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문제 정의
- 따라서 본 연구는 제주, 전남 고흥, 경북 울릉도에 자생하는 식물자원 40종을 대상으로 고압용매 추출하여 통합적 항산화 능력과 항균 활성을 검증하여, 식품산업에 응용할 천연소재를 탐색하는데 그 목적이 있다.
제안 방법
- 1단계는 R① 1500 μL과 R② 1000 μL이 들어있는 sampling tube에 R③-WS 25 μL을 가하여 blank를 측정하였다.
- 1단계는 R① 2300 μL과 R② 200 μL이 들어있는 sampling tube에 R③-WS 25 μL을 가하여 blank를 측정하였다.
- 3단계 시료분석은 검량선 작성 시 R④-WS 대신 희석된 추출물 10 μL을 가하여 3회 반복 측정하였다.
- 490 μL R①과 10 μL H2SO4를 R④가 들어 있는 바이알에 가한 후 20～3초간 vortex시켜 혼합하여 R④ stock solution을 제조하였고, 이 용액을 R①로 1:100으로 희석하여 R④ working solution(R④-WS)을 제조하였다.
- 2 mL(107～108 CFU/mL)를 고체배지 표면에 취하여 spreader로 균일하게 도말한 다음 각각의 온도에서 24～48시간 배양한 후, 미생물의 생육이 관찰되지 않은 추출물의 최소농도를 확인하였다. 고체배지는 추출물을 진공회전증발농축기로 용매를 완전히 제거한 후 잔사를 5% DMSO에 용해하여 최종 농도가 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000 ppm이 되도록 조제한 추출물 5 mL를 배지 15 mL와 혼합하여 제조하였다.
- 추출물의 최소저해농도는 NCCLS의 지침(19)에 따라 agar dilution method로 측정하였다. 미리 배양한 균 배양액 0.2 mL(107～108 CFU/mL)를 고체배지 표면에 취하여 spreader로 균일하게 도말한 다음 각각의 온도에서 24～48시간 배양한 후, 미생물의 생육이 관찰되지 않은 추출물의 최소농도를 확인하였다. 고체배지는 추출물을 진공회전증발농축기로 용매를 완전히 제거한 후 잔사를 5% DMSO에 용해하여 최종 농도가 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000 ppm이 되도록 조제한 추출물 5 mL를 배지 15 mL와 혼합하여 제조하였다.
- 식물 추출물(10,000 ppm)의 항균성을 측정하기 위하여 미리 배양한 균 배양액 0.2 mL(107∼108 CFU/mL)를 각각의 고체배지 표면에 취하여 spreader로 균일하게 도말하였다.
- 여기에 멸균된 paper disc(직경 8 mm, Advantec, Toyo Roshi Co., Tokyo, Japan)를 올려놓아 밀착시킨 후, 추출물 20 μL을 흡수시킨 다음 각 균주의 배양 조건에서 배양하여 생육 저지환(clear zone)의 크기(mm)를 측정하였다.
- 제주, 전남 고흥, 경북 울릉도에서 채취한 자생식물 40종을 대상으로 고압용매 추출하여 총 페놀성 화합물 함량을 측정하였다(Table 3). 총 페놀성 화합물 함량은 짚신나물이 174.
- 이 용액 10 μL에는 1 nmol의 Trolox(표준용액)이 함유되어 있다. 지용성 통합적 항산화 능력 또한 3단계로 측정하였다. 1단계는 R① 2300 μL과 R② 200 μL이 들어있는 sampling tube에 R③-WS 25 μL을 가하여 blank를 측정하였다.
- 추출방법은 Kim 등(12)이 최적화한 고압용매 추출조건에 따라 행하였다. 추출 수율은 추출물 1 mL를 취하여 105℃에서 항량이 될 때까지 건조하여 증발잔사의 양을 구한 후 건조 시료의 무게에 대한 가용성 고형분의 무게 비율로 나타내었다.
- 항산화 활성은 Photochemiluminescence system(Berlin, Germany)으로 측정하였다(15). ACW(antioxidative capacity of water-soluble substances)와 ACL(antioxidative capacity of lipid-soluble substances) kits는 Analytik Jena AG(Jena, Germany)에서 구입하여 사용하였다.
대상 데이터
- 500 μL R①을 Trolox(R④)이 들어 있는 바이알에 가한 후 혼합하여 R④ stock solution을 제조하였고, 이 용액을 R①로 1:100으로 희석하여 R④-WS을 제조하였다.
- 항산화 활성은 Photochemiluminescence system(Berlin, Germany)으로 측정하였다(15). ACW(antioxidative capacity of water-soluble substances)와 ACL(antioxidative capacity of lipid-soluble substances) kits는 Analytik Jena AG(Jena, Germany)에서 구입하여 사용하였다. ACW kit에서 Reagent ①, ②, ③, ④는 각각 water, reaction buffer, luminol, ascorbic acid 용액이며, ACL kit에서 Reagent ①, ②, ③, ④는 각각 methanol, reaction buffer, luminol, trolox 용액이다.
