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문제 정의
- -Vanadate 는 tyrosine phosphotase 저해작용을 가지고 있어서 이미 혈당 강하 물질로 사용되고 있다/"1) Vanadate와 황백의 효과를 비교해보고, 두 가지를 함께 처리했을 때의 효과는 어떠한지 알아보았다. 먼저 황백을 처리한 후 급성 인슐린을처리하기 15분 전에 1 mM의 vanadate를 처리해서 glucose uptake을 측정하였다.
- 또한 맥문동과 방풍의 열수 추출물도 127~130% 수준의 유의적인 촉진효과를 나타내었다. 따라서 본 연구에서는 황백 추출물이 나타낸 탁월한 촉진효과와 독특한 촉진기전에 주목하여 황백 추출물에 대하여 추가적인 활성 분석을 실시하였다.
- 본 연구에서는 지방세포에 대한 glucose uptake assay를이용하여 한방치료 또는 민간요법에서 소갈증에 효능이 있다고 알려지거나 항당뇨 효과가 기대되는 17종의 약용식물의 추출물들에 대해 3T3-L1 지방세포에서의 glucose uptake촉진활성을 탐색 비교하였다. 또한 고활성이 확인된 황백(Phellodendron Cortex) 주줄물에 대하여, 인슐린 신호전달을 저해하는 저해제를 이용한 실험을 통해 그 활성의 개략적인 기전을 규명하였다.
- 37) 그러나 황백 추출물 단독으로 항당뇨 작용과 관련하여 연구된 내용은 아직 보고된 바 없다. 본 연구에서는 지방세포에서의 glucose uptake 촉진작용을 확인하고 그 활성기전을 예측함으로써, 황백 추출물의 항당뇨 활성소재로의 응용 가능성을 제시하고자 하였다.
- 항당뇨 효과를 위해 한방치료 또는 민간요법에서 사용되고 있는 17종의 약용식물에 대하여 3T3-L1 지방세포에서의 glucose uptake에 미치는 영향을 조사함으로써 혈당 강하 소재로의 응용 가능성을 평가하였다. 그 중 황백 추출물이 glucose uptake 촉진활성이 가장 우수함을 확인하였으며 , 급성 인슐린을 처리 한 인슐린 자극 glucose uptake과 처리 하지 않은 인슐린 무자극 glucose uptake을 모두 촉진시키는 작용을 관찰할 수 있었다.
- - IR, IRS를 비롯하여 인슐린 신호전달 매개 단백질들의 tyrosine 인산화는 인슐린 신호전달에서 매우 중요하다. 황백과 tyrosine 인산화와의 연관성을 알아보기 위해 tyrosine kinase의 저해제인 genistein 처리 여부에 따라 황백의 효과에 미치는 영향을 조사하였다. Fig.
제안 방법
- ghjcos으 uptakee! 감소가 개선된다. - 인슐린 저항성을 유도시킨 세포에서의 황백의 효과를 알아보았다. 3T3- L1 지방세포를 10nM 인슐린(만성 인슐린)으로 16시간 동안 처리해서 인슐린 저항성을 유도하고 glucose uptake assay를 실시하기 6시간 전부터 황백 열수추출물을 처리한 후glucose uptake 촉진효과를 조사하였다.
- . - 황 백의 촉진 활성을 확인하기 위해 우선 황백 추출물의 처리 농도와 처리 시간을 달리해서 glucose uptake의 변화를 조사하였다. Fig.
- - 인슐린 저항성을 유도시킨 세포에서의 황백의 효과를 알아보았다. 3T3- L1 지방세포를 10nM 인슐린(만성 인슐린)으로 16시간 동안 처리해서 인슐린 저항성을 유도하고 glucose uptake assay를 실시하기 6시간 전부터 황백 열수추출물을 처리한 후glucose uptake 촉진효과를 조사하였다. Fig.
- 처리하였다. 3T3-L1 지방세포에 24시간 동안 추출물 시료를 처리하고비처리 대조구와 비교하여 glucose uptake 촉진 정도를 측정호}였다. 하나의 조건 당 세포가 배양된 2개의 35-mm dish 를 준비하여 duplicated.
