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문제 정의
- 본 연구는 화살나무의 줄기와 날개를 열수 추출하여 분자량크기별로 네 분획 (F I, F II, F III, F IV)으로 분리하여 각 분획물의 성분조성을 분석하였고, 이들 각 분획물의 생리활성을 알아보기 위해 DPPH를 이용한 유리 라디칼 소거능과 동물 세포에서 활성산소종 제거능에 대하여 조사하였다.
- 이에 본 연구는 화살나무의 줄기와 날개를 열수 추출하여 분자량 크기별로 분리한 각 분획물의 성분조성을 분석 하였고, 이들 각 분획물의 생리활성을 알아보기 위해 유리 라디칼 소거 능과 동물 세포에서 활성산소종 제거능을 조사하였다.
제안 방법
- 3-A, (Con H2O2)), HQ2를 처리하지 않고 DCFH- DA만 처리한 negative 대조구(Fig. 3-A, (Con DCF))로 하고 negative 대조구의 형광발색정도를 0, positive 대조구의 형광 발색 정도를 100으로 하여 각 분획물 처리구 세포에서 나타내는 형광 발색 강도를 비교하여 나타냈다.
- 4), B 용매는 100% ace-tonitrile로 하여 0.4mL/miri의 유속으로 분석하였으며, 초기 용매 조성은 20% A 용매에서 시작하여 !50분에 A 용매 58%까지 선형구배 조건으로 분석하였다(11). 표준 시료로 2-AB를 표지한 dextran을 같은 조건에서 분석하여, 이의 유지 시간과 glucose unit(GU) 값으로부터 소당류 용출에 대한 GU 곡선식을 얻었다.
- 5°C의 CO2 incubator에서 3일 동안 정상 배양하여 실험에 사용하였다. CHO-kl 세포내에서 화살나무 추출물의 ROS 저해 효과는 Lee 등(15)의 방법을 변형하여 5 p, g/mL apo-transferrin, 1 mg/mL bovine serum albumin, 25 mM Hepes(pH 7.4), 2 mM glutamine, 100 jig/mL strepto- mycin을 포함하고 phenol red가 없는 serum-free medium(SFM) 인 DubelccSs modified Eagle's 배지를 사용하여 측정하였다. 12-well에 round coverslip을 각각 넣고 세포가 100개 정도 되도록 SFM으로 씻어 낸 후 SFM 880㎕와 화살나무 추출물을 각 농도별로 100㎕를 처리하여 37。(3의 CO2 incubator에서 25분간안정화시킨 후, IOjiM HQ?를 10㎕ 넣어 반응시키고, 2분 후에 10㎛ 2.
- Libermann-Burchard 반응을 실시하기 위해 시험관에 무수초산 0.5 mL을 떨어뜨리고 분획물 시료 0.5 mL을 가하여 용해한 후 진한 니gQ ImL을가하여 vortex mixer로 섞었을 때, 적자색으로 정색화되는지를 관찰하였다.
- 각 분획물 0.1 g을 취해 2mL 물에 녹인 후, 20% a-naphthol-ethanol 용액 1-2방울을 가한 후 진한 ASO, 를 시험 관 기벽을 통하여 가할 때 경계면에 적자색환이 나타나는지를 관찰하였다.
- 각 분획물 0.1 g을 취해 5mL의 물에 녹인 후, 10% FeC'-ethanol 용액 1-2 방울을 가할 때 자색 및 청색의 정색반응을 나타내는지 관찰하였다.
- 다른 것으로 판단된다. 각 분획물의 총 분석 시간은 140분이었으며, 머무름 시간 40분 이전에 분리된 피크는 단당류이며, 그 이후에 나오는 피크의 머무름 시간을 추세식에 적용하여 소당체의 GU 값을 계산하였다.
- 다당체 분석은 각 시료에 2-aminobenzamide(2-AB)(Oxfbrd GlycoSciences, Bedford, UK)로 형광 표지하여 SpeedVac(SC 210A Savant Co., USA)에서 건조한다음 NP-HPLC(normal phase high performance liquid chromatography, Waters Co., USA) 로 분석하였다. GlycoSep N column(4.
