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문제 정의
- " Arecoline은 pilocarpine보다 강력한 부교감신경 흥분 작용 및 중추 억제 작용이 있다고 보고되어 있다.8,9) 본 연구에서는 빈랑자의 메탄올 추출물로부터 urease 활성을 억제시키는 물질을 분리하여 그 구조를 확인하고 분리된 성분의 활성을 연구하였다.
제안 방법
- 시약 및 기기 - 융점은 Perkin-Elmer DSC7 apparatus (uncorrected)를 사용하여 측정 하였으며 'H-NMR은 JEOL Lambda-400 spectrometer (400 MHz)를 "c-NMR은 JEOL Lambda-400 spectrometer (100 MHz)를 사용하였다. ESI- MS는 HP-1100LC-MSD를 사용하였다.
- 응용하여 측정하였다.10) 즉, 3차 증류수에 녹여 만든 urea 용액(100 mM)을 각 well에 100 ul씩 넣은 뒤, 50% glycerol 약 1 unit이 되게 희석한 urease용액 50 ul 와 농도별(0.5 및 0.25mg/mZ)로 희석된 검체를 각 well에 첨가하였다. 배양기에서 37°C로 10분간 반응시킨 후, phenolsodium nitropruside(0.
- 이 중 활성 이 있는 소분획 F1 (600 mg)을 n-hexane : EtOAc : MeOH (10:10: Wgradient)< 유출 용매로 silica gel column chromatography를 실시하여 3개의 분획 F11 (155 mg), F12 (300 mg) 및 F13 (30 mg)으로 분획화한 후 F12를 n-hexane : EtOAc : MeOH (3:3:l~>gradient)> 유출 용매로 silica gel column chromatography# 실시하여 compound I (100 mg) 을 분리하였다. 또한 EtOAc 소분획 F2 (450 mg)를 n-hexane : EtOAc : MeOH (5:5:Wgradient)®- 유출 용매로 silica gel column chromatography# 실시하여 3개 분획 F21 (12 mg), F22 (300 mg) 및 F23 (32 mg)로 분획화한 후, 소분획 F22를 Sephadex LH-20 (MeOH 100%) column chromatography를 4회 반복 수행하여 compound H (110mg)를 분리하였다.
- 25mg/mZ)로 희석된 검체를 각 well에 첨가하였다. 배양기에서 37°C로 10분간 반응시킨 후, phenolsodium nitropruside(0.106 M phenol; 0.17 mM sodium nirtopruside) 용액과 hypochlorite(ll mM NaClO; 0.125 N NaOH) 용액을 첨가한 뒤 다시 30분 배양시킨 후 ELISA reader 560 nm에서 흡광도를 대조군과 함께 비교 측정하였다. 억제 효과는 다음과 같은 계산식으로 결정하였다.
- 빈랑자로부터 분리 한 compound I 및 compound II의 urease 저해 활성정도를 측정하였다. 두 물질은 모두 urease 저해 활성을 나타내었으며 , 특히 compound I이 compound H 보다 더욱 우수한 활성을 나타내었다(Table ni).
- 5 g, 50 g, 100 g을 얻었다. 이 중 urease 억제 활성 이 있는 EtOAc 분획을 n-hexane : EtOAc : MeOH (5:5:5~>gradient)를 유출 용매로 silica gel column chromatography를 실시하여 5개 분획으로 나누었다. 이 중 활성 이 있는 소분획 F1 (600 mg)을 n-hexane : EtOAc : MeOH (10:10: Wgradient)< 유출 용매로 silica gel column chromatography를 실시하여 3개의 분획 F11 (155 mg), F12 (300 mg) 및 F13 (30 mg)으로 분획화한 후 F12를 n-hexane : EtOAc : MeOH (3:3:l~>gradient)> 유출 용매로 silica gel column chromatography# 실시하여 compound I (100 mg) 을 분리하였다.
- 이 중 활성 이 있는 소분획 F1 (600 mg)을 n-hexane : EtOAc : MeOH (10:10: Wgradient)gradient)> 유출 용매로 silica gel column chromatography# 실시하여 compound I (100 mg) 을 분리하였다.
- 추출 및 분리 - 빈랑자 2 kg을 냉각기가 달린 추출기를 사용하여 메탄올을 추출용매로 수욕 상 (70°C 이하)에서 3 시간씩 5회 반복 추출하고 그 추출액을 온시 여과한 후 수욕 상에서 감압 농축하여 MeOH 추출물 226 g을 얻었으며 , 이 MeOH 추출물에 증류수 3 Z를 가하여 현탁시키고 동량의 n-hexane, methylene chloride(CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc) 및 수포화 butanol(BuOH)를 순차적으로 용매 분획하여 각각 8 g, 2.5 g, 50 g, 100 g을 얻었다. 이 중 urease 억제 활성 이 있는 EtOAc 분획을 n-hexane : EtOAc : MeOH (5:5:5~>gradient)를 유출 용매로 silica gel column chromatography를 실시하여 5개 분획으로 나누었다.