- 황백의 효과와 PI 3-kinase의 역할과의 연관성을 알아보기 위해 PI 3-kinase를 특이적으로 저해하는 wortmannin 을 처리하였다. 3T3-L1 지방세포에 황백 열수추출물을 6시간 동안 처리한 후, 급성 인슐린을 가하기 전에 100 nM의 wortmannin을 10분 동안 먼저 처 리하여 glucose uptake의 변화를 조사하였다. Fig.
- - 지방세포와 근육세포에서의 fucose uptake 현상은 GLUT4의 translocation 뿐만 아니라 그 활성화에 의해서도 촉진되며 이에 관여하는 단백질이 MAPK 중 하나인 p38인 것으로 알려져있다.41,42) 본 연구에서는 황백이 p38 의 작용에 미치는 영향을 조사하기 위해 p38에 특이적 저해제인 SB203580을 1 μM의 농도로 처리하였다. Fig.
- 열수추출물과 알코올 추출물의 비 처리 대조 구에는 각각 PBS와 DMSO만을 처리하였다. Glucose transport assay는 Thomson 등의 방법38,39)을 수정하여 사용하였다. 시료 처리가 끝난 dish에서 배지를 제거하고 37℃로유지되는 plate 위에서 KRP(+0.
- 알려지거나 항당뇨 효과가 기대되는 17종의 약용식물의 추출물들에 대해 3T3-L1 지방세포에서의 glucose uptake촉진활성을 탐색 비교하였다. 또한 고활성이 확인된 황백(Phellodendron Cortex) 주줄물에 대하여, 인슐린 신호전달을 저해하는 저해제를 이용한 실험을 통해 그 활성의 개략적인 기전을 규명하였다. 황백은 항염증, 항궤양 작용이 알려져36) 건위약 소재로 사용되거나, 항산화 작용을 이용하여 항당뇨 한약 탕재에 첨가되고 있다.
- -Vanadate 는 tyrosine phosphotase 저해작용을 가지고 있어서 이미 혈당 강하 물질로 사용되고 있다/"1) Vanadate와 황백의 효과를 비교해보고, 두 가지를 함께 처리했을 때의 효과는 어떠한지 알아보았다. 먼저 황백을 처리한 후 급성 인슐린을처리하기 15분 전에 1 mM의 vanadate를 처리해서 glucose uptake을 측정하였다. Fig.
- 생지황(生地黃, Rehmaniae Radix crudus)^ 숙지황傲地黃, Rehmaniae Radix Preparata), 창출(蒼朮, Atractylodis Rhizoma), 택사(澤瀉, Alismatis Rhizoma)^ 현삼(玄參, Scrophulariae Radix), 황기 (黃耆, Astragali Radix), 황백儀柏, Phellodendri Cortex), 황정 (黃精, Polygonati sibilicum Rhizoma) 등의 17종 약용식물에 대하여 추출물을 제조하고 활성을 탐색하였다. 대조 군세 포에서의 glucose uptake 값에 대해 각 추출물을 처리함으로써 향상된 정도를 %로 계산하여 Table I에 나타내었다.
- Glucose transport assay는 Thomson 등의 방법38,39)을 수정하여 사용하였다. 시료 처리가 끝난 dish에서 배지를 제거하고 37℃로유지되는 plate 위에서 KRP(+0.1% BSA+5mM 읺ucose)로3mb<3회의 세척과정을 20분 간격으로 3회 반복하여 잔여 인슐린 및 시료를 세척하였다. 이어서 1 ml의 KRP를 주입하고 37℃에서 100 nM 급성 인슐린(acute insulin)을 가하여 10분 동안 자극한 다음 표지되 지 않은 2-DOG와 [3H]2- DOG(Amersham Pharmacia)# 함께 KRP에 녹인 용액 (0.
- 이 결과로부터 인슐린무자극 glucose uptake과 인슐린 자극 glucose uptake을 촉진시키는 성분은 서로 다른 물질인 것으로 추정되었다. 얻어진 결과를 근거로 하여, 이후의 실험은 황백 열수추출물을 6시간 동안 처리하는 조건으로 고정하여 각종 저해제의 처리에 의해 황백의 활성이 어떤 영향을 받는지 조사하였다.
- 측정하여 최종 radioactivity 측정치의 평균값을 얻었다. 열수추출물과 알코올 추출물의 비 처리 대조 구에는 각각 PBS와 DMSO만을 처리하였다. Glucose transport assay는 Thomson 등의 방법38,39)을 수정하여 사용하였다.