- 본 실험에 사용한 고압용매 추출장치(SFX 3560, Isco Inc., Lincoln, NE, USA)는 syringe pump, pump controller, sample cartridge가 장착된 고압 chamber, 유량 조절을 위한 restrictor 그리고 collection vial로 구성되어 있다. 추출시료는 추출용매의 흐름을 용이하게 하기 위하여 sample cartridge의 윗부분으로부터 sea sand(15∼20 mesh, Junsei Chemical Co.
- 본 실험에 사용한 자생식물은 Table 1과 같으며, 제주(16종), 전남 고흥(11종), 경북 울릉도(13종)에서 40종을 채취하여 세척․음건한 후 30 mesh를 통과하도록 분쇄기(Ika Work, Inc., Wilmington, NC, USA)로 분쇄하여 -20℃ 냉동고에 보관하면서 추출용 재료로 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 균주는 양식넙치 질병 세균으로서 한국유전자은행인 KCTC(Korean Collection For Type Cul ture)와 한국미생물보존센터인 KCCM(Korean Culture Center of Microorganisms)에서 그람 양성균 2종(Streptococcus iniae KCTC 3657, Streptococcus parauberis KCTC 3651)과 그람 음성균 2종(Edwardsiella tarda KCTC 12267, Vibrio ordalii KCCM 41669)을 분양 받아 사용하였으며, 사용배지는 BHIA(1.5% NaCl)이었으며, 각 균주의 배양조건은 Table 2와 같으며 3회 계대 배양하여 사용하였다.
- 즉, Reagent(R)③에 R②를 750 μL 가하여 R③ working solution(R③-WS)을 제조하였다.
- 즉, R③에 R②를 750 μL 가하여 R③-WS을 제조하였다.
이론/모형
- 국내 자생식물 40종 추출물에 대하여 양식 넙치 질병 세균인 그람양성균 2종(S. parauberis, S. iniae)과 그람음성균 2종(E. tarda, V. ordalii)에 대한 항균활성을 paper disk법으로 측정하였다. 그 결과 식물 40종 추출물 중 9종 즉, 바늘꽃, 독활, 짚신나물, 물참나무, 나도송이풀, 세잎이질풀, 서어나무, 섬기린초, 섬바디 만이 4종의 양식 넙치 질병 세균에 대하여 항균활성을 나타내었다(Table 5).
- 총 페놀 함량은 Peschel 등(17)의 방법에 의하여 측정하였다. 즉, 고압용매 추출물 0.
- 추출물의 최소저해농도는 NCCLS의 지침(19)에 따라 agar dilution method로 측정하였다. 미리 배양한 균 배양액 0.
- , Tokyo, Japan)로 여과하여 -20℃에서 저장하면서 분석용 시료로 사용하였다. 추출방법은 Kim 등(12)이 최적화한 고압용매 추출조건에 따라 행하였다. 추출 수율은 추출물 1 mL를 취하여 105℃에서 항량이 될 때까지 건조하여 증발잔사의 양을 구한 후 건조 시료의 무게에 대한 가용성 고형분의 무게 비율로 나타내었다.
- 항균활성은 National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS)의 지침에 준하여 disk diffusion method로 측정하였다(18). 식물 추출물(10,000 ppm)의 항균성을 측정하기 위하여 미리 배양한 균 배양액 0.
성능/효과
- iniae에 대해서는 짚신나물과 섬바디가 가장 높은 활성을 나타내었고, 그 다음으로 독활, 물참나무, 나도송이풀, 세잎이질풀, 서어나무가 비슷한 활성을 나타내었는데, 바늘꽃과 섬기린초는 활성을 나타내지 않았다. E. tarda에 대해서는 바늘꽃, 독활, 물참나무, 세잎이질풀, 서어나무, 섬기린초, 섬바디가 비슷한 항균활성을 나타내었으며 짚신나물과 나도송이풀은 항균활성을 가지고 있지 않았다. V.
- parauberis에 대한 항균활성은 나도송이풀과 섬바디가 가장 높았고, 다음으로 바늘꽃, 독활, 물참나무, 세잎이질풀, 서어나무, 섬기린초는 비슷한 항균활성을 나타내었는데, 짚신나물은 항균활성을 나타내지 않았다. S. iniae에 대해서는 짚신나물과 섬바디가 가장 높은 활성을 나타내었고, 그 다음으로 독활, 물참나무, 나도송이풀, 세잎이질풀, 서어나무가 비슷한 활성을 나타내었는데, 바늘꽃과 섬기린초는 활성을 나타내지 않았다. E.
