서는 현저히 감소함을 확인하였다.
- 항체를 이용하여 효소 반응을 시켰다. PCNA 항체를 이용한 세포 증식의 양상은 immunohistochemical staining 방법으로 분한 결과 대조군에 비해 UV 단독 처리 군에서 갈색으로 관찰되는 PCNA 항체가 결합된 세포수가 현저히 증가되었으며 UV와 glycolic acid를 병행 처리한 군에서는 UV 단독 처리 군보다 전체적으로 PCNA가 관찰되는 세포 수가 감소되었다(Figure 1).
- PCNA 분석을 통하여 UV 단독 처리 군에서 UV와 gly colic acid 병행 처리군 보다 세포 증식이 더 크게 일어난 상태로 유지되고 있음을 확인하여 glycolic acid가 세포증식을 억제함을 알 수 있었다. 따라서 다음 실험으로 Tunel staining 방법으로 세포 사멸에 대하여 분석하였다.
- 따라서 다음 실험으로 Tunel staining 방법으로 세포 사멸에 대하여 분석하였다. 조직 세포에 UV를 조사한 경우 세포 증식과 더불어 세포사멸도 함께 증가하는 것을 확인하였고 UV에 glycoHc acid를 병행처리 하면 Tunel staining 방법에 의하여 염색되는 수 (세포사멸 수)가 급격히 줄어드는 것을 확인하였다. 이는 UV 단독 처리군에 의한 세포사멸을 glycolic acid 병행처리 시 억제한다는 것이 증명되었다(Figure 2).
- 인체피부세포에서 배양된 glycolic acid를 0.1 〜 100 mM 로 처리하고 UVB (60 mj/cm2)> 조사한 후 1 h, 4 h, 24 h까지 세포증식억제 효과를 확인한 결과 용량 의존적으로 세포보호 효과가 나타났고 24 h대에는 고용량(10 〜 100 mM)에서 대조군과 같은 수준의 세포 증식 양상을 나타내었다 (Table 1).
- 현미경상에서 각 실험군마다 세포를 1, 000개씩 세어 apoptosis 비율을 구한 결과, 대조군은 약 1.5%, UVB 단독으로 처리한 군에서는 약 5.5%, UVB와 glycolic acid 0.1 mM 병행처리한 군에서는 약 4.5%, UVB와 gly- colicd acid 1 mM 병행 처리한 군에서는 약 2.8%, UVB 와 glycolic acid 10 mM 병행 처리한 군에서는 2.4%의 apoptotic cell을 관찰할 수 있었다. 그 결과 정상 세포에 비해 UVB 단독으로 처리한 군에서는 Tunel 염색되는 세포사멸 수가 현저하게 증가하여 apoptosis가 유발됨을 확인하였고 이를 glycolic acid가 apoptosis# 억제시킴을 확인 할 수 있었다(Table 2).
- 4%의 apoptotic cell을 관찰할 수 있었다. 그 결과 정상 세포에 비해 UVB 단독으로 처리한 군에서는 Tunel 염색되는 세포사멸 수가 현저하게 증가하여 apoptosis가 유발됨을 확인하였고 이를 glycolic acid가 apoptosis# 억제시킴을 확인 할 수 있었다(Table 2).
- Caspase-3 면역염색세포 수를 확인한 결과 UVB만단독으로 조사한 경우에는 caspase-3의 발현이 현저히 (2〜3배) 증가함을 확인하였고 UVB와 glycolic acid를 병행처리 한 경우에 caspase-3의 발현이 감소함을 확인할 수 있었다. 이는 glycolic'acid가 농도의존적으로 caspase- 3를 감소시킴을 확인할 수 있었다(Table 2).
- 이는 glycolic acid가 피부에 미치는 영향이 단순한 부식성 물질로서의 각질층의 제거가 아닌 다른 기전을 통해 이루어질 수도 있을 것이라는 의구심을 가지게 한다. 본 연구 결과는 자외선에 의한 과도한 피부세포 증식고- 세포 사멸에 glycolic acid가 적절하게 방어 역할을 하는..
- 본 실험에서 UV 누적 광량에 의해 표피는 과증식 되었고 각질형성 세포(keratinocyet)의 크기와 배열이 불규칙해지며 멜라닌 색소가 표피상층부로 확산되고 광선각화증 현상을 보였다. 진피에서는 콜라겐 섬유가 가늘어지고 불규칙해지며 점차 소실되고 탄력섬유는 증식하고 두꺼워지고 서로 뭉쳐진 덩어리로 관찰되었다.
- 이와 같은 현상은 진피의 기질인 hyaluronic acid와 sulfated glycosamino- glycan도 증가하는 경향을 보인 결과와 일치된 현상이다. 그 결과 UV조사는 표피의 두께를 증가시키는 데 인체에서 UVB 조사 후 1주〜3주 내에 유극층은 2배, 각질층은 1.5 〜 3배 정도 증가하였다.
