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문제 정의
- 이에 저자는 화상 및 창상 치료에 효과가 있을 것으로 기대되는 생약인 자근과 치자의 복합제제에 음이온을 가진 Nano-ATP®를 사용하여 히드로겔을 제조하고, 피부투과, 소염 진통 작용, 화상 및 창상에 대한 치료 효과 관찰 실험 등을 통하여 효과적인 화상 및 창상을 포함하는 피부질환 치료제를 개발하고자 하였다.
제안 방법
- 8 cm인 skin punch를 이용하여 등 피부를 punching하여 excision wound model을 작성하였다.26) 약물을 적용하지 않는 군을 대조군으로 하고 약물 처치 군은 가피가 탈락될 때까지 매일 1회 LR, GLC 및 GLN gel 제제를 0.1 g씩 적용하고 약물 적용 1시간 후 콜라겐액을 드레싱 하였다.
- Cho 등18)의 방법을 응용하여 thermal bum rat model의 Bum healing 정도를 측정함으로써 Bum grade와 치료계수를 산출하였다. Bum grade는 창상부위의 가로, 세로 길이를 각각 측정하여 상대적인 비율로 표시하였는데 %가 낮을수록 회복이 촉진된 것을 나타낸다.
- 4 완충용액을 사용하였다. Franz modified diffusion cell에 hairless mouse 피부를 장착하고 LR, GF, GLC 및 GLN gel 제제를 도포한 후 채취 시간마다 시험액 100 ㎕씨을 채취하고 새로운 시험액을 동량 보충하였다. 시험액은 37±0.
- Shikonin 및 acetylshikonin의 함량은 yun 등의 HPLC 법을 응용하여 정량하였다. 고정상으로는 n-Bondapak C[8 (3.
- 가흐]고, sonication하여 균질화하였다. 균질액에 t-buthyl ethyl ether 5 mL를 가하여 원심분리 시킨 후 상징액 1 mL 를 취하고, 50℃에서 증발 건조시킨 후 용제에 녹여 HPLC 에 주입한 다음 피크면적의 양으로써 geniposide, shikonin 및 acetylshikonin의 잔류량을 산출하였다.
- 마우스 등 피부의 변화양상을 관찰을 위해서 화상 및 창상의 실험 진행 과정 중 가피 생성 및 완치단계에서 마우스를 에테르로 마취시킨 다음 microhand scopy를 사용하여 50배 확대하여 사진을 촬영하였다.
- 약물 도포는 유발 1시간 전에 오른쪽 족저부에 각각 1회씩 도포하였다. 부종 측정은 plethysmometer를 이용하여 1% X- carrageenan과 1% kaolin의 투여 전과 투여 후 6, 12, 24 및 48시간대에서 3회 반복측정 하여 평균값으로 정하였다. 부종율은 λ-carrageenan주사 직후 및 각 시간대의 발 부피의 변화를 이용하여 다음 식으로 부종율(%, swelling) 및 부종 억제율(%, inhibition)을 산출하였다.
- 부종 측정은 plethysmometer를 이용하여 1% X- carrageenan과 1% kaolin의 투여 전과 투여 후 6, 12, 24 및 48시간대에서 3회 반복측정 하여 평균값으로 정하였다. 부종율은 λ-carrageenan주사 직후 및 각 시간대의 발 부피의 변화를 이용하여 다음 식으로 부종율(%, swelling) 및 부종 억제율(%, inhibition)을 산출하였다.26,27)
- 1 mL를 주사하여 유발시켰다. 약물 도포는 유발 1시간 전에 오른쪽 족저부에 각각 1회씩 도포하였다. 부종 측정은 plethysmometer를 이용하여 1% X- carrageenan과 1% kaolin의 투여 전과 투여 후 6, 12, 24 및 48시간대에서 3회 반복측정 하여 평균값으로 정하였다.
- 화상실험은 마우스를 에테르로 마취시키고 털을 깨끗이 제거한 후 등 피부에 100℃의 stainless steel heating pad를 접촉하여 2도 화상을 입혀 thermal bum model을 작성하였다. 약물을 적용하지 않는 군을 대조군으로 하고 약물 처치 군은 가피가 탈락될 때까지 매일 1회 LR, GLC 및 GLN gel 제제를 0.1 g씩 적용하고 약물 적용 1시간 후 콜라겐액 0.5 mL 을 드레싱하여 외부 공기와의 접촉을 최소화하였다.