- S. parauberis에 대한 항균활성은 나도송이풀과 섬바디가 가장 높았고, 다음으로 바늘꽃, 독활, 물참나무, 세잎이질풀, 서어나무, 섬기린초는 비슷한 항균활성을 나타내었는데, 짚신나물은 항균활성을 나타내지 않았다. S.
- tarda에 대해서는 바늘꽃, 독활, 물참나무, 세잎이질풀, 서어나무, 섬기린초, 섬바디가 비슷한 항균활성을 나타내었으며 짚신나물과 나도송이풀은 항균활성을 가지고 있지 않았다. V. ordalii에 대해서는 식물 9종 중 짚신나물 이외에 8종의 추출물에서는 항균활성을 나타내었는데, 그중 세잎이질풀과 서어나무가 가장 높은 항균활성을 나타내었으며, 그 다음으로 바늘꽃, 독활, 물참나무, 나도송이풀, 섬기린초, 섬바디가 비슷한 활성을 나타내었다.
- 제주, 전남 고흥, 경북 울릉도에서 채취한 자생식물 40종을 대상으로 고압용매 추출하여 가용성 고형분의 추출수율을 측정한 결과는 Table 3과 같았다. 고형분의 추출수율은 섬현삼, 괭이눈이 각각 39.7%, 39.0%로 40종 자생식물 중가장 높았고, 넉줄고사리, 섬모싯대, 섬기린초, 모싯대, 꽃며느리밥풀이 각각 34.1%, 32.1%, 31.5%, 30.6%, 30.1%로 높은 추출수율을 나타내었다. 그 외에 마가목, 붉나무, 섬노루귀, 큰까치수염, 개감수, 섬바디, 노루발, 물참나무가 25% 이상을, 나도송이풀, 짚신나물, 서어나무, 자금우, 참싸리, 세잎이 질풀, 산박하, 바디나물, 송악, 왕고들빼기, 노루오줌, 호장근, 가막살이 20% 이상의 추출수율을 나타내었다.
- ordalii)에 대한 항균활성을 paper disk법으로 측정하였다. 그 결과 식물 40종 추출물 중 9종 즉, 바늘꽃, 독활, 짚신나물, 물참나무, 나도송이풀, 세잎이질풀, 서어나무, 섬기린초, 섬바디 만이 4종의 양식 넙치 질병 세균에 대하여 항균활성을 나타내었다(Table 5).
- 2 mg GAE/g로 높은 함량을 나타내었다. 그 외 넉줄고사리, 자금우, 큰까치수염, 마가목, 섬기린초도 각각 96.9, 95.0, 93.2, 92.5, 91.1 mg GAE/g로 높은 함량을 나타내었고, 세잎이질풀, 호장근, 바늘꽃, 참싸리, 노루오줌, 산박하는 각각 82.8, 80.8, 78.7, 76.1, 65.9, 57.0 mg GAE/g 이상을 나타내었다. 그러나 노루발, 이삭여뀌(울릉), 왕호장근, 개감수, 괭이눈, 나도송이풀, 이삭여뀌(제주)는 30 mg GAE/g 정도의 낮은 함량을 나타내었다.
- 1%로 높은 추출수율을 나타내었다. 그 외에 마가목, 붉나무, 섬노루귀, 큰까치수염, 개감수, 섬바디, 노루발, 물참나무가 25% 이상을, 나도송이풀, 짚신나물, 서어나무, 자금우, 참싸리, 세잎이 질풀, 산박하, 바디나물, 송악, 왕고들빼기, 노루오줌, 호장근, 가막살이 20% 이상의 추출수율을 나타내었다.
- 짚신나물, 나도송이풀, 섬바디는 그람양성균에 대하여 항균활성이 높았고, 세잎이질풀과 서어나무가 그람음성균에 대하여 항균활성이 높은 것으로 나타났다. 그람양성균과 그람음성균에 대하여 9종의 자생식물 추출물의 항균활성을 비교해 보았을 때 그람양성균인 S. parauberis, S. iniae에 대한 항균활성이 그람음성균인 E. tarda, V. ordalii보다 높았다.
- 그람음성균인 E. tarda에 대해서는 물참나무, 서어나무, 세잎이질풀이 각각 4,000, 5,000, >5,000 ppm을 나타내었으며, V. ordalii에 대해서는 물참나무, 세잎이질풀, 서어나무 모두 1,000 ppm 이하로 높은 항균활성을 나타내었다.
- 마가목, 서어나무, 물참나무, 세잎이질풀은 수용성과 지용성 통합적 항산화 능력 모두 높았는데, 총 페놀성 화합물 함량도 각각 92.5, 113.3, 116.9, 82.8 mg GAE/g로 높아 이들 식물 추출물인 경우 항산화 능력과 총 페놀 함량 사이에는 서로 상관관계가 있었다. Lee 등(22)과 Ra 등(23)도 총 페놀성 화합물 함량에 비례하여 항산화 활성이 증가한다고 보고 하였다.