- 인슐린 저항성이 유도된 3T3-L1 지방세포를 사용할 때에는 저농도의 만성 인슐린 (chronic insulin)을' 16시간 동안 처리해주었다. 즉 DMEM(25mM glucose+10% FBS)에 직접 10nM insulin을 첨가하여 16시간 동안 배양하였다.
- 즉 DMEM(25mM glucose+10% FBS)에 직접 10nM insulin을 첨가하여 16시간 동안 배양하였다.
- 따라 지방세포로 분화시켜 사용하였다. 즉, 세포를 25 mMglucose-S- 포함하는 Dulbecco's minimal essential medium (DMEM)에 10% calf serum(CS)을 혼합한 배지에 confluence 에 이르도록 37℃, 5% CO/ 조건으로 배양한 후, 25 mM glucose 포함 DMEM에 0.5 mM isobutylmethylxanthine, 0.25 jjM dexamethasone, 1 jig/ml insulin 및 10% FBS를첨가하여 제조한 diflerentiation medium에서 2일간 배양하며 분화시키고, 분화된 세포는 25 mM glucose, 10 jxg/ml insulin, 10% FBS를 포함하는 DMEM에 2일간 더 배양하였다. 이 시점부터는 DMEM(25 mM glucose+10% FBS)에서2~3일 간격으로 배지를 교환해주면서 유지시키고, 분화 후 6일 이내에 실험에 사용하였다.
- 추출물 시료 처리 및 2-deoxyglucose(2-DOG) uptake 측정 (glucose transport assay) - 열수추출물과 알코올 추출물 시료는 각각 PBS와 DMSO에 용해시켜 처리하였다. 3T3-L1 지방세포에 24시간 동안 추출물 시료를 처리하고비처리 대조구와 비교하여 glucose uptake 촉진 정도를 측정호}였다.
- - 인슐린의 신호전달 과정에서 PI 3-kinase는 인슐린 자극 glucose uptake을 일으키는 신호전달 매개체로서의 중요한 역할을 수행한다. 황백의 효과와 PI 3-kinase의 역할과의 연관성을 알아보기 위해 PI 3-kinase를 특이적으로 저해하는 wortmannin 을 처리하였다. 3T3-L1 지방세포에 황백 열수추출물을 6시간 동안 처리한 후, 급성 인슐린을 가하기 전에 100 nM의 wortmannin을 10분 동안 먼저 처 리하여 glucose uptake의 변화를 조사하였다.
대상 데이터
- 사용하였다. 각 약용식물 별로 추출물은행의 정해진 추출방식에 의해 얻어진 열수 추출물 및 알코올(80% 메탄올) 추출물을 공급받아 사용하였다.
- 약용식물 추출물의 제조 - 각 약용식물의 추출물은 한국 식물 추출 물은 행 (한국생명공학연구원 , 대전)으로부터 구입하여 사용하였다. 각 약용식물 별로 추출물은행의 정해진 추출방식에 의해 얻어진 열수 추출물 및 알코올(80% 메탄올) 추출물을 공급받아 사용하였다.
- 25 jjM dexamethasone, 1 jig/ml insulin 및 10% FBS를첨가하여 제조한 diflerentiation medium에서 2일간 배양하며 분화시키고, 분화된 세포는 25 mM glucose, 10 jxg/ml insulin, 10% FBS를 포함하는 DMEM에 2일간 더 배양하였다. 이 시점부터는 DMEM(25 mM glucose+10% FBS)에서2~3일 간격으로 배지를 교환해주면서 유지시키고, 분화 후 6일 이내에 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 하나의 조건 당 세포가 배양된 2개의 35-mm dish 를 준비하여 duplicated. 측정하여 최종 radioactivity 측정치의 평균값을 얻었다. 열수추출물과 알코올 추출물의 비 처리 대조 구에는 각각 PBS와 DMSO만을 처리하였다.
