송화분, 참나무화분 및 백합화분에 대한 항산화 효능을 DPPH radical 소거능 및 동물조직의 지질산화 억제효능을 이용하여 평가하였다. 각 화분을 ethanol, 50% ethanol 및 물을 이용하여 추출물을 조제한 후 이들에 대한 DPPH radical 소거능을 분석한 결과 50% 소거능을 나타내는 $EC_{50}$ 값은, 송화분의 경우 50% ethanol 추출물(40.0mg/mL)이 가장 낮게 나타났으며 물 추출물(46.8mg/mL), 100% ethanol 추출물(131.2mg/mL) 순 이었다. 참나무화분에서는 50% ethanol 추출물(3.2mg/mL), 100%, ethanol 추출물(4.5mg/mL), 물 추출물(8.3mg/mL) 순이었고 백합화분에서는 100% ethanol 추출물의 $EC_{50}$값이 14.0mg/mL로, 50% ethanol 추출물(24.0mg/mL) 및 물 추출물(18.8mg/mL)에 비해 가장 낮았다. 3 종의 화분에서는 참나무 화분의 DPPH radical 소거능이 우수한 것으로 나타났다. 한편 $ascorbate-Fe^{3+}-EDTA$에 의해 유도되는 뇌조직에서의 지질산화도는 송화분, 참나무화분, 백합화분 추출물에 의해 모두 농도 의존적으로 억제되었으며 신장에서의 지질산화도 억제되었다. 그리고 이 중에서 송화분보다는 참나무와 백합화분의 효능이 우수한 것으로 나타났다. 화분 추출물에 대한 총 polyphenol의 함량을 분석한 결과 참나무화분$(32.5{\pm}2.9{\mu}g/mg\;pollen)$이 백합화분$(25.9{\pm}1.4{\mu}g/mg\;pollen)$이나 송화분$(9.3{\pm}0.7{\mu}g/mg\;pollen)$보다 높게 나타났다.
송화분, 참나무화분 및 백합화분에 대한 항산화 효능을 DPPH radical 소거능 및 동물조직의 지질산화 억제효능을 이용하여 평가하였다. 각 화분을 ethanol, 50% ethanol 및 물을 이용하여 추출물을 조제한 후 이들에 대한 DPPH radical 소거능을 분석한 결과 50% 소거능을 나타내는 $EC_{50}$ 값은, 송화분의 경우 50% ethanol 추출물(40.0mg/mL)이 가장 낮게 나타났으며 물 추출물(46.8mg/mL), 100% ethanol 추출물(131.2mg/mL) 순 이었다. 참나무화분에서는 50% ethanol 추출물(3.2mg/mL), 100%, ethanol 추출물(4.5mg/mL), 물 추출물(8.3mg/mL) 순이었고 백합화분에서는 100% ethanol 추출물의 $EC_{50}$값이 14.0mg/mL로, 50% ethanol 추출물(24.0mg/mL) 및 물 추출물(18.8mg/mL)에 비해 가장 낮았다. 3 종의 화분에서는 참나무 화분의 DPPH radical 소거능이 우수한 것으로 나타났다. 한편 $ascorbate-Fe^{3+}-EDTA$에 의해 유도되는 뇌조직에서의 지질산화도는 송화분, 참나무화분, 백합화분 추출물에 의해 모두 농도 의존적으로 억제되었으며 신장에서의 지질산화도 억제되었다. 그리고 이 중에서 송화분보다는 참나무와 백합화분의 효능이 우수한 것으로 나타났다. 화분 추출물에 대한 총 polyphenol의 함량을 분석한 결과 참나무화분$(32.5{\pm}2.9{\mu}g/mg\;pollen)$이 백합화분$(25.9{\pm}1.4{\mu}g/mg\;pollen)$이나 송화분$(9.3{\pm}0.7{\mu}g/mg\;pollen)$보다 높게 나타났다.
Antioxidative activities of pine, oak, and lily pollen extracts were evaluated based on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical-scavenging ability and inhibition of lipid peroxidation in animal tissues. Each pollen was extracted with 50% ethanol, 100% ethanol or water. DPPH radical-scavenging c...