- Immotalized keratinocyte 배양 세포에 U5B를 조사하여 UV에 대한 세포 증식에 glycolic acid가 어떠한 영향을 미치는가를 세포 수준에서 연구하였다. 세포증식은 UV에 의하여 억제듸었으며 glycoHc acid가 UVB의 세포증식 억제를 방어함을 확인하였다. 또한 apoptosis의 양을 측정한 결과 UVB 단독 처리한 세포에서는 정상 세포에 비하여 염색성 이 현저하게 증가하여 apoptosis가 유발됨을 확인하였고, glycolic acid를 농도별로 WB와 병행 처리했을 때 glycolic acid의 농도에 따라 염색성이 감소하여 apoptosis를 억제함을 확인할 수 있었다.
- 세포증식은 UV에 의하여 억제듸었으며 glycoHc acid가 UVB의 세포증식 억제를 방어함을 확인하였다. 또한 apoptosis의 양을 측정한 결과 UVB 단독 처리한 세포에서는 정상 세포에 비하여 염색성 이 현저하게 증가하여 apoptosis가 유발됨을 확인하였고, glycolic acid를 농도별로 WB와 병행 처리했을 때 glycolic acid의 농도에 따라 염색성이 감소하여 apoptosis를 억제함을 확인할 수 있었다. 이 결과는 in uiuo에서 나타난 현상과 유사한 것으로써 결국 과도한 세포사 및 증식을 glycolic acid가 억제함으로써 정상적인 세포의 균형을 유지할 수 있는 glycolic acid의 효과가 피부 각질층의 변화를 막아주는 것으로 판단된다.
- 또한 apoptosis의 양을 측정한 결과 UVB 단독 처리한 세포에서는 정상 세포에 비하여 염색성 이 현저하게 증가하여 apoptosis가 유발됨을 확인하였고, glycolic acid를 농도별로 WB와 병행 처리했을 때 glycolic acid의 농도에 따라 염색성이 감소하여 apoptosis를 억제함을 확인할 수 있었다. 이 결과는 in uiuo에서 나타난 현상과 유사한 것으로써 결국 과도한 세포사 및 증식을 glycolic acid가 억제함으로써 정상적인 세포의 균형을 유지할 수 있는 glycolic acid의 효과가 피부 각질층의 변화를 막아주는 것으로 판단된다. Apoptosis 를 정량적으로 확인하기 위하여 자외선에 의한 DNA 손상에 따라 발현되는 caspase-3의 반응성 세포수를 측정한 결과, glycolic acid와 병행처리했을 때에 caspase-3 의 반응성 세포수가 유의적으로 감소하여 glycolic acid가 apoptosis과정의 마지막인자인 caspase-3의 활성화로 이어지는 경로를 차단함으로써 apoptosis 억제 효과를 확인할 수 있었다.
- 이 결과는 in uiuo에서 나타난 현상과 유사한 것으로써 결국 과도한 세포사 및 증식을 glycolic acid가 억제함으로써 정상적인 세포의 균형을 유지할 수 있는 glycolic acid의 효과가 피부 각질층의 변화를 막아주는 것으로 판단된다. Apoptosis 를 정량적으로 확인하기 위하여 자외선에 의한 DNA 손상에 따라 발현되는 caspase-3의 반응성 세포수를 측정한 결과, glycolic acid와 병행처리했을 때에 caspase-3 의 반응성 세포수가 유의적으로 감소하여 glycolic acid가 apoptosis과정의 마지막인자인 caspase-3의 활성화로 이어지는 경로를 차단함으로써 apoptosis 억제 효과를 확인할 수 있었다. Caspase-3가 UVB 단독으로 처리한 군에서는 증가되었다가 병행 처리 시약하게 증가된 결과는 단백질 수준에서의 발현 차이에서 기인된다고 해석된다, 이와같은 현상은 glycolic 거cid는 표층 박피제로 활발히 이용되면서 표피에서는 각질 세포(keratinocyte)의 응집력을 감소 시켜 각질 탈락을 유도하여 정상적인 각질층의 두께를 유지할 수 있도록 새로운 각질층의 형성과 각질 층의 턴오버 (tum-over)를 촉진시키는 자기 상승(long-term) 활성으로 외견상 젊어 보이는 효과와 광노화(photo-aging) 치료 및 방지에 도움이 된다는 기존의 인식을 뒷받침할 수 있을 것이다.
후속연구
- Caspase-3가 UVB 단독으로 처리한 군에서는 증가되었다가 병행 처리 시약하게 증가된 결과는 단백질 수준에서의 발현 차이에서 기인된다고 해석된다, 이와같은 현상은 glycolic 거cid는 표층 박피제로 활발히 이용되면서 표피에서는 각질 세포(keratinocyte)의 응집력을 감소 시켜 각질 탈락을 유도하여 정상적인 각질층의 두께를 유지할 수 있도록 새로운 각질층의 형성과 각질 층의 턴오버 (tum-over)를 촉진시키는 자기 상승(long-term) 활성으로 외견상 젊어 보이는 효과와 광노화(photo-aging) 치료 및 방지에 도움이 된다는 기존의 인식을 뒷받침할 수 있을 것이다. 이를 근거로 향후 UV에 의한 피부 손상으로부터 피부를 정상화시킬 수 있는 제제로서의 glycolic acid의 사용 가능성을 확인할 수 있었다. 다만 그 실제 사용 양에 있어서는 개인적 편차가 있고 광에 대한 피부 손상을 더 증가시킨다는 보고 등이 있는 바 적적한 양의 선택이 증요하다고 판단된다.
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