선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이에 저자는 흰쥐의 간세포를 대상으로 하여 대한약전에 紫根의 기원식물로 수록되어 있는 지치 L. erythrorhizon의 산화 반응 억제 효과 실험을 수행하고 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
가설 설정
- 1. 횐 쥐의 간세포에 대한 紫根의 세포독성은 없었다.
제안 방법
- 6 주령 수컷의 SD계 흰 쥐에 AAPH 50mg/kg를 복강에 매일 투여하여 산화스트레스를 유발한 뒤 분 획별 세포독성 측정시와 마찬가지로 간세포를 분리하였다. 분리된 간세포에 분획별로 얻은 약물을 1%로 희석하여 1이d씩 분주하고 72시간 동안 36X: 에서 배양하였다.
- Catalase assay kit (Oxford Biomedical Research. USA) 를 이용하여 측정하였으며, 520nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다.
- Ethyl ether를 이용하여 실험동물을 마취시킨 후, 대동맥 혈관에 HBSS(Ca2+, Mg2+ free)를 투여하며 복부 쪽 혈관을 절단시켜 동물의 혈액을 모두 배출시켰다. 조직을 잘게 잘라서 RPMI 1640 media(with 10% FBS)와 collagenase typeW(300u/ ml)를 넣고 실온에서 90분간 incubation 하고, 이때 20분에 한 번씩 흔들어줌으로써 간세포가 분리가 잘되도록 도와주었다.
- Lipid peroxidation assay kit (Oxford Biomedical Research. USA)을 이용하여 측정하였고 586nm에서 흡광도를 측정한 후 MDA를 계산하였다.
- SOD 활성도는 SOD assay kit (Dojindo, Japan) 을 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정 후 SOD 활성도를 계산하였다.
- 紫根 100g에 1L의 증류수를 가하고 약탕기(웅진 약탕기, 한국)를 이용하여 3시간 동안 끓인 다음 여과지로 여과한 후 감압증류 장치를 이용하여 수분을 제거하여 분말로 만들었다.
- 조직을 잘게 잘라서 RPMI 1640 media(with 10% FBS)와 collagenase typeW(300u/ ml)를 넣고 실온에서 90분간 incubation 하고, 이때 20분에 한 번씩 흔들어줌으로써 간세포가 분리가 잘되도록 도와주었다.간 조직을 HBSS(Ca2+, Mg2+ free)를 사용하여mesh에서 갈아서 얻어진 시료를 원심 분리하여 획득한 세포는 63%와 36%의 percoll 을 이용하여 간세포와 섞여 있는 lymphocyte를 분리 제거한 후 사용하였다.
- 5x105 cell/well 로 세포를 분주한 후 분 획별로 얻은 약물을 1%로 희석하여 10 M 씩 분주하고 72시간 동안 36°C에서 배양하였다. 배양된 세포를 harvest하기 12T8시간 전에 [3H]-thymidine을 IpCi 처리해주고, 세포를 beta-counter (BECMAN) 에 사용하는 safe cuvette에 500 M 씩 분주한다음, cocktail solution 2 ml 를 첨가한 후 thymidine 의 uptake를 beta-counter로 확인하였다.
- 분리된 간세포에 분획별로 얻은 약물을 1%로 희석하여 1이d씩 분주하고 72시간 동안 36X: 에서 배양하였다. 배양을 끝낸 뒤 배양액을 이용하여 항산화 효과를 검정하였다.
- 복강 내로 투여된 AAPH는 짧은 시간 내에 혈류를 타고 전신을 순환하며, 산소분자와 반응하여 carbon radical을 생성하게 되며, carbon radical은 다시 peroxyl radical을 생성하여 여러 형태의 생물학적 분자와 결합반응을 일으켜 생체막 구조를 붕괴시키는 것으로 알려져 있다2®. 본 실험에서는 SD계 횐쥐에 매일 50 mg/kg의 AAPH를 복강에 투여하여 실험적 급성 산 화증을 유도한 뒤, 실험동물의 간세포를 분리하여 紫根 전탕액 및 전탕액의 분획물을 처리한 후, 항산화 효과를 관찰하였다.
- 분 획별로 얻은 시료에 대한 세포독성을 확인하고자, 흰쥐의 간세포배양액에 紫根 전탕액 및 전탕액의 분획물을 처리한 후.세포의 증식을 [3H]-thymidine의 uptake 정도로 확인하였다.
- 산화적 스트레스를 받은 실험동물의 간세포에 紫 根의 전탕액 및 전탕액의 여러 분획물을 분주하고 3 일간 배양후 얻은 세포 배양액에서 glutathione 함량을 측정하였다. 대조군에 비해 약물 처리를 한 모든 세포군에서 glutathione 함량이 증가하였으나 통계적 유의성은 나타나지 않았다(Fig.
- 산화적 스트레스를 받은 실험동물의 간세포에 紫 根의 전탕액 및 전탕액의 여러 분획물을 처리한 후세포 배양액에서 나타나는 MDA의 함량 변화를 확인 하였다. 대조군에 비해 n-hexane 군 (pCO.