Antioxidative activities of pine, oak, and lily pollen extracts were evaluated based on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical-scavenging ability and inhibition of lipid peroxidation in animal tissues. Each pollen was extracted with 50% ethanol, 100% ethanol or water. DPPH radical-scavenging capacity of 50% ethanol extract ($EC_{50}$ 40.0 mg/mL) of pine pollen was higher than those of water (46.8 mg/mL) and 100% ethanol (131.2 mg/mL) extracts of pollen. Fifty percent ethanol (3,2 mg/mL) was also better than 100% ethanol (4.5 mg/mL) and water (8.3 mg/mL) for extraction of oak pollen. For preparation of lily pollen extracts, 100% ethanol was most effective (14.0 mg/mL), followed by water (18.8 mg/mL) and 50% ethanol (24.0 mg/mL). Oak pollen showed higher DPPH radical-scavenging activity than others. Lipid peroxidation in rat brain homogenate induced by ascorbate-Fe3+-EDTA and rat kidney homogenate were inhibited by water extracts of all pollens in dose-dependent manner. Extracts of oak and lily pollen showed higher lipid peroxidation inhibition than pine pollen extract. Polyphenol content was highest in oak pollen extract $(32.5{\pm}0.7\;{\mu}g/mg\;pollen)$, followed by lily extract $(25.9{\pm}1.4\;{\mu}g/mg\;pollen)$ and pine extract $(9.3{\pm}0.7\;{\mu}g/mg\;pollen)$.
Antioxidative activities of pine, oak, and lily pollen extracts were evaluated based on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical-scavenging ability and inhibition of lipid peroxidation in animal tissues. Each pollen was extracted with 50% ethanol, 100% ethanol or water. DPPH radical-scavenging capacity of 50% ethanol extract ($EC_{50}$ 40.0 mg/mL) of pine pollen was higher than those of water (46.8 mg/mL) and 100% ethanol (131.2 mg/mL) extracts of pollen. Fifty percent ethanol (3,2 mg/mL) was also better than 100% ethanol (4.5 mg/mL) and water (8.3 mg/mL) for extraction of oak pollen. For preparation of lily pollen extracts, 100% ethanol was most effective (14.0 mg/mL), followed by water (18.8 mg/mL) and 50% ethanol (24.0 mg/mL). Oak pollen showed higher DPPH radical-scavenging activity than others. Lipid peroxidation in rat brain homogenate induced by ascorbate-Fe3+-EDTA and rat kidney homogenate were inhibited by water extracts of all pollens in dose-dependent manner. Extracts of oak and lily pollen showed higher lipid peroxidation inhibition than pine pollen extract. Polyphenol content was highest in oak pollen extract $(32.5{\pm}0.7\;{\mu}g/mg\;pollen)$, followed by lily extract $(25.9{\pm}1.4\;{\mu}g/mg\;pollen)$ and pine extract $(9.3{\pm}0.7\;{\mu}g/mg\;pollen)$.
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문제 정의
,onoid/phenol 함량 감소는 없이 항산화능이 감소한다고 보고하여 화분의 항 산화능에는 polyphenol 이외의 다른 성분이 관여하고 있음을 추 정한 바 있다. 이에 본 연구에서 참나무화분과 백합화분이 polyphenol 함량에서 차이가 있음에도 불구하고 지질에 대한 항 산화능이 유사한 이유도, 두 화분 간에 polyphenol 종류의 차 이 및 기타 다른 항산화 성분의 존재 등과 관련이 있으리라 판 단되었다.
이에 본 연구에서는 우리나라에서 그 수량이 많은 소나무 및 참나무 유래 화분, 그리고 초본류로서 화분의 생산이 많은 백합화분에서의 항산화 물질 추출 조건, l, l-diphenyl-2-picrylhy- drazyl(DPPH) 및 동물조직을 이용한 항산화 효능 평가, 그리고 polyphenol 함량분석을 수행하여 기능성 식품소재로서의 활용 가능성을 조사하였다.
Kroyer 등(가은 DPPH radical 소거능이 우수한 ethanol 추출물에서 polyphenol 함량도 가장 높다고 보고하였다. 이에 본 연구에서도 각 화분 추출물의 항산화 효능과 polyphenol 함량과의 상관성을 조사하기 위해 화분 추출물에서 총 polyphenol 함량을 분석하였다. 그 결과 Table 1과 같이 DPPH radical소거능 및 뇌, 신장 조직에 대한 항산화 효과가 가장 낮았던 송화분 추출물에서 polyphenol 함량이 가장 적게 나타났으며, radical 소거능 및 지질에 대한 항산화 효능이 높았던 참나무화 분과 백합화분에서 함량이 높게 나타났고, 특히 참나무 화분에서 함량이 가장 높았으며 DPPH radical 소거능과 polyphenol의함량이 잘 일치하였다.