- 자근 히드로겔 (이하 LR gel)의 제조는 yang 등20)의 방법을 응용하여 제조하였는데, 먼저 자근 엑스 분말을 정제수에 용해시키고 프로필렌글리콜, labrosol, 에탄올을 순차적으로 가하여 혼합한 후 카보폴 940을 넣어 팽윤시키고 트리에탄올아민을 적가 하여 pH 7.0으로 하여 gel을 제조하였다. 치자 히드로겔의 제조 (이하 GF gel)는 자근 대신 치자 엑스 분말을 사용하여 LR gel과 동일한 방법으로 제조하였다.
- 치자 히드로겔의 제조 (이하 GF gel)는 자근 대신 치자 엑스 분말을 사용하여 LR gel과 동일한 방법으로 제조하였다. 자근과 치자의 복합 겔의 제조 (이하 GLC gel)는 자근과치자 용액을 혼합한 후 LR gel과 동일한 방법으로 제조하였다. 복합 나노겔의 제조 (이하 GLN gel)는 GLC gel의 제조 방법에 따랐으며 정제수 대신 Nano-ATP®를 사용하였다.
- 창상 실험은 마우스를 에테르로 마취시키고 털을 제거한 후 등 피부에 직경 0.8 cm인 skin punch를 이용하여 등 피부를 punching하여 excision wound model을 작성하였다.26) 약물을 적용하지 않는 군을 대조군으로 하고 약물 처치 군은 가피가 탈락될 때까지 매일 1회 LR, GLC 및 GLN gel 제제를 0.
- 치료계수는 상처부위에 가피 생성 후 가피가 완전히 탈락하여 새살이 돋아나는데 경과한 날짜를 관찰하여 비교하였다. 28)대조군에서 7일째 되는 날 Wound grade가 65%였지만 GLC 25%, GLN 18%를 나타내어 대조군에 비해 약물처치군의상처 크기가 현저하게 작아짐을 알 수 있었으며 특히 GLN gel의 Wound grade가 가장 낮아 다른 제제에 비해 상대적으로 회복이 빠른 것을 알 수 있었다(Figure 6).
- Bum grade는 창상부위의 가로, 세로 길이를 각각 측정하여 상대적인 비율로 표시하였는데 %가 낮을수록 회복이 촉진된 것을 나타낸다. 치료계수는 화상부위에 가피 생성 후 가피가 완전히 탈락하여 새살이 돋아나는데 경과한 날짜를 관찰하여 비교하였다. 대조군에서 7일째 되는 날 Bum grade가 70%이였는데 GLC 25%, GLN 16%를 나타내어 대조군에 비해 약물처치군의 상처 크기가 현저하게 작아짐을 알 수 있었으며 특히 GLN gel의 Bum grade 가 가장 낮아 다른 제제들에 비해 상대적으로 회복이 빠른것을 알 수 있었다(Figum 4).
- 0으로 하여 gel을 제조하였다. 치자 히드로겔의 제조 (이하 GF gel)는 자근 대신 치자 엑스 분말을 사용하여 LR gel과 동일한 방법으로 제조하였다. 자근과 치자의 복합 겔의 제조 (이하 GLC gel)는 자근과치자 용액을 혼합한 후 LR gel과 동일한 방법으로 제조하였다.
- 2℃를 유지하도록 하였으며 cell 내의 교반속도는 600rpm으로 고정하였다. 피부의 단위 면적당 통과한 주성분의 양을 시간에 대한 함수로 나타낸 후 다음의 식을 이용하여 투과 파라메터들을 구하였다.23)
- 한방에서 청혈 및 해열 작용을 가진 자근과 소염 및 진통작용을 가진 치자엑스를 사용하여 하이드로겔 제제를 제조한 후, 화상 및 창상에 대한 치료효과를 관찰하기 위하여 주성분의 확인과 정량, 피부투과 실험, 피부잔류량 측정, 항염효과, 화상 및 창상 실험을 통하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 화상실험은 마우스를 에테르로 마취시키고 털을 깨끗이 제거한 후 등 피부에 100℃의 stainless steel heating pad를 접촉하여 2도 화상을 입혀 thermal bum model을 작성하였다. 약물을 적용하지 않는 군을 대조군으로 하고 약물 처치 군은 가피가 탈락될 때까지 매일 1회 LR, GLC 및 GLN gel 제제를 0.