이론/모형
- 3T3-L1 지방세포의 배양 및 인슐린 저항성의 유도 - 3T3- L1 fibroblasts(미국 플로리다대학 생화학분자생물학과 Susan Frost 교수로부터 받은 세포주를 10 passage 이내에서 사용) 를 35-mm culture dish에 배양하고 Frost와 Lane의 방법38) 에 따라 지방세포로 분화시켜 사용하였다. 즉, 세포를 25 mMglucose-S- 포함하는 Dulbecco's minimal essential medium (DMEM)에 10% calf serum(CS)을 혼합한 배지에 confluence 에 이르도록 37℃, 5% CO/ 조건으로 배양한 후, 25 mM glucose 포함 DMEM에 0.
성능/효과
- 1,2) 그러나 이들 혈당강하제가 안고 있는 문제점은 고장僦腸, flatulence)이나 설사의 유발, 젖산 축적의 위험성, 신부전 증상의 악화, 간독성, 체중 증가, 빈혈, 부종 등으로 나타나는 여러 가지 형태의 부작용이다.1,3)혈당강하제는 장기적인 복용이 필연적이므로 특히 부작용에 대한 우려에 민감하다. 이러한 배경으로 미국 등 선진국에는 이미 당뇨병 환자용 기능성 식품이 다양하게 개발되기도 하였다.
- 17종 약용식물의 추출물에 대한 glucose uptake 촉진작용 검색 - 한방치료 또는 민간요법에서 당뇨병에 효능이 있다고 알려진 갈근(葛根, Puerariae Radix), 괄루근(括萋根, Trichosanthes Radix), 맥문동俊門冬, Liliope Tuber), 방풍 (防 風, Ledebouriellae Radix), 백줄(白 朮, Atractylodis Rhizoma alba), 산약(山藥, Dioscorea Rhizoma), 옥죽落竹, Polygonati odoratum Rhizoma), 지골피(地骨皮, Lycii Radicis Cortex)^ 지모(知母, Anemarrhenae Rhizoma). 생지황(生地黃, Rehmaniae Radix crudus)^ 숙지황傲地黃, Rehmaniae Radix Preparata), 창출(蒼朮, Atractylodis Rhizoma), 택사(澤瀉, Alismatis Rhizoma)^ 현삼(玄參, Scrophulariae Radix), 황기 (黃耆, Astragali Radix), 황백儀柏, Phellodendri Cortex), 황정 (黃精, Polygonati sibilicum Rhizoma) 등의 17종 약용식물에 대하여 추출물을 제조하고 활성을 탐색하였다.
- 41,42) 본 연구에서는 황백이 p38 의 작용에 미치는 영향을 조사하기 위해 p38에 특이적 저해제인 SB203580을 1 μM의 농도로 처리하였다. Fig. 3에서 보여주는 바와 같이 황백을 처리하지 않은 대조구에서SB203580에 의해 인슐린 자극 glucose uptake가 20% 정도 감소하는 것으로 나타나 GLUT4의 활성화에 의한 glucose uptake이 저해를 받고 있음을 보여주었다. 그러나 황백을 처리한 경우에도 그 감소의 정도가 대조구와 비슷한 수준으로 나타나는 것으로 보아 p38과 황백의 효과와는 별 연관성이 없는 것으로 판단할 수 있었다.
- 3T3- L1 지방세포를 10nM 인슐린(만성 인슐린)으로 16시간 동안 처리해서 인슐린 저항성을 유도하고 glucose uptake assay를 실시하기 6시간 전부터 황백 열수추출물을 처리한 후glucose uptake 촉진효과를 조사하였다. Fig. 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 대조구에서는 만성 인슐린 처리에 의해 급성인슐린을 가하였을 때의 인슐린 자극 glucose uptake0] 65%수준으로 떨어진 것을 볼 때 인슐린 저항성이 잘 유도되었음을 확인할 수 있었다. 얻어진 인슐린 저항성 세포 시스템에 황백을 처리하였을 때 인슐린 저항성에 의해 감소된 이ucose uptake0] 황백 추출물의 처리에 의해 현저히 개선되었으며, 인슐린 자극 glucose uptake의 수준이 정상 세포와 거의 유사한 수준으로 회복되고 있음을 확인할 수 있었다.