제안 방법
DPPH radical 소거능 분석(16)을 위해 0.4mM의 1, 1-diphenyl- 2-piciylhydrazyl(DPPH) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 용액 0.8 mg] 2-3 mL의 ethanol을 가하고 10초 동안 강 하게 진탕한 후 525 nm에서의 흡광도 값이 0.95-0.99가 되도록 준비 하였다. 이 용액 에 다양한 농도의 화분 추출물 0.
DPPH radical 소거능 외에 실지 생체조직에서 일어나는 산 화를 방지하는 효능을 분석하기 위하여 perfusion 시킨 흰쥐의 뇌 조직을 이용하여 화분 추출물 첨가 시, 활성산소에 의해 유 도된 지질산화를 억제하는 정도를 평가하였다. 본 실험을 위한 화분 추출물은 물로 추출한 시료를 이용하였는데, 이는 물 주 출물이 일반적으로 추출 수율이 높은 점(8), 생체조직 지질산 화에 대한 ethanol의 촉진작용, 그리고 향후 기능성 음료 형태 등으로의 가공 편의성, 또한 실지 DPPH radical 소거능 분석에서 물 추출물이 다른 용매 추출물에 비해 효능이 크게 낮지 않 았던 점 등을 고려하여 우선적으로 효능을 평가하였다.
4M의 methanesulfonic acid 150μL를 가한 다음 재교반하였다. 각 시험관 을 cork cap으로 막은 후 45℃의 shaking water bath에서 40분간 반응시킨 다음 꺼내 얼음 속에서 2분간 냉각시켜 586nm에서 흡광도의 변화를 조사하였다. 발색 물질은 지질산화의 산물인 malondialdehyde(MDA)와 4-hydroxyalkenal(4-HDA)로서 조 직 homogenate의 지질산화도는 nmol(MDA+4-HDA)/mg protein 으로 나타내었으며 표준물질로 10mM의 1, 1, 3, 3-tetramethoxypro-pane을 사용하였다.
추출용매로는 100% ethanol, 50% ethanol, 물을 사용하였다. 각 추출물을 9, 000 rpm에서 10 분 동안 원심분리 (HM-15-3, Hanil Ind. Co., Korea)시켜 얻은상등액을 401에서 감압농축시킨 다음 각 추출용매를 이용하여 300 mg/mL 화분 추출물을 조제하였다.
DPPH radical 소거능 외에 실지 생체조직에서 일어나는 산 화를 방지하는 효능을 분석하기 위하여 perfusion 시킨 흰쥐의 뇌 조직을 이용하여 화분 추출물 첨가 시, 활성산소에 의해 유 도된 지질산화를 억제하는 정도를 평가하였다. 본 실험을 위한 화분 추출물은 물로 추출한 시료를 이용하였는데, 이는 물 주 출물이 일반적으로 추출 수율이 높은 점(8), 생체조직 지질산 화에 대한 ethanol의 촉진작용, 그리고 향후 기능성 음료 형태 등으로의 가공 편의성, 또한 실지 DPPH radical 소거능 분석에서 물 추출물이 다른 용매 추출물에 비해 효능이 크게 낮지 않 았던 점 등을 고려하여 우선적으로 효능을 평가하였다.
1 mL를 첨가한 후 37℃에서 1시간 반응시켜 조직의 산화를 유도하였다(23). 산화가 유도된 조직 homogenate 는 10, 000 Xg에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 지 질산화의 분석에 이용하였다.
송화분, 참나무화분 및 백합화분의 항산화 효능을 분석하기위해서 물 추출물, 50% ethanol, 100% ethanol 추출물을 농도 별로 조제한 다음 이들의 DPPH radical 소거능을 비교하였다. 그 결과 송화분의 경우 Fig.
화분 추출물 대신 ethanol을 사용한 처리구의 흡광도를 대조구로 하였으며 화분추출물 처 리구의 DPPH radical 소거능이 50%될 때의 화분 추출물 양을 EC, 。으로 정하였다. 실험은 3회 반복 실험하였으며, 화분추출물 과의 효능비교를 위해 ascorbic acid를 양성 대조구로 사용하였다.