- 산화적 스트레스를 받은 실험동물의 간세포에 紫 根의 전탕액 및 전탕액의 여러 분획물을 처리한 후세포 배양액에서 나타나는 no의 함량 변화를 확인하였다. 대조군에 비해 약물 처리를 한 모든 세포군에서 NO의 함량이 유의하게(p<0.
- 산화적 스트레스를 받은 실험동물의 간세포에 紫 根의 전탕액 및 전탕액의 여러분 획물을 분주한 후 3일간 배양하여 얻은 세포배양액에서 SOD 활성도를 측정하였다. 대조군에 비해 약물 처리를 한 모든 세포에서 SOD 활성도가 유의하게 (p<0.
- 분획물을 처리한 후.세포의 증식을 [3H]-thymidine의 uptake 정도로 확인하였다. 대조군에 비해서 n-hexane 분획과 물 분획물을 처리한 세포에서 증식이 유의하게 (p<Q05) 증가하였다(Fig.
- 전탕액 분말 20g에 증류수 400ml를 넣고 극성이 다른 여러 가지 용매(n-hexane, ethyl ether, ethyl acetate, n-butariol)를 이용하여 단계적으로 분획하였다. 얻어진 분획 생성물享은 감압증류 장치를 이용하여 용매를 완전히 제거한 후 실험에 사용하였다.
- 조직 내 NO함량은 Nitric oxide assay kit (Oxford Biomedical Research. US A) 을 이용하어 450nm에서 흡광도를 측정해서 결과를 얻었다.
- 조직 내 glutathione 함량은 kit (Dojindo, Japan) 를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정해서 결과를 얻었다.
- 한국에서 紫根의 기원식물로 사용되고 있는 紫根 을 대상으로 산화동물모델 흰 쥐의 간세포를 이용한 세포독성 및 항산화 효능실험을 통하여 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
대상 데이터
- 6 주령 수컷의 SD계 흰쥐의 간 조직을 사용하였다. Ethyl ether를 이용하여 실험동물을 마취시킨 후, 대동맥 혈관에 HBSS(Ca2+, Mg2+ free)를 투여하며 복부 쪽 혈관을 절단시켜 동물의 혈액을 모두 배출시켰다.
- Ethyl alcohol, Methyl alcohol, n-butanol, Ethyl ether, Ethyl acetate는 Samchun Chemical (Korea) 사 제품을 사용하였으며, DPPH(2, 2-diphenyl-l-pic rylhydrazyl), TBA (2-thiobarbituric acid), D-PBS (Dulbecco's phosphate buffered saline), Sodium phosphate dibasic, Sodium phosphate monobasic, Acetic acid, Sulfanilamide, H2SO4, Potassium phosphate, Phosphoric acid는 Sigma (USA) 사 제품을, Fetal bovine serum (FBS)는 L%an (USA) 사제품을, SOD (superoxide dismutase) assay kit, GSH (glutathione) assay kit는 Dojindo (Japan) 사제품을, AAPH[2, 2-azobis(2-aminopropane)hydrochl ori리는 Wako (Japan) 사 제품을, Catalase assay kit, Nitric oxide assay kit, Lipid peroxidation assay kit 는 Oxford Bioir^dical Research (USA)사 제품을 사용하였고, 기타일반 시약은 특급시약을 사용하였다.
- 동물은 6주령의 수컷 Sprague-Dawley계 흰쥐를 (주)대한 바이오링크로부터 공급받아 실험 당일까지 고형사료(抗生劑 無添加, 삼양사료)와 물을 충분히 공급하고, 실온 22±2C를 유지하여 1주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 기기는 Pulverizer (Rong tsong, Taiwan), Rotary evaporator (Eyela, Japan), Air compressor (Tamiya, Japan), Homogenizer (OMNi, USA), Research microscope (Becton dickin son, USA), Centrifuge (Hanil, Korea), Fume hood (Hanil, Korea), Clean bench (Jeio tech, Korea), Bio -freezer (Sanyo, Japan), Spectrophotometer (Shima dzu, Japan), ELISA reader (TECAN, Austria), Ice-maker (Vision Scientific Co, Korea), LC-10AD (Shimadzu, Japan), Electric chemical balance (MCI, Germany) 등이다.
- 실험에 사용된 紫根(Lithospemi Radix; LR)은 경북 군위군 고로면에서 2005년도에 재배수확한 것을 동년 12월에 구입하여 기원의 진위와 품질의 우열을 경원대학교 한의과대학 본초학교실에서 감정하였 으며, 모든 약재는 초음파 세척기를 이용해 불순물을 씻어내고 건조 후 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻은 결과에 대해서는 means 土 S.E 로 나타내었으며, 통계학적 분석은 t-test와 Anova multi t-test(JAVA, Bonferroni Ver 1.1)를 실시하여 p<0.05 일 때 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
성능/효과
- 2, 紫根 전탕액 및 전탕액의 분획물은 산화 동물모델 흰 쥐 간세포의 SOD 활성도를 유의하게(p<0.01) 증가시 켰다.