- 3에 나타낸 바와 같이 급성 인슐린 처리 전30분 동안 lOOnM의 genisteine 처리하고 glucose uptake를측정한 결과, genistein에 의해서 대조구는 물론 황백을 처리한 경우에서도 glucose uptake가 완전히 억제되었다. Wortmanmin이 인슐린 자극 glucose uptake만 억제했던 것과 달리, genisteine 황백에 의해서 증가된 인슐린 무자극 fucose uptake도 완전히 억제됨을 보여주었다. 이로써 황백의 작용이 인슐린 신호전달에 매개되는 단백질들의 tyrosine 인산화에 근본적으로 관련되어 있음을 확인할 수 있었다.
- 응용 가능성을 평가하였다. 그 중 황백 추출물이 glucose uptake 촉진활성이 가장 우수함을 확인하였으며 , 급성 인슐린을 처리 한 인슐린 자극 glucose uptake과 처리 하지 않은 인슐린 무자극 glucose uptake을 모두 촉진시키는 작용을 관찰할 수 있었다. 이러한 황백의 촉진작용은 PI 3- kinase의 저해제인 wortmannin 처리에 의해 완전히 억제되었으며, p38 MMPK의 저해제인 SB203580에 의해서는 영향을 받지 않았다.
- 한편 tyrosine kinase의 저해제인 genistein 에 의해서는 인슐린 자극 및 무자극 glucose uptake0] 모두 완벽하게 억제되었으며, tjrosine phosphatase의 저해제인 vanadate와의 유의적인 시너지 효과는 관찰되지 않았다. 따라서 황백 추출물의 glucose uptake 촉진효과는 PI 3-kinase 의 활성화를 촉진시킴으로써 GLUT4 translocation을 향상시키며 또한 그 신호전달 과정 상에서 tyrosine 인산화의 촉진을 통해 그 작용을 나타내는 것으로 추정할 수 있었다. 황백 추출물의 탁월한 glucose uptake 촉진활성과 인슐린 자극 여부에 관계없이 작용하는 독특한 활성기전에 근거하여, 항당뇨 소재로 응용함에 있어 높은 가능성이 기대된다.
- 보여주었다. 또한 맥문동과 방풍의 열수 추출물도 127~130% 수준의 유의적인 촉진효과를 나타내었다. 따라서 본 연구에서는 황백 추출물이 나타낸 탁월한 촉진효과와 독특한 촉진기전에 주목하여 황백 추출물에 대하여 추가적인 활성 분석을 실시하였다.
- 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 대조구에서는 만성 인슐린 처리에 의해 급성인슐린을 가하였을 때의 인슐린 자극 glucose uptake0] 65%수준으로 떨어진 것을 볼 때 인슐린 저항성이 잘 유도되었음을 확인할 수 있었다. 얻어진 인슐린 저항성 세포 시스템에 황백을 처리하였을 때 인슐린 저항성에 의해 감소된 이ucose uptake0] 황백 추출물의 처리에 의해 현저히 개선되었으며, 인슐린 자극 glucose uptake의 수준이 정상 세포와 거의 유사한 수준으로 회복되고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 지방세포가 인슐린 저항성 상태로 바뀌게 되는 현상은 여러가지 경로를 통해 일어날 수 있지만, 본 연구에서 조절한 조건, 즉 낮은 농도(10nM)의 인슐린에 오랜 시간 동안(12시간 이상) 노출되게 되면 IRS-1의 양이 줄어들어 인슐린 저항성이 유도되게 된다.
- 흥미롭게도 인슐린 무자극 읺ucose uptakee 24시간까지 처리시간에 따라 지속적으로 촉진 활성이 높아진 반면, 인슐린 자극 glucose uptake의 경우에는 6시간 처리시 가장 높은 활성을 보인 후 그 이상의 처리는 오히려 활성을 떨어뜨림을 알 수 있었다. 이 결과로부터 인슐린무자극 glucose uptake과 인슐린 자극 glucose uptake을 촉진시키는 성분은 서로 다른 물질인 것으로 추정되었다. 얻어진 결과를 근거로 하여, 이후의 실험은 황백 열수추출물을 6시간 동안 처리하는 조건으로 고정하여 각종 저해제의 처리에 의해 황백의 활성이 어떤 영향을 받는지 조사하였다.