화분 주줄물에 존재하는 polyphenol 함량은 gallic acid를 표 준물질로 사용하여 Folin-Ciocalteau 법(26)으로 분석하였다. 즉, 0.5 mL 화분 추출물에 0.2 N의 Folin-Ciocalteau phenol 시약 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 0.5 mL 및 포화 N&CQ 용액 0.5 mL를 혼합한 후 25℃에서 1시간 방치 후 765 nm에서의 흡광도를 분석하였다.
발색 물질은 지질산화의 산물인 malondialdehyde(MDA)와 4-hydroxyalkenal(4-HDA)로서 조 직 homogenate의 지질산화도는 nmol(MDA+4-HDA)/mg protein 으로 나타내었으며 표준물질로 10mM의 1, 1, 3, 3-tetramethoxypro-pane을 사용하였다. 한편, 화분 추출물의 산화억제 효능 평가를 위해서는 완충용액 대신 동량의 화분 추출물을 사용하였다.
대상 데이터
각 시험관 을 cork cap으로 막은 후 45℃의 shaking water bath에서 40분간 반응시킨 다음 꺼내 얼음 속에서 2분간 냉각시켜 586nm에서 흡광도의 변화를 조사하였다. 발색 물질은 지질산화의 산물인 malondialdehyde(MDA)와 4-hydroxyalkenal(4-HDA)로서 조 직 homogenate의 지질산화도는 nmol(MDA+4-HDA)/mg protein 으로 나타내었으며 표준물질로 10mM의 1, 1, 3, 3-tetramethoxypro-pane을 사용하였다. 한편, 화분 추출물의 산화억제 효능 평가를 위해서는 완충용액 대신 동량의 화분 추출물을 사용하였다.
실험에 사용된 송화분densiflora S.et Z) 및 참나무화 분mongolica Fischer)은 2004년 5월 중순 대구가톨릭 대학교 인근 야산에서 채취한 것이었고, 백합화분(Lilium longi- florum Thunb)은 직접 재배한 꽃으로부터 채취한 후 -7(FC에서 실험 전까지 보관하였다. 화분 추출물의 제조를 위해서, 막자 사발에서 동결 화분 0.
6 g을 2분간 마쇄 한 후 추출용매 20 mL 를 첨가하여 1분간 더 마쇄하였다. 추출용매로는 100% ethanol, 50% ethanol, 물을 사용하였다. 각 추출물을 9, 000 rpm에서 10 분 동안 원심분리 (HM-15-3, Hanil Ind.
Louis, MO, USA)을 혼합하여 60℃에서 30분간 반응시킨 다음 586 nm에서의 흡광도를 분석하였다. 표준 물질로는 bovine serum albumin을 사용하였다.
이론/모형
상등액의 단백질함량은 bicinchoninic acid(BCA)법(25)을 이용하여 분석 하였는데 , 상등액 50에 1 mL BCA 용액 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 혼합하여 60℃에서 30분간 반응시킨 다음 586 nm에서의 흡광도를 분석하였다. 표준 물질로는 bovine serum albumin을 사용하였다.
화분 주줄물에 존재하는 polyphenol 함량은 gallic acid를 표 준물질로 사용하여 Folin-Ciocalteau 법(26)으로 분석하였다. 즉, 0.
성능/효과
또한 뇌조직 이외에 신장과 간조직을 이용한 화분 추출물의 산화 억제 효과를 분석하기 위하여 두조직에서도 ascorbate-Fe"- EDTA를 이용해 산화를 유도한 결과 신장에서는 지질산화가 유 의적으로 증가하였다(Fig. 6). 그러나 지질산화도는 뇌조직에서 보다는 높지 않았는데 이는 뇌조직이 다른 조직에 비해 산화 가 가능한 지질 불포화도가 높고 항산화 효소계가 적은 이유로 판단된다.
이에 본 연구에서도 각 화분 추출물의 항산화 효능과 polyphenol 함량과의 상관성을 조사하기 위해 화분 추출물에서 총 polyphenol 함량을 분석하였다. 그 결과 Table 1과 같이 DPPH radical소거능 및 뇌, 신장 조직에 대한 항산화 효과가 가장 낮았던 송화분 추출물에서 polyphenol 함량이 가장 적게 나타났으며, radical 소거능 및 지질에 대한 항산화 효능이 높았던 참나무화 분과 백합화분에서 함량이 높게 나타났고, 특히 참나무 화분에서 함량이 가장 높았으며 DPPH radical 소거능과 polyphenol의함량이 잘 일치하였다.