대상 데이터
- Hairless mouse (웅성, 25±5 g, Charles River Lab., USA) 와 S.D계 랫트 (웅성, 200±20g, 대한실험동물센터, Korea) 를 분양받아 사용하였으며, 사육실 온도는 25±1℃, 습도 55±10%를 유지하였고, 명암은 12시간 주기로 하였다. 고형사료와 물은 자유롭게 먹도록 하였다.
- High Performance Liquid Chromatograph (M930, Yoimgin Co., Korea) Skin permeation tester (FCDV-15, Lab Fine, Korea), Digital Plethysmometer (LE 7500, Panlab S.L, Spain), Hand scopy (USB microscope M2, Scalar Co., Japan)등을 사용하였다.
- 3 v/v%) 의 혼액을 사용하였다. 검출기는 UV detector로서 파장은 548 nm, 유속은 1.2mL/min, 감도는 0.05AUFs였고 얻어진 피크의 면적을 측정하여 계산하였다.
- 응용하여 정량하였다. 고정상으로는 n-Bondapak C[8 (3.9x300 mm)을 사용하였고, 이동상으로는 acetonitrile : water : acetic acid : 트리에탄올아민 (70 : 30 : 0.3 : 0.3 v/v%) 의 혼액을 사용하였다. 검출기는 UV detector로서 파장은 548 nm, 유속은 1.
- 자근(Lithospermi Radix)과 치자(Gardeniae Fructus)는 익산 보화당 약국에서 구입, 음건하여 사용하였고 shikonin (Wako Chemical Co., Japan)과 geniposide (Sigma Chemical Co, U.S.A)은 표준품을 사용하였고, 카보폴 940은. BASF Co.
- 치자 엑스 분말로 제조한 gel제 중에 함유되어 있는 geni- poside의 확인, 정량을 위하여 HPLC를 사용하였으며, 칼럼은 |J-Bondapak Ci8 (3.9x300 mm)을 사용하였고, 이동상으로는 acetonitrile : water (15 : 85 v/v%)의 혼액을 사용하였다. 검출기는 UV detector^, 파장은 240 nm, 유속은 1.
이론/모형
- Yang 등20)의 방법에 따라, 자근 및 치자엑스 분말을 1% 씩 함유하도록 LR, GF, GLC 및 GLN 4종의 겔을 조제하였는데 겔화제로서 카보폴 940을 넣었을 때, 거의 점성이 없었으므로 트리에탄올아민을 가하여 pH 7.0으로 조정하여 점도를 15000~20000mPa·s로 유지시킨 후 연고용 튜브에20 g씩 충전하여 밀봉하였다(Table I).
- Yun 등a)의 방법에 따라 HPLC를 이용하여 파장 548 nm 에서 shikonin 및 acetylshikonin의 chromatogram을 작성하여 함량을 산출하였다. Shikonin의 피크는 4.
- 자근과 치자의 복합 겔의 제조 (이하 GLC gel)는 자근과치자 용액을 혼합한 후 LR gel과 동일한 방법으로 제조하였다. 복합 나노겔의 제조 (이하 GLN gel)는 GLC gel의 제조 방법에 따랐으며 정제수 대신 Nano-ATP®를 사용하였다.
- 피부잔류량 실험은 Lee 등24)의 방법에 따라 측정하였는데, 먼저 피부투과실험 직후에 피부상에 잔류되어 있는 겔을 제거하고 생리식염수를 사용하여 피부를 충분히 씻어 낸 후 gel을 직접 바른 부분의 피부만을 절제하고 -66℃냉동건조기에 보관한 다음 해동시켜 무게를 잰 뒤 tris buffer 1 mL을 가흐]고, sonication하여 균질화하였다. 균질액에 t-buthyl ethyl ether 5 mL를 가하여 원심분리 시킨 후 상징액 1 mL 를 취하고, 50℃에서 증발 건조시킨 후 용제에 녹여 HPLC 에 주입한 다음 피크면적의 양으로써 geniposide, shikonin 및 acetylshikonin의 잔류량을 산출하였다.