- 즉, 급성 인슐린(lOOnM, 10분)을 처리해주는 인슐린 자극'glucose uptake(insulin-stimulated glucose uptake)에 있어서 10 pig/ml의 알코올 추출물은 대조구 대비 185%로, 100 μg/ml의 열수 주출물은 189%로 증가시키는 탁월한 fucose uptake증가효과를 보여주었다. 이는 본 세포시스템에서 측정된 기존의 항당뇨 약제인 pioglitazone(10juM)의 인슐린 자극 glucose uptake 촉진활성이 140% 수준임 (data not shown)을감안할 때 매우 우수한 촉진활성으로 평가되었다. 또한 급성 인슐린을 처리하지 않는 인슐린 무자극 glucose uptake (basal glucose uptake)에서도 100 μg/ml의 열수 추출물 처리에 의해 5.
- 반면 황백을 처리한 경우에는 황백에 의해 증가된 인슐린 무자극 glucose uptakee wortmannin에 의해 부분적으로만 감소하였으나, 인슐린 자극 glucose uptake에서의 증가 효과는 거의 완전히 억제됨을 관찰할 수 있었다. 이로써 황백의 인슐린 자극 glucose uptake에 대한 촉진효과가 PI 3-kinase에 대한 독립적인 촉진작용에 의한 것임을 확인할 수 있었다. 즉 PI 3-kinase의 활성화를 촉진시킴으로써 그 downstream 인 GLUT4 translocation이 촉진되어 glucose uptake이 향상된 것으로 추정되었다.
- Wortmanmin이 인슐린 자극 glucose uptake만 억제했던 것과 달리, genisteine 황백에 의해서 증가된 인슐린 무자극 fucose uptake도 완전히 억제됨을 보여주었다. 이로써 황백의 작용이 인슐린 신호전달에 매개되는 단백질들의 tyrosine 인산화에 근본적으로 관련되어 있음을 확인할 수 있었다.
- 그러나 두 가지를 동시에 처리했을 때 각각의 단독 처리에 비해 유의적인 증가는 관찰되지 않았다. 이로써 황백의 효과는 vanadate와 비슷한 작용, 즉 tyrosine 탈인산화를 막거나 돕는 작용에 의한 것임을 간접적으로 추정할 수 있었다. 이러한 현상은 앞서 확인된 바와 같이, 황백의 효과가 tyrosine 인산화 저해제에 의해 완전히 억제된 결과와 일치하는 것으로서, 황백의 작용기전이 tyrosine 인산화와 연결되어 있음을 재차 확인 시켜 주었다.
- IRS-1은 인슐린 자극을 IR 로부터 받아 tyrosine 인산화에 의해 활성화됨을 감안할 때, 황백의 처리에 의해 인슐린 저항성 세포의 인슐린 자극glucose uptake0] 회복되는 것은 인슐린 저항성에 의해 IRS- 1의 양이 감소되지만 IRS-1의 인산화가 촉진되어 보상시켜주는 작용에 의한 것으로 추정되었다. 이와 같은 결과로부터, 황백 추출물의 glucose uptake 촉진활성이 인슐린 저 항성을 주원인으로 하는 제 2형 당뇨병에 대한 항당뇨 활성으로 연결될 수 있음을 판단할 수 있었다.
- 3배 이상 증가되는 매우 우수한 glucose uptake 촉진효과를 나타내었다. 인슐린 자극 glucose uptake과 무자극 uptake 모두에 대하여 크게 촉진시키는 이러한 효과는 다른 추출물에서는 나타나지 않는 현상으로서 황백 추출물의 촉진활성 기전이 독특한 것임을 알 수 있었다. 그러나 한편으로 알코올 추출물의 경우에는 50 pig/ml 이상의 농도에서 오히려 촉진활성이 낮아짐지는 것으로 보아 세포 독성을 가지고 있음을 보여주었다.
- 이로써 황백의 인슐린 자극 glucose uptake에 대한 촉진효과가 PI 3-kinase에 대한 독립적인 촉진작용에 의한 것임을 확인할 수 있었다. 즉 PI 3-kinase의 활성화를 촉진시킴으로써 그 downstream 인 GLUT4 translocation이 촉진되어 glucose uptake이 향상된 것으로 추정되었다. 한편 황백에 의해 촉진된 인슐린 무자극 glucose uptake는 PI 3-kinase와 별로 관계가 없음이 확인되었다.