- 3. 紫根 전탕액 및 전탕액의 분획물은 산화 동물모델 흰 쥐 간세포의 glutathione 함량에 유의한 변화를 주지 않았다.
- 4. 紫根 전탕액 및 전탕액의 분획물은 산화 동물모델 흰 쥐 간세포의 Catalase 농도에 유의한 변화를 주지 않았다.
- 5, 紫根 전탕액 및 전탕액의 분획물은 산화 동물모델 흰 쥐 간세포의 Nitric oxide 함량을 유의하게 (p<0.01) 감소시켰다.
- 6, 紫根 전탕액 및 전탕액의 분획물은 산화 동물모델 흰 쥐 간세포의 MDA 함량을 유의하게(p<0.01) 감소시켰다.
- Catalase는 세포 소기관인 peroxizome 내에서 과산화수소를 물과 산소로 분해하는 효소로, 과산화수소에 의한 산화적 손상으로부터 세포를 보호하는 역할을 한다째 본 실험에서 급성 산화증이 유도된 실험동물의 간세포에 紫根 전탕액 및 전탕액의 분획물을 처리한 후 catalase의 농도를 측정한 결과 유의한 변화는 나타나지 않았다. 紫根 전탕액 및 분획물이 GSH와 Catalase의 농도에 유의한 변화를 주지 않는 실험 결과를 통하여 紫根의 약리 효능이 GSH와 Catalaserk 관여하는 대사과정에는 영향을 미치지 않는 것으로 추정할 수 있다.
- 대조군에 비해 약물 처리를 한 모든 세포군에서 NO의 함량이 유의하게(p<0.01) 감소하였다 (Fig. 5).
- 측정하였다. 대조군에 비해 약물 처리를 한 모든 세포군에서 glutathione 함량이 증가하였으나 통계적 유의성은 나타나지 않았다(Fig. 3).
- 측정하였다. 대조군에 비해 약물 처리를 한 모든 세포에서 SOD 활성도가 유의하게 (p<0.01) 증가하였다(Fig. 2).
- 세포의 증식을 [3H]-thymidine의 uptake 정도로 확인하였다. 대조군에 비해서 n-hexane 분획과 물 분획물을 처리한 세포에서 증식이 유의하게 (p<Q05) 증가하였다(Fig. 1).
- 본 실험에서 紫根 전탕액과 전탕액의 각종 분획물의 세포독성을 측정한 결과, 紫草는 n-BuOH 분획물을 제외한 모든 분획물에서 세포 증식을 유도하는 것으로 나타났다.
- 이것은 hydrogen peroxide를 H2O로 환원시켜 산화성 스트레스에 대해 세포를 보호하는 작용이 있다28). 본 실험에서 급성 산화증이 유도된 실험동물의 간세포에 紫根 전탕액 및 전탕액의 분획물을 처리한 후 GSH 의 농도를 측정한 결과 유의한 변화는 나타나지 않았다.
- 그러나 과다 방출된 NO는 조직의 손상을 야기하여 패혈증성 쇼크(septic shock), 류마티스관절염 (rheumatoid arthrtis), 대뇌성빈혈(cerebral ischemia) , 다발성 경화증(multiple sclerosis)과 당뇨병 (diabete s)을 유발하는 것으로 알려져 있다30). 본 실험에서 급성 산화증이 유도된 실험동물의 간세포에 紫根 전탕액 및 전탕액의 분획물을 처리한 후 NO 함량을 측정한 결과, 대조군에 비해 모든 분획물에서 간세포 배양액의 NO 함량이 유의하게 (p<0.01) 감소하였다.
- 가장 널리 연구된 것으로, superoxide radical(O2-)을 과산화수소(H2O2)와 산소(02)로 전환시킴으로써 superoxide의 독성을 제거하는 금속이온 의존성 효소(metalloenzyme)로 알려져 있다”'. 본 실험에서 급성 산화증이 유도된 실험동물의 간세포에 紫根 전탕액 및 전탕액의 분획물을 처리한 후 SOD 활성을 측정한 결과, 대조군에 비해 모든 분획물에서 간세포 배양액의 SOD 활성도가 유의하게 (P<0.01) 증가하였다.
- 측정하게 된다. 본 실험에서, 급성 산 화증이 유도된 실험동물의 간세포에 紫根 전탕액 및 전탕액의 분획물을 처리한 후 MDA 함량을 측정한 결과, 紫根 분획물 모두 대조군에 비하여 MDA 함량을 유의하게(p<0.01) 감소시켰다.
- 산화적 스트레스를 받은 실험동물의 간세포에 紫 根의 전탕액 및 전탕액의 여러 분획물을 처리한 후세포 배양액에서 나타나는 catalase의 농도 변화를 확인 하였으나 통계적 유의성은 없었다(Fig. 4).
후속연구
- 이상의 결과를 통하여 산화동물모델 흰 쥐의 간세포에 대한 紫草의 항산화 효과가 있음을 알 수 있었으며 향후 紫草가 가지고 있는 항산화 효과를 규명하기 위하여 보다 많은 연구가 필요한 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.