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문제 정의
- lentillifera 추출물은 당 대사에 특이적인 효과를 발현하는 것으로 보고한 바 있다[15, 16]. 본 연구에서는 C. okamurae 추출물이 지질 대사 이외에 포도당 대사효과에도 유용한지를 평가하여 제2형 당뇨병 치료 약물의 부작용 중 하나인 체중 증가 개선에 도움을 주는 유용한 천연자원 소재임을 규명하고자 하였다.
제안 방법
- 분화유도를 시작하는 0일째부터 COE 추출물을 처리한 후 실험이 종료된 시점에 배지를 제거하고 2-NBDG 용액을 3T3-L1 지방세포에는 150μg/mL, L6 근육세포에는 80μM 농도로 첨가하였다. 30분 후에 PBS로 2회 세척하고 VICTOR3TM Multilabel Counter (PerkinElmer, MA, Boston, USA)의 excitation 485 nm, emission 535nm에서 형광을 측정하여 control 값에 대한 비율로 계산하였다.
- 3T3-L1 지방전구세포를 지방세포로 분화시키기 위하여 6-well plate에 1×105 cells/well로 분주하고 100% confluent 상태가 되면 분화유도 물질인 5μg/mL insulin, 1μM DEX, 0.5mM IBMX와 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 교환하며 분화를유도였으며, 2일 후 5μg/mL insulin이 포함된 DMEM (10% FBS)배지로 교환하였다. 이로부터 2일 간격으로 DMEM (10% FBS)배지로 보충하면서 4일 후 실험에 이용하였다.
- 실험이 종료되면 MTT (1mg/mL) 용액을 각 well에 200μL씩 첨가하고 4시간 동안 반응시켰다. MTT 용액을 제거하고 각 well에 DMSO 넣고 10분 후에 540nm (Immuno Mini NJ-2300) 에서흡광도를 측정하여 그 결과를 control 값에 대한 비율로 계산하였다. L6 근육세포는 96-well plate에 5×10³ cells/well로 분주하고 분화유도 후 0.
- PTP1B 효소 활성 억제능은 p-NPP를 기질로 이용하여 탈인 산화 정도를 측정하여 판단하였다. PTP1B (0.
- 채취된 embryo는 수정 후 약 6hpf (hours post- fertilization) 일 때 96-well plate 각각의 well에 200μL의 E2 배지(zebrafish embryo medium)를 넣은 후 well당 1마리의 embryo를 옮긴 후 7 dpf (day post-fertilization)까지 성장시켰다. Zebrafish larvae에 COE 추출물을 24시간 동안 노출시킨후 생존율과 기형 정도를 관찰하였다. 당 섭취능도 동일한 조건에서 실험을 진행한 후, well당 600μM 2-NBDG 용액을 3 시간 동안 노출시킨 후 E2 배지를 이용하여 3번 정도 세척한 다음에 COE 추출물을 노출시킨 다음에 디지털 카메라가 장착된 형광현미경(Leica, Wetzlar, Germany)으로 관찰하고 촬영하였다.
- 당 섭취능도 동일한 조건에서 실험을 진행한 후, well당 600μM 2-NBDG 용액을 3 시간 동안 노출시킨 후 E2 배지를 이용하여 3번 정도 세척한 다음에 COE 추출물을 노출시킨 다음에 디지털 카메라가 장착된 형광현미경(Leica, Wetzlar, Germany)으로 관찰하고 촬영하였다. Zebrafish larvae의 형광 강도는 ImageJ program을 사용하여 정량화하였다.
- TTBS 용액으로 10분간 3회 세척한 후 일차 항체(p-IRS1, IRS1, p-AKT, AKT, GLUT4, p-AMPK, AMPK 1:1000)로 2시간 동안 반응시킨 다음에 다시 TTBS 용액으로 3 회 세척하였다. 그 다음에 peroxidase가 포함된 2차항체(goat anti mouse 1:2000, goat anti rabbit 1:2000)로 1시간 동안 반응시켰고 항체의 검출은 chemiluminescent substrate 용액을 이용하여 가시화하고 UVP (Image acquisition and analysis software, VisionworkTMLS)로 분석하였다. 단백 발현의 결과는 각각의 total 단백 및 β-actin으로 비교 정량화하였다.
- 5μM DEX을 24시간 동안 첨가하였다. 그런 다음 COE 추출물을 넣고 24시간 배양시키고 cell counting Kit-8 (Dojindo Laboratory, Kumamoto, Japan) 용액으로 2시간 반응시킨 후 450nm (Immuno Mini NJ-2300)에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 control 값에 대한 비율로 계산하였다.