송화분, 참나무화분 및 백합화분의 항산화 효능을 분석하기위해서 물 추출물, 50% ethanol, 100% ethanol 추출물을 농도 별로 조제한 다음 이들의 DPPH radical 소거능을 비교하였다. 그 결과 송화분의 경우 Fig. 1에 나타난 바와 같이 모든 추출 물에서 농도가 증가함에 따라 소거능이 증가함을 알 수 있었다. 특히, 각 추출물 별로 50%의 DPPH radical 소거능을 보이는 농도(EG。)를 구하기 위해 50% 효능 근처에서의 회귀선을 이용한 결과, 송화분은 50% ethanol 추출물에서 EC50°] 40.
그러나, 백합화분(Fig. 3)에서는 앞의 두 화분과 달리 100%ethanol 추출물의 EC”값이 14.0 mg/mL로, 50% ethanol 추출물 (24.0 mg/mL) 및 물 추출물(18.8 mg/mL)에 비해 가장 낮아 100% ethanol이 가장 좋은 추출용매임을 알 수 있었다. 이러한 결과는 꿀벌화분의 ethanol, methanol/물, 물 추출물 조제시 추 출수율에서 물이나 methanol/물이 우수하였으나, DPPH radical 소거능은 ethanol 추출물에서 가장 우수하였다고 보고한 Kroyer 등(7)의 결과와 유사한 것이다.
8 mg/mL이었다. 그러므로 송화분을 50% ethanol 용매로 추출하는 것이 DPPH radical 소거능을 지닌 항산화 물질의 추출에 가장 효과적이었음을 알 수 있었다.
5(MDA+4-HDA) nmol/mg protein으로 증가하였다. 그리고 이러한 조건에서 각 화분 추출물을 농도별로 첨가한 결과, 송화분, 참나무화분, 백 합화분 모두가 농도 의존적으로 뇌조직의 지질산화를 감소시 켰으며 송화분보다는 참나무와 백합화분의 효능이 우수하였다.
061 mg/mL의 EQ。을 보였다. 이를 기준으로 송화분 및 참나무화분의 50% ethanol 추출물을 평가해 보면, 두 화분은 각각 ascorbic acid의 1.5X10” 및 19.1 >"배 정도의 효능을 나타냈으며, 백합화분의 ethanol 추출물은 4.4><1(P배의 효과를 나타내어 나타나 3종의 화분 추출물 중에서는 참나무 화분이 가장 우수한 DPPH radical 소거능을 지닌 것으로 평가되었다.
이상의 결과로부터 동물조직에 대한 화분 추출물의 항산화 효능은 DPPH 라디칼 소거능과 유사하게 송화분보다 참나무화 분과 백합화분이 높은 점을 알 수 있었다.
1에 나타난 바와 같이 모든 추출 물에서 농도가 증가함에 따라 소거능이 증가함을 알 수 있었다. 특히, 각 추출물 별로 50%의 DPPH radical 소거능을 보이는 농도(EG。)를 구하기 위해 50% 효능 근처에서의 회귀선을 이용한 결과, 송화분은 50% ethanol 추출물에서 EC50°] 40.0 mg/mL로 가장 낮게 나타났으며 100% ethanol 추출물은 131.2 mg/mL, 물 추출물은 46.8 mg/mL이었다. 그러므로 송화분을 50% ethanol 용매로 추출하는 것이 DPPH radical 소거능을 지닌 항산화 물질의 추출에 가장 효과적이었음을 알 수 있었다.
3 mg/mL보다 낮은값을 보였다. 특히, 송화분 추출물과 비교 시 모든 추출조건에서 DPPH radical 소거능이 우수하였으며 가장 효능이 높았던 50% ethanol 추출물을 비교해보면 송화분보다 약 12배 이상 효과가 높은 것으로 나타났다.
간조직의 경우에는 산화가 유도되지 않았는데 이는 간 조직에 다량의 항산화 효소와 저분자 물질이 존재하기 때문으로 추정된다. 한편, 신장조직에 10mg/mL 화분 추출물 처리 시 뇌조직에서와 유사하게 송화분보다 참나무와 백합화 분 추출물의 효능이 높게 나타났다. 간조직에서는 산화유도가 되지 않아 추출물의 효능평가는 불가능하였다.
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