- 5715, Merck)를 사용하였다. 추출 및 분획용 용매는 EP급 용매를 사용하였으며, TLC 및 column용 용매는 EP급 용매를 재증류하여 사용하였다. 발색 시약으로 iodine vapor, 5% sulfuric acid 시액, 5% FeCl3 in ethanol 용액을 사용하였다.
- 이들 화합물은 물리 . 화학적 성질 및 분광학적 분석 연구를 통하여 compound I은 (+)-catechin&로, compound II는 allantoin으로 구조를 확인하였다. Compound I과 compound U은 urease 억제활성을 측정한 결과 두 화합물 모두 유의성있는 활성을 나타내었으며, 이 중 compound I인 (+)-catechin이 더욱 우수한 활성을 나타내었다.
대상 데이터
- ESI- MS는 HP-1100LC-MSD를 사용하였다. Chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60 (70 - 230 mesh, Merck, Art, 7734), Kiesel gel 60 (230 - 400mesh, Merck, Art, 9385)을사용하였고, molecular sieve column chromatography- packing 물질은 Sephadex LH-20 (Bead size, 25 - 100 um, Merck)을 사용하였으며, thin layer chromatography용 plate 는 Kiesel gel 60F254 (precoated plate, Art.
- 발색 시약으로 iodine vapor, 5% sulfuric acid 시액, 5% FeCl3 in ethanol 용액을 사용하였다. Urease 저해 활성 시험에 사용된 시약은 urease(from Jack beans type), 3* urea, sodium nitroferricyanide, sodium hypochlorite 등은 Sigma사(USA)에서 구입 사용하였고 기타 시약은 특급 또는 1급 시약을 구입 사용하였다.
- 추출 및 분획용 용매는 EP급 용매를 사용하였으며, TLC 및 column용 용매는 EP급 용매를 재증류하여 사용하였다. 발색 시약으로 iodine vapor, 5% sulfuric acid 시액, 5% FeCl3 in ethanol 용액을 사용하였다. Urease 저해 활성 시험에 사용된 시약은 urease(from Jack beans type), 3* urea, sodium nitroferricyanide, sodium hypochlorite 등은 Sigma사(USA)에서 구입 사용하였고 기타 시약은 특급 또는 1급 시약을 구입 사용하였다.
- 실험재료 - 본 실험에 사용한 빈랑자는 생약 감별법에 의해 검정된 재료를 2004년 4월 경동시장에서 구입한 후 세절하여 실험에 사용하였고 표본은 동화약품 천연물 연구실 내 생약 보관실에 보관하였다.
이론/모형
- Urease 억제 활성의 측정 - Urease 억제 활성은 Berthelot reaction법을 응용하여 측정하였다.10) 즉, 3차 증류수에 녹여 만든 urea 용액(100 mM)을 각 well에 100 ul씩 넣은 뒤, 50% glycerol 약 1 unit이 되게 희석한 urease용액 50 ul 와 농도별(0.
성능/효과
- 13C-NMR spectrum으로부터 aromatic ring으로 판단되는 탄소가 12개이고, 산소가 결합되어 있는 aliphatic 탄소가 2개 있는 flavonoid 구조임을 알 수 있었다. 】H-NMR spectrum에서 6 2.
- 65)의 신호가 관찰되므로 benzene ring 이 C-2에 결합되어 있음을 알 수 있었다. Aromatic ring 영역인 65.75에서 나타나는 수소 peak와 65.83에서 나타나는 수소 peak의 J 값이 2.2 Hz로 A ring에 존재하는 서로 meta 관계인 H-6 및 H・8임을 알 수 있었다. 또한 66.
- 화학적 성질 및 분광학적 분석 연구를 통하여 compound I은 (+)-catechin&로, compound II는 allantoin으로 구조를 확인하였다. Compound I과 compound U은 urease 억제활성을 측정한 결과 두 화합물 모두 유의성있는 활성을 나타내었으며, 이 중 compound I인 (+)-catechin이 더욱 우수한 활성을 나타내었다. 따라서 compound I과 compound EE는 urease-매개성 질환의 치료제개발에 유용한 화합물이 될 것으로 기대된다.
- EtOAc 및 BuOH 분획에서 높게 측정 되었다. EtOAc 및 BuOH 분획을 column chromatography# 이용하여 얻은 소분획의 urease 억제 활성을 측정한 결과 EtOAc 소분획 Fl, F2에서 높은 저해 활성을 보였다(Table I). 또한 EtOAc 분획 F1 및 F2를 각각 다시 소분획한 결과 EA F12 및 F22에서 높은 저해 활성을 보였다(Table II).
- HMBC spectrum으로부터 C-2과, H-4 및 H3의 수소들의 신호가 나타남을 확인하였고, C4와 H-2, H3의 수소들과 신호가 나타남을 확인하였다. 또한 HMBC spectium 상에서 H-2과 G4' 및 C-5'와 신호가 나타남을 확인하여 urea기가 C4에 결합되어 있음을 알 수 있었다.
- Urease 저해제 개발을 위한 예비 검색 결과에서 선택된빈랑자(檳榔子)를 추출하여 칼럼 크로마토그래피를 반복 수행한 결과 2종의 urease 저해제 compound I과 compoundH를 분리하였다. 이들 화합물은 물리 .