- 피부투과 실험은 Yang 등끄)의 피부투과 실험방법에 따라, GF, LR, GLC 및 GLN gel 제제를 각각 1.0g을 취하여 hairless mouse 피부에 도포한 후 geniposide, shikonin 및 acetylshikonin의 피부투과량을 측정하기 위하여 Franz modified diffusion cell (area: 1.77 cm2, effective vol.: 11.5 mL)을 이용하였다. Hairless mouse 피부는 복부를 절개하고 피하지방 및 모세혈관을 조심스럽게 제거한 후 사용하였다.
성능/효과
- 08 mL로써 대조군과 별 차이 가 없었다. 12시간 후부터 부종억제 효과가 나타나기 시작하여 24 시간 후 대조군의 발 부피는 1.80 mL인데 비하여 GLC 및 GLN에서 1.70, 1.65 mL로서 유의성 있는 차이가 나타났으며, 48시간까지 그 효과가 지속되었다. 시간별 부종율을 비교해 보면 6시간 후 대조군에서 58%인 반면 GLC 및 GLN에서 각각 60%, 59%로 나타나 별 차이가 없었으나 24시간 후에는 대조군은 40%인데 비하여 GLC, GLN은 33%, 26%로 나타났다.
- 치료계수는 상처부위에 가피 생성 후 가피가 완전히 탈락하여 새살이 돋아나는데 경과한 날짜를 관찰하여 비교하였다. 28)대조군에서 7일째 되는 날 Wound grade가 65%였지만 GLC 25%, GLN 18%를 나타내어 대조군에 비해 약물처치군의상처 크기가 현저하게 작아짐을 알 수 있었으며 특히 GLN gel의 Wound grade가 가장 낮아 다른 제제에 비해 상대적으로 회복이 빠른 것을 알 수 있었다(Figure 6). 치료 계수는 대조군이 12일이 소요되었으나, GLC가 8일, GLN이 7 일로서 역시 GLN gel의 상처 회복 속도가 가장 빠름을 알 수 있었다(Figure 7).
- 시간별 부종율을 비교해 보면 6시간 후 대조군에서 58%인 반면 GLC 및 GLN에서 각각 60%, 59%로 나타나 별 차이가 없었으나 24시간 후에는 대조군은 40%인데 비하여 GLC, GLN은 33%, 26%로 나타났다. 48시간 후 대조군에 대한 부종 억제율은 GLC gel에서 33%로 나타난 반면, GLN gel에서는 59%로써 2배 정도 높은 억제율을 보여주었다(Figure 3).
- 77 pg/ cn?로써 큰 차이를 나타내지는 못하였다. Acetylshikonin의 8시간 후 총 투과량을 비교해보면 GLN gel에서 25.15 ㎍/cm2로써 가장 높은 투과량을 나타내었고, GLC gel 23.55 |ig/cm2, LR gel 21.26 ㎍/cm2의 순으로 나타났으며, shikonin 의 투과량과 비교해 보았을 때 전체적으로 각 제제에서 3배 정도 높은 투과량을 나타내었다. 한편 geniposide의 8시간 후 총 투과량은 GLN 및 GLC gel에서 각각 57.
- 999&로써 200 |xg/mL까지의 농도에서는 geniposide의 직선성이 인정되었다. Gel 제제의 geniposide의 함유량은 각 제제에서 291.3~295.7mg%로 나타났다(Table Ⅱ).
- 66 ㎍/cm2/hr로써 shikonin보다 평균적으로 3배 정도 높은 수치를 나타내었다. Geniposide의 단위시간당 피부투과속도는 GLN gel 이 7.15 ㎍/cm2/hr로써 가장 높았고 GLC gel 6.89, GF gel 5.72 ㎍/cm2/hr로써 비교적 높은 투과속도를 보여 주었다.
- 8분에서 geniposide의 peak가 나타났다 (Figure 1). Geniposide의 피크 면적으로 작성된 검량선의 회귀 직선식은 y=19627.77x-6132.92이였고 상관계수r2= 0.999&로써 200 |xg/mL까지의 농도에서는 geniposide의 직선성이 인정되었다. Gel 제제의 geniposide의 함유량은 각 제제에서 291.
- Shikonin 및 acetylshikonin의 투과량은 GLN gel에서 가장 높게 나타났고 geniposide의 피부투과량은 GLC 및 GLN에서 모두 높게 나타났으며, shikonin 및 acetylshiyniii의 8 시간 후 피부잔류량은 각각 3.61 ㎍/cm2 6.1 ㎍/cm2이였고 geniposide는 10.8 ㎍/cm2를 유지하였다.