- 그 다음에 peroxidase가 포함된 2차항체(goat anti mouse 1:2000, goat anti rabbit 1:2000)로 1시간 동안 반응시켰고 항체의 검출은 chemiluminescent substrate 용액을 이용하여 가시화하고 UVP (Image acquisition and analysis software, VisionworkTMLS)로 분석하였다. 단백 발현의 결과는 각각의 total 단백 및 β-actin으로 비교 정량화하였다.
- Zebrafish larvae에 COE 추출물을 24시간 동안 노출시킨후 생존율과 기형 정도를 관찰하였다. 당 섭취능도 동일한 조건에서 실험을 진행한 후, well당 600μM 2-NBDG 용액을 3 시간 동안 노출시킨 후 E2 배지를 이용하여 3번 정도 세척한 다음에 COE 추출물을 노출시킨 다음에 디지털 카메라가 장착된 형광현미경(Leica, Wetzlar, Germany)으로 관찰하고 촬영하였다. Zebrafish larvae의 형광 강도는 ImageJ program을 사용하여 정량화하였다.
- Mo 등은 C2C12 근육세포와 마우스의 덱사메타손 유래 제2형 당뇨모델에서 쿠마린(coumarins) 성분이 인슐린 신호전달 protein kinase B (AKT)와 당 수송체 GLUT4의 활성화, 생체 에너지와 당 대사조절에 중요한 역할을 수행하는 AMPK의 활성도를 증가시켜 혈당을 개선시킨다고 보고한 바 있다[34]. 본 실험에서도 덱사메타손 유래 인슐린저항성 모델을 이용하여 COE 추출물의 인슐린 저항성 개선 메커니즘을 분석하였다. L6 근육세포에 0.
- 분주하고 배양하였다. 분화유도를 시작하는 0일째부터 COE 추출물을 처리한 후 실험이 종료된 시점에 배지를 제거하고 2-NBDG 용액을 3T3-L1 지방세포에는 150μg/mL, L6 근육세포에는 80μM 농도로 첨가하였다. 30분 후에 PBS로 2회 세척하고 VICTOR3TM Multilabel Counter (PerkinElmer, MA, Boston, USA)의 excitation 485 nm, emission 535nm에서 형광을 측정하여 control 값에 대한 비율로 계산하였다.
- 5mM IBMX와 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 교환하며 분화를유도였으며, 2일 후 5μg/mL insulin이 포함된 DMEM (10% FBS)배지로 교환하였다. 이로부터 2일 간격으로 DMEM (10% FBS)배지로 보충하면서 4일 후 실험에 이용하였다. L6 근육세포는 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 배양한 후에 80-90% confluent 상태가 되면 분화유도 하기 위하여 4~5일 동안 2% FBS 함유 DMEM 배지로 교환한다.
대상 데이터
- Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), newborn calf serum (FCS), fetal bovine serum (FBS), phosphate buffered saline (PBS), trypsin- EDTA, penicillin-streptomycine Hyclone (Longan, UT, USA) 에서 구입하였다. 2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl) amino]- 2-deoxyglucose (2-NBDG)는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 로부터 구입하였고, Gly-Pro-AMCe Ana Spec, Inc. (San Jose, CA, USA)로부터 구입하였고, interleukin (IL)-1β와 interferon (IFN)-γ은 R&D (Minneapolis, MN, USA), rat insulin kite Mercodia Developing Diagnostics (Mercodia, Uppsala, Sweden) 로부터 구입하였다. Glucose Transporter Type 4 (GLUT4) primary antibody와 secondary antibody (anti-rabbit, anti-mouse) 는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였고, p-IRS1 (insulin receptor substrate 1), IRS1, p-IRS1 (ser 307), p-AKT (protein kinase B, PKB), AKT, p-AMPK (5' AMP-activated protein kinase), AMPK primary antibody는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.
- Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), newborn calf serum (FCS), fetal bovine serum (FBS), phosphate buffered saline (PBS), trypsin- EDTA, penicillin-streptomycine Hyclone (Longan, UT, USA) 에서 구입하였다. 2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl) amino]- 2-deoxyglucose (2-NBDG)는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 로부터 구입하였고, Gly-Pro-AMCe Ana Spec, Inc.