- carbonyl 응!vup을 확인할 수 있었고, HMQC specttum으로부터 4개의 수소들이 탄소와 결합되어 있지 않음을 확인하였다.
- 13C-NMR spectrum으로부터 aromatic ring으로 판단되는 탄소가 12개이고, 산소가 결합되어 있는 aliphatic 탄소가 2개 있는 flavonoid 구조임을 알 수 있었다. 】H-NMR spectrum에서 6 2.40와 2.73에서 서로 응eminal coupling하는 methylene peak를 통해 4번 위치에 CH2 구조를 갖는 flavan 계열의 구조임을 확인할 수 있었다. HMBC spectrumdmf 살펴보면 CJ와 H-2의 신호가 나타났고, C-2 082.
- 저해 활성정도를 측정하였다. 두 물질은 모두 urease 저해 활성을 나타내었으며 , 특히 compound I이 compound H 보다 더욱 우수한 활성을 나타내었다(Table ni).
- 1 Hz으로 meta 위치에 있는 H-2로 확인할 수 있었다. 또한 COSY spectrum에서 8 3.87의 H-3의 peak와 6 4.46에서 나타나는 H-2의 peak가 서로 연관됨을 확인할 수 있었다. 이상과 같은 결과들로부터 compound I은 (2R, 3S) 3, 3'4', 5, 7-pentahydroxyflavan구조를 갖는 (+)-catechin으로 확인하였다.
- EtOAc 및 BuOH 분획을 column chromatography# 이용하여 얻은 소분획의 urease 억제 활성을 측정한 결과 EtOAc 소분획 Fl, F2에서 높은 저해 활성을 보였다(Table I). 또한 EtOAc 분획 F1 및 F2를 각각 다시 소분획한 결과 EA F12 및 F22에서 높은 저해 활성을 보였다(Table II).
- 나타남을 확인하였다. 또한 HMBC spectium 상에서 H-2과 G4' 및 C-5'와 신호가 나타남을 확인하여 urea기가 C4에 결합되어 있음을 알 수 있었다. 이상과 같은 결과들로부터 compound D은 2, 5-Dioxo4・imidazolidinyhirea구조를 갖는 allantoin임을 확인하였다.
- 4)그러므로 urease 억제제의 개발은 요소 분해속도 조절을 통한 식물의 효율적인 질소 이용과 ureolytic bacteria에 의해 야기되는 감염의 치료에 응용될 수 있다. 이러한 목적으로 수행된 여러 생약 메탄올 추출물을 대상으로 한 예비 실험에서 , 본 연구자 등은 빈랑자가 urease 억제 효능이 뛰어남을 확인할 수 있었다.
- 또한 HMBC spectium 상에서 H-2과 G4' 및 C-5'와 신호가 나타남을 확인하여 urea기가 C4에 결합되어 있음을 알 수 있었다. 이상과 같은 결과들로부터 compound D은 2, 5-Dioxo4・imidazolidinyhirea구조를 갖는 allantoin임을 확인하였다.
- 46에서 나타나는 H-2의 peak가 서로 연관됨을 확인할 수 있었다. 이상과 같은 결과들로부터 compound I은 (2R, 3S) 3, 3'4', 5, 7-pentahydroxyflavan구조를 갖는 (+)-catechin으로 확인하였다.
후속연구
- 그러나 이러한 억제 효과가 urease 효소의 반응 산물로 인한 false effect의 가능성도 있으므로 추가 실험이 필요하리라 사료된다、Compound II는 allantoin으로 화장품의 주요성분으로 많이 사용되며 의학적으로도 상처나 종기의 치료 및 조직의 재생을 촉진하는 것으로 알려진 물질이다.14) Compound II는 구조 중에 urea기가 존재하므로 이 urea기가 urease의 active site에 결합하여 효소의 활성을 억제할 가능성이 높은 것으로 판단되나, 보다 명확한 증거는 추가실험을 통해 확인될 수 있을 것으로 사료된다. 또한 allantoin 으로 확인된 compound II는 빈랑자에서 처음 분리되어 보고 되는 물질이다.
- 2,3)또한 농업 에 있어서도 암모니아는 토양의 pH를 증가시켜 심각한 환경적, 경제적 손실을 가져온다.4)그러므로 urease 억제제의 개발은 요소 분해속도 조절을 통한 식물의 효율적인 질소 이용과 ureolytic bacteria에 의해 야기되는 감염의 치료에 응용될 수 있다. 이러한 목적으로 수행된 여러 생약 메탄올 추출물을 대상으로 한 예비 실험에서 , 본 연구자 등은 빈랑자가 urease 억제 효능이 뛰어남을 확인할 수 있었다.
- Compound I과 compound U은 urease 억제활성을 측정한 결과 두 화합물 모두 유의성있는 활성을 나타내었으며, 이 중 compound I인 (+)-catechin이 더욱 우수한 활성을 나타내었다. 따라서 compound I과 compound EE는 urease-매개성 질환의 치료제개발에 유용한 화합물이 될 것으로 기대된다.
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