- 탐색한 약용식물 중에 황백의 열수 추출물과 알코올 추출물이 가장 glucose uptake 촉진효과가 우수하였다. 즉, 급성 인슐린(lOOnM, 10분)을 처리해주는 인슐린 자극'glucose uptake(insulin-stimulated glucose uptake)에 있어서 10 pig/ml의 알코올 추출물은 대조구 대비 185%로, 100 μg/ml의 열수 주출물은 189%로 증가시키는 탁월한 fucose uptake증가효과를 보여주었다. 이는 본 세포시스템에서 측정된 기존의 항당뇨 약제인 pioglitazone(10juM)의 인슐린 자극 glucose uptake 촉진활성이 140% 수준임 (data not shown)을감안할 때 매우 우수한 촉진활성으로 평가되었다.
- 대조 군세 포에서의 glucose uptake 값에 대해 각 추출물을 처리함으로써 향상된 정도를 %로 계산하여 Table I에 나타내었다. 탐색한 약용식물 중에 황백의 열수 추출물과 알코올 추출물이 가장 glucose uptake 촉진효과가 우수하였다. 즉, 급성 인슐린(lOOnM, 10분)을 처리해주는 인슐린 자극'glucose uptake(insulin-stimulated glucose uptake)에 있어서 10 pig/ml의 알코올 추출물은 대조구 대비 185%로, 100 μg/ml의 열수 주출물은 189%로 증가시키는 탁월한 fucose uptake증가효과를 보여주었다.
- 이러한 황백의 촉진작용은 PI 3- kinase의 저해제인 wortmannin 처리에 의해 완전히 억제되었으며, p38 MMPK의 저해제인 SB203580에 의해서는 영향을 받지 않았다. 한편 tyrosine kinase의 저해제인 genistein 에 의해서는 인슐린 자극 및 무자극 glucose uptake0] 모두 완벽하게 억제되었으며, tjrosine phosphatase의 저해제인 vanadate와의 유의적인 시너지 효과는 관찰되지 않았다. 따라서 황백 추출물의 glucose uptake 촉진효과는 PI 3-kinase 의 활성화를 촉진시킴으로써 GLUT4 translocation을 향상시키며 또한 그 신호전달 과정 상에서 tyrosine 인산화의 촉진을 통해 그 작용을 나타내는 것으로 추정할 수 있었다.
- 2에는 열수 추출물을 100 μg/mt의 농도로 처리시간을 달리하면서 실험한 결과를 나타내었다. 흥미롭게도 인슐린 무자극 읺ucose uptakee 24시간까지 처리시간에 따라 지속적으로 촉진 활성이 높아진 반면, 인슐린 자극 glucose uptake의 경우에는 6시간 처리시 가장 높은 활성을 보인 후 그 이상의 처리는 오히려 활성을 떨어뜨림을 알 수 있었다. 이 결과로부터 인슐린무자극 glucose uptake과 인슐린 자극 glucose uptake을 촉진시키는 성분은 서로 다른 물질인 것으로 추정되었다.
후속연구
- 이를 위해서는 황백 추출물의 처리에 의한 신호전달 단백질들의 변화를 분자 수준에서 분석하으로써 그 작용기전을 보다 명확히 규명하는 것이 필요하다. 또한 황백 추출물이 보여준 인슐린 무자극 조건에서의 촉진작용이 지방 또는 근육조직 등 인슐린 감수성 조직에서 특이적으로 일어나는 현상인지 조사함으로써 인슐린 비감수성 조직에서의 부작용 가능성에 대해서도 검토가 필요하다 하겠다.
- 따라서 황백 추출물의 glucose uptake 촉진효과는 PI 3-kinase 의 활성화를 촉진시킴으로써 GLUT4 translocation을 향상시키며 또한 그 신호전달 과정 상에서 tyrosine 인산화의 촉진을 통해 그 작용을 나타내는 것으로 추정할 수 있었다. 황백 추출물의 탁월한 glucose uptake 촉진활성과 인슐린 자극 여부에 관계없이 작용하는 독특한 활성기전에 근거하여, 항당뇨 소재로 응용함에 있어 높은 가능성이 기대된다. 이를 위해서는 황백 추출물의 처리에 의한 신호전달 단백질들의 변화를 분자 수준에서 분석하으로써 그 작용기전을 보다 명확히 규명하는 것이 필요하다.
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