- 0을 유지하면서 순환하는 여과 시스템 (Zebtec Stand Alone, Italy)의 수조에 10-15마리 정도 넣은 후제브라피쉬용 먹이 Gemma Micro ZF 300 (Skretting Zebrafish; Tooele, UT, USA)를 하루에 3번 주면서 사육하였다. Embryo 채취는 성체 zebrafish 암수를 실험 24시간 이전에 embryo 채취용 수조에 넣고 다음날 광주기 시작 2시간 이내에 embryo을채취하였다. 채취된 embryo는 수정 후 약 6hpf (hours post- fertilization) 일 때 96-well plate 각각의 well에 200μL의 E2 배지(zebrafish embryo medium)를 넣은 후 well당 1마리의 embryo를 옮긴 후 7 dpf (day post-fertilization)까지 성장시켰다.
- (San Jose, CA, USA)로부터 구입하였고, interleukin (IL)-1β와 interferon (IFN)-γ은 R&D (Minneapolis, MN, USA), rat insulin kite Mercodia Developing Diagnostics (Mercodia, Uppsala, Sweden) 로부터 구입하였다. Glucose Transporter Type 4 (GLUT4) primary antibody와 secondary antibody (anti-rabbit, anti-mouse) 는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였고, p-IRS1 (insulin receptor substrate 1), IRS1, p-IRS1 (ser 307), p-AKT (protein kinase B, PKB), AKT, p-AMPK (5' AMP-activated protein kinase), AMPK primary antibody는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. Nitrocellulose membranee Bio-rad사(서울, 한국)에서 구입하였고, 시약 및 용매는 특급 또는 1급 시약을 사용하였다.
- Insulin, 4-nitrophenyl phosphate bis(cyclohexyl-ammonium) salt (NPP), 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), bovine serum albumin, Oil Red O, 2- mercaptoethanol, anti-β-actin antibody, insulin, dexamethasone (DEX), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), newborn calf serum (FCS), fetal bovine serum (FBS), phosphate buffered saline (PBS), trypsin- EDTA, penicillin-streptomycine Hyclone (Longan, UT, USA) 에서 구입하였다.
- Glucose Transporter Type 4 (GLUT4) primary antibody와 secondary antibody (anti-rabbit, anti-mouse) 는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였고, p-IRS1 (insulin receptor substrate 1), IRS1, p-IRS1 (ser 307), p-AKT (protein kinase B, PKB), AKT, p-AMPK (5' AMP-activated protein kinase), AMPK primary antibody는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. Nitrocellulose membranee Bio-rad사(서울, 한국)에서 구입하였고, 시약 및 용매는 특급 또는 1급 시약을 사용하였다.
- USA)으로부터 분양 받았다. RIN-m5F 췌장베타세포와 L6 근육세포는 5% CO2, 37oC 배양기에서 100 Units/mL penicilin, 100μg/mL streptomycin, 2.5μg/mL amphotericin B, 10% FBS가 함유된 RPMI1640 또는 DMEM 배지 조건에서 배양되었고, 3T3-L1 지방전구세포는 동일한 배양조건의 10% FCS가 함유된 DMEM 배지 조건에서 배양되었다. 모든 세포주는 2일마다 신선한 배지로 보충하면서 계대배양하여 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용된 모든 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC; USA)으로부터 분양 받았다. RIN-m5F 췌장베타세포와 L6 근육세포는 5% CO2, 37oC 배양기에서 100 Units/mL penicilin, 100μg/mL streptomycin, 2.
데이터처리
- 5 μM of dexamethasone. Data are presented as the mean±standard error (n=3) and analyzed by one-way analysis of variance followed by Dunnett’s test.
- Green color is the signal of fluorescence. Data are presented as the mean±standard error of the three independent experiments and analyzed by one-way analysis of variance followed by Dunnett’s test. Magnification is 80.
- 1 Effect of COE on DPP-IV (A) and PTP1B (B) enzyme activities. Data displayed reflect the mean SE (n=6) of the three independent experiments and analyzed by one-way analysis of variance followed by Dunnett’s test. *p<0.
- SE)로 표현하였다. 각 군 간의 차이는 Graphpad Prism의 One way-ANOVA (analysis of variance) 처리 후 사후검정은 Dunnett’s test를 이용하였으며, p<0.05 수준에서 유의성 있는 것으로 판정하였다.
- 모든 실험결과는 3회 이상 반복하였으며, 평균±표준오차(standard error, SE)로 표현하였다. 각 군 간의 차이는 Graphpad Prism의 One way-ANOVA (analysis of variance) 처리 후 사후검정은 Dunnett’s test를 이용하였으며, p<0.