- Shikonin의 단위시간당 피부투과속도를 비교해보면 GLN gel 이 1.17, GLC gel은 1.11, LR gel은 1.06 ㎍/cm2/hr로나타난 반면, acetylshikonin의 단위시간당 피부투과속도는 GLN gel이 3.14, GLC gel은 2.91, LR gel은 2.66 ㎍/cm2/hr로써 shikonin보다 평균적으로 3배 정도 높은 수치를 나타내었다. Geniposide의 단위시간당 피부투과속도는 GLN gel 이 7.
- 8 ㎍/cm2 로서 가장 높은 잔류량을 나타내었다. 각 성분들의 잔류량은 피부투과량에 비하여 shikonir은 41.9%, acelylshikonin 26.2%, geniposide 20.9%가 잔류하는 것으로 나타났다(Figure 2).
- 치료계수는 화상부위에 가피 생성 후 가피가 완전히 탈락하여 새살이 돋아나는데 경과한 날짜를 관찰하여 비교하였다. 대조군에서 7일째 되는 날 Bum grade가 70%이였는데 GLC 25%, GLN 16%를 나타내어 대조군에 비해 약물처치군의 상처 크기가 현저하게 작아짐을 알 수 있었으며 특히 GLN gel의 Bum grade 가 가장 낮아 다른 제제들에 비해 상대적으로 회복이 빠른것을 알 수 있었다(Figum 4). 치료 계수는 대조군이 13일이 소요되었으나, GLC가 9일, GLN이 8일로서 역시 GLN gel 의 상처 회복 속도가 가장 빠름을 알 수 있었다(Figum 5).
- 9.38 pg/cm?로써 다른 시료에 비하여 높은 투과율을 나타내었고 LR 및 GLC gel에서는 각각 피부투과율이 8.44, 8.77 pg/ cn?로써 큰 차이를 나타내지는 못하였다. Acetylshikonin의 8시간 후 총 투과량을 비교해보면 GLN gel에서 25.
- 65 mL로서 유의성 있는 차이가 나타났으며, 48시간까지 그 효과가 지속되었다. 시간별 부종율을 비교해 보면 6시간 후 대조군에서 58%인 반면 GLC 및 GLN에서 각각 60%, 59%로 나타나 별 차이가 없었으나 24시간 후에는 대조군은 40%인데 비하여 GLC, GLN은 33%, 26%로 나타났다. 48시간 후 대조군에 대한 부종 억제율은 GLC gel에서 33%로 나타난 반면, GLN gel에서는 59%로써 2배 정도 높은 억제율을 보여주었다(Figure 3).
- 대조군에서 7일째 되는 날 Bum grade가 70%이였는데 GLC 25%, GLN 16%를 나타내어 대조군에 비해 약물처치군의 상처 크기가 현저하게 작아짐을 알 수 있었으며 특히 GLN gel의 Bum grade 가 가장 낮아 다른 제제들에 비해 상대적으로 회복이 빠른것을 알 수 있었다(Figum 4). 치료 계수는 대조군이 13일이 소요되었으나, GLC가 9일, GLN이 8일로서 역시 GLN gel 의 상처 회복 속도가 가장 빠름을 알 수 있었다(Figum 5).
- 하이드로겔 제제 중 주성분의 함량은 LR, GLC 및 GLN gel에서 shikonin, acetylshikonin의 함량은 각각 2.9~3.2mg%, 15.7~ 16.3 mg%이었고, GF, GLC 및 GLN gel에서는 geni- poside의 함량이 285.7~295.7 mg%를 유지하였다.
- 항염효과는 GLC와 GLN gel 모두 대조군에 비하여 양호한 부종억제 효과를 나타내었으며, 그중 GLN gel에서 더욱 우수한 성적을 보여주었다.
- 화상 및 창상 실험에서 각 제제들이 대조군에 비해 상처 회복이 빠르게 진행되었으며 그 중 GLN gel의 상처 치유력이 다른 제제에 비하여 현저하게 높음을 알 수 있었다.
후속연구
- 이상의 결과 자근 및 치자 엑스 복합제제로 GLN 하이드로겔을 제조하여 피부에 도포할 경우 항염 작용, 화상 및 창상의 치료에 효과적인 외용제로 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
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