- 자생식물 40종의 고압용매 추출물 중 가용성 고형분 함량에 대한 총 페놀성 화합물 함량의 비율이 높은 16종을 선정하여 수용성과 지용성 통합적 항산화 능력을 측정한 결과는 Table 4와 같았다. 수용성 항산화 능력은 마가목이 5.81 mmol ascorbic acid equivalents/g로 가장 높았고, 다음으로 나도송이풀, 붉나무, 물참나무, 서어나무가 각각 3.96, 3.63, 3.63, 3.34 mmol ascorbic acid equivalents/g를 나타내었으며, 호장근, 세잎이질풀, 짚신나물, 노루오줌도 각각 2.87, 2.59, 2.53, 2.37 mmol ascorbic acid equivalents/g를 나타내었다. 지용성 항산화 능력은 서어나무가 8.
- 37 mmol ascorbic acid equivalents/g를 나타내었다. 지용성 항산화 능력은 서어나무가 8.51 mmol Trolox equivalents/g로 가장 높았고, 다음으로 마가목, 세잎이질풀, 물참나무, 바늘꽃, 섬기린초가 각각 6.57, 5.68, 3.85, 3.83, 3.69 mmol Trolox equivalents/g를 나타내었다.
- 짚신나물, 나도송이풀, 섬바디는 그람양성균에 대하여 항균활성이 높았고, 세잎이질풀과 서어나무가 그람음성균에 대하여 항균활성이 높은 것으로 나타났다. 그람양성균과 그람음성균에 대하여 9종의 자생식물 추출물의 항균활성을 비교해 보았을 때 그람양성균인 S.
- 제주, 전남 고흥, 경북 울릉도에서 채취한 자생식물 40종을 대상으로 고압용매 추출하여 총 페놀성 화합물 함량을 측정하였다(Table 3). 총 페놀성 화합물 함량은 짚신나물이 174.4 mg GAE/g로 자생식물 중 가장 높았고, 다음으로 물참나무, 서어나무, 붉나무가 각각 116.9, 113.3, 108.2 mg GAE/g로 높은 함량을 나타내었다. 그 외 넉줄고사리, 자금우, 큰까치수염, 마가목, 섬기린초도 각각 96.
- 특히 물참나무, 세잎이질풀, 서어나무는 총 페놀성 화합물 함량이 각각 116.9, 82.8, 113.3 mg GAE/g로 높았으며, 수용성과 지용성 통합적 항산화 능력도 모두 높았는데, 이들 식물 추출물은 그람양성균과 그람음성균 모두에 대하여 항균활성을 나타내는 것으로 보아, 이들 물질에 함유되어 있는 폴리페놀 성분이 항산화활성은 물론 항균성과도 밀접한 관련이 있을 것으로 추정되었으며, 이들 추출물은 건강한 넙치의 생산에 활용될 수 있을 것이다.
- 한편 총고형분 함량에 대한 총 페놀성 화합물 함량의 비율(% TP/TSS)은 짚신나물이 72.6%로 가장 높았고, 서어나무(47.3%), 물참나무(46.4%), 자금우(40.2%), 바늘꽃(40.1%) 순으로 높은 비율을 나타내었다. 그 외에 호장근(39.
- 항균활성 실험결과 짚신나물은 S. iniae에 대하여 높은 항균활성을 나타내었으며, 독활, 나도송이풀, 섬바디는 S. parauberis과 S. iniae 모두에 대하여, 물참나무, 세잎이질풀, 서어나무는 V. ordalii에 대하여 높은 항균활성을 나타내었으므로, 이들 추출물은 양식넙치의 질병을 예방하기 위한 천연항균제로 활용할 가치가 높을 것으로 추정되었다.
후속연구
- 6 mg GAE/g를 나타내었고, 딱지꽃, 석위, 붉가시나무, 소귀나무, 귀룽나무, 붉나무, 말오줌때 등도 200 mg GAE/g 이상의 높은 함량을 나타내었다고 보고하였는데, 본 연구 결과와 비교하여 볼 때 본 연구에서의 고압용매 추출물은 상압유기용매 추출물보다 총 페놀성 화합물 함량이 비교적 낮은 것으로 나타났다. 일반적으로 고압용매 추출법이 상압유기용매 추출법보다 총 페놀성 화합물 추출수율이 높을 것으로 예상하였으나 낮은 이유로는 시료가 동일하지 않으며 또한 폴리페놀 화합물이 빛, 산소, 온도에 민감하므로 고압용매 처리 시 손실에 의한 것으로 추정되었으나, 차후 동일 시료를 가지고 두 가지 추출방법에 대한 보다 깊은 연구가 필요하다(10,11).
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