성능/효과
- COE 추출물은 3T3-L1 지방전구세포에서 500μg/mL 농도까지는 세포독성을 나타내지 않았다. 3T3-L1 지방세포에서 COE 추출물(125와 250μg/mL)은 인슐린 수용체 기질 IRS 의인 산화 활성과 당 수송체 GLUT4의 전이를 증가시켜 당 흡수를 매우 효과적으로 조절하는 것으로 확인되었다(Fig. 3). COE 추출물은 시료를 첨가하지 않은 대조군에 비해 농도 의존적으로 당 흡수를 증가시켰으나 양성대조물인 인슐린(100nM) 처리 군에 비해서는 낮은 수치를 보였다(Fig.
- 2B). COE 추출물은 2형당뇨의 만성 염증반응에 따른 췌장 베타세포의 사멸기전을 미비하게 억제시키지만 인슐린 분비 촉진 효과에는 아무런 영향을 미치는 않는 것으로 확인되었다.
- DPP-4 억제제는 포도당 농도에 비례하여 인슐린 분비를 증가시키고 2형 당뇨의 근본적인 병인인 췌장 베타세포의 기능 저하를 개선시킬수 있는 약물이다. COE 추출물은 시료를 첨가하지 않는 대조군에 비해 DPP-IV 효소 활성 억제효과를 유의적으로 나타냈으며, 1000μg/mL 농도에서 DPP-IV 활성이 20% 정도 억제되는 것으로 나타났다(Fig. 1A).
- 3). COE 추출물은 시료를 첨가하지 않은 대조군에 비해 농도 의존적으로 당 흡수를 증가시켰으나 양성대조물인 인슐린(100nM) 처리 군에 비해서는 낮은 수치를 보였다(Fig. 3A). 또한, COE 추출물은 인슐린 수용체 기질의 타이로신 인산화 및 당 수송체 GLUT4의 발현을 시료를 첨가하지 않은 대조군에 비해 유의적으로 향상시켰다(Fig.
- 본 실험에서도 덱사메타손 유래 인슐린저항성 모델을 이용하여 COE 추출물의 인슐린 저항성 개선 메커니즘을 분석하였다. L6 근육세포에 0.5 μM 덱타메타손 처리시 정상군에 비해당 흡수와 세포 생존율 이유의 하게 감소되었으나 COE 추출물 첨가군에서는 이러한 증상이 유의하게 회복되어지는 것이 관찰되었다(Fig. 5). IRS-1 세린(serine) 잔기의 인산화는 인슐린 신호 전달을 감소시키므로 인슐린 저항성이 유발되었음을 의미하는 기전이다.
- 제브라피쉬는 인간의 유전자와 매우 유사한 구조적 특징을 지니고 있기 때문에 당뇨병을 비롯한 대사질환의 병리학적 연구 및 치료 후보약물의 효능을 검증하는데 활용될 수 있는 동물모델이다[29, 30]. Zebrafish larvae의 독성평가를 위해 수정 후 7dpf (days post-fertilization) 일 때 COE 추출물을 125, 250, 500μg/mL 농도로 24시간 동안 노출시켰으나 생존율과 기형현상은 관찰되지 않았다(Fig. 4A).
- 1B). 결론적으로 COE 추출물은 DPP-IV와 PTP1B 효소 활성 억제효과를 통해 혈중 포도당 농도를 조절할 수 있는 작용기전을 지닌 천연소재라고 여겨진다.
- 그러므로 COE 추출물은 인슐린 표적세포인 근육세포에서 인슐린 수용체, 인슐린 신호전달, 당 수송체 및 AMPK의 활성화를 통해 인슐린 저항성을 개선시키고 당 흡수를 촉진시키는 것으로 확인되었다. 결론적으로 COE 추출물은 음식 섭취 후 상승된 혈중 포도당 농도를 조절하는데 관여하는 DPP-IV 효소의 활성을 감소시키고, 인슐린 표적세포인 지방과 근육세포에서 인슐린 신호전달 IRS-1과 AKT 활성화 및 AMPK 단백 발현의 증가를 통해 당수송체 GLUT4의 활성을 촉진시켜 당 대사를 조절하는 것으로 확인되었다. 이러한 COE 추출물의 당 대사 조절 효과는 제브라피쉬 실험에서도 동일한 결과로 나타났다.
- 이러한 COE 추출물의 당 대사 조절 효과는 제브라피쉬 실험에서도 동일한 결과로 나타났다. 그러나 2형 당뇨의 특징인 췌장 베타세포의 인슐린 분비 감소에는 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 이상의 결과로 볼 때 COE 추출물은 인슐린 민감성을 개선시켜 당 대사를 효율적으로 조절하는데 기여할 수 있는 건강기능식품 또는 의약품 개발의 유용한 천연소재라고 여겨진다.
- 6). 그러므로 COE 추출물은 인슐린 표적세포인 근육세포에서 인슐린 수용체, 인슐린 신호전달, 당 수송체 및 AMPK의 활성화를 통해 인슐린 저항성을 개선시키고 당 흡수를 촉진시키는 것으로 확인되었다. 결론적으로 COE 추출물은 음식 섭취 후 상승된 혈중 포도당 농도를 조절하는데 관여하는 DPP-IV 효소의 활성을 감소시키고, 인슐린 표적세포인 지방과 근육세포에서 인슐린 신호전달 IRS-1과 AKT 활성화 및 AMPK 단백 발현의 증가를 통해 당수송체 GLUT4의 활성을 촉진시켜 당 대사를 조절하는 것으로 확인되었다.
- 3A). 또한, COE 추출물은 인슐린 수용체 기질의 타이로신 인산화 및 당 수송체 GLUT4의 발현을 시료를 첨가하지 않은 대조군에 비해 유의적으로 향상시켰다(Fig. 3B와 C). 본 연구결과로 인하여 COE 추출물은 인슐린과 인슐린 수용체의 민감성 향상 및 당 수송체단백의 전이를 증가시켜 지방세포내로 당 흡수를 개선시키므로 2형 당뇨의 당 대사 및 인슐린저항성 개선효과에 매우 유용한 천연소재라고 사료된다.
- 6). 또한, 덱사메타손 노출에 의해 감소된 AKT, AMPK, GLUT4의 발현이 COE 추출물 첨가에 의해 유의하게 증가되는 것이 확인되었다(Fig. 6). 그러므로 COE 추출물은 인슐린 표적세포인 근육세포에서 인슐린 수용체, 인슐린 신호전달, 당 수송체 및 AMPK의 활성화를 통해 인슐린 저항성을 개선시키고 당 흡수를 촉진시키는 것으로 확인되었다.
- 3B와 C). 본 연구결과로 인하여 COE 추출물은 인슐린과 인슐린 수용체의 민감성 향상 및 당 수송체단백의 전이를 증가시켜 지방세포내로 당 흡수를 개선시키므로 2형 당뇨의 당 대사 및 인슐린저항성 개선효과에 매우 유용한 천연소재라고 사료된다.
- 그러나 2형 당뇨의 특징인 췌장 베타세포의 인슐린 분비 감소에는 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 이상의 결과로 볼 때 COE 추출물은 인슐린 민감성을 개선시켜 당 대사를 효율적으로 조절하는데 기여할 수 있는 건강기능식품 또는 의약품 개발의 유용한 천연소재라고 여겨진다.
- 전남 진도군 연안에서 채취한 옥덩굴(C. okamurae)은 목포대학교 해양수산자원학과 박찬선교수에 의해 동정 또는 확인되었다. 수집된 옥덩굴은 15oC 정도의 정수기 물로 약 1~2시간 담그어놓았다가 염분을 제거시키는 과정을 반복하여 염분을 완전히 제거시켰다.
- 제브라피쉬 수정 후 7 dpf일째에 COE 추출물(125와 250μg/ mL)과 2-NBDG 물질을 함께 처리하였더니 시료를 첨가하지 않은 대조군에 비해당 흡수율이 뚜렷하게 증가되는 것으로 관찰되었다(Fig. 4B). 그러므로 COE 추출물은 세포실험결과와 마찬가지로 제브라피쉬 동물실험에서도 혈액 내 포도당 대사의 항상성 조절기전에 기여하는 유용한 천연소재임이 증명되었다.
- 임상적으로 제2형 당뇨병 환자에게 인슐린 민감성을 증가시키는 경구용 혈당강하제 로지글리타존(rosiglitazone) 을 투여하면 베타세포 기능이 상당히 개선되는 것으로 보고된바 있다[25]. 췌장 베타세포인 RIN-m5F 세포의 사이토카인(IL- 1β 2ng/mL, IFN-γ 100 U/mL) 노출에 의한 세포독성을 측정한 결과, 사이토카인 단독 첨가군의 세포생존율은 정상군에 비해 50% 정도 감소되었다(Fig. 2A). 사이토카인에 COE 추출물을 함께 처리한 경우의 세포생존율은 사이토카인 단독 처리 군에 비해 약간 증가하는 경향을 보이지만 통계적인 유의성은 없었다(Fig.
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