- 4), 2 mM glutamine, 100 jig/mL strepto- mycin을 포함하고 phenol red가 없는 serum-free medium(SFM) 인 DubelccSs modified Eagle's 배지를 사용하여 측정하였다. 12-well에 round coverslip을 각각 넣고 세포가 100개 정도 되도록 SFM으로 씻어 낸 후 SFM 880㎕와 화살나무 추출물을 각 농도별로 100㎕를 처리하여 37。(3의 CO2 incubator에서 25분간안정화시킨 후, IOjiM HQ?를 10㎕ 넣어 반응시키고, 2분 후에 10㎛ 2.7-dichlorodihydrofluoresce in diacetate(DCFH-DA)를 10 ㎕ 넣은 후 3분 동안 반응시켜 형광 발색시킴으로써 488 nm laser scanning confocal microscope(LSM410, Carl Zeiss Co., Germany)를 이용해 ROS 제거 활성 정도를 관찰하였다. 각 농도별로 화살나무 추출물을 처리한 구와 처리하지 않은 positive 대조구(Fig.
- ig/mL 농도가 되게 처리하여 공초점 현미경으로 관찰했을 때 활성산소종 제거능에 따른 형광 발색 정도를 나타낸 사진이다. 분획물을 처리하지 않은 positive 대조구(Con HQ)에서 HQ?를 처리하지 않는 negative 대조구 (Con DCF>의 형광발색 강도의 차이를 100으로 하여 Fig. 3B에네 분획물을 각 농도별로 처리했을 때 CHO-kl 세포에서 화살나무 분획물이 가지는 활성산소종 제거능의 변화를 나타냈다.
- 분획물 0.1 g을취해 2mL 물에 녹인 후, 5% AgNO3 alcohol용액을 가할 때 혼탁하거나 침전이 생기는지 여부를 관찰하였다.
-
분획물의 정성 분석
분획물에 함유된 특정한 성분을 예비적으로 조사하기 위해일정량의 각 시료에 대하여 유효성분이 어느 분획에 있는지 확인하고자 먼저 천연물 예지 시험법(9)을 이용한 정성 반응을 실시하였다.
- 이용해 다당체를 분석하였다. 이를 위해 먼저 표준물로 2-AB가 표지된 dextran을 분석하여 dextran ladderJS. 추세식을 구한 후, 각 분획물을 분석하여 얻어진 머무름 시간 값을 이 식에 적용해 구하였다.
- 있는 것으로 판단된다. 이에 각 분획물의 구성요소를 더 자세히 조사하기 위해 총당 및 총단백질의 함량과 이들을 조성하고 있는 단당류 및 아미노산 분석을 하였다.
- 1g을 취해 물 2mL에 녹이고, 10% NaOH 1 mL를 가하여 alkali 성으로 한 후, 1% CuSO, 를 1-2방울 가했을 때 .청색에서 적자색으로 변하는지를 관찰하였다.
- 이를 위해 먼저 표준물로 2-AB가 표지된 dextran을 분석하여 dextran ladderJS. 추세식을 구한 후, 각 분획물을 분석하여 얻어진 머무름 시간 값을 이 식에 적용해 구하였다. 각 피크의 GU 값과 소당체 표준 물의 데이터베이스(28)에 나와 있는 GU 값을 비교하여 몇 가 지소 당류를 예측할 수 있었지만, GU값이 상대적인 값이기 때문에 본 실험에서 정확한 소당체 구조를 해석하기에는 한계점이 있었다.
- 4mL/miri의 유속으로 분석하였으며, 초기 용매 조성은 20% A 용매에서 시작하여 !50분에 A 용매 58%까지 선형구배 조건으로 분석하였다(11). 표준 시료로 2-AB를 표지한 dextran을 같은 조건에서 분석하여, 이의 유지 시간과 glucose unit(GU) 값으로부터 소당류 용출에 대한 GU 곡선식을 얻었다.
- 화살나무 분말 시료에 io배의 증류수를 가해 io(rc에서 io 시간 추출한 다음 여과하여 회전 감압농축기 (Eyela N-N-series, Japan)로 농축시켜 화살나무 물 추출물을 제조하였다. 농축 정도는 시료가 paste 상으로 수기 외벽에 붙어 흘러내리지 않을 정도까지 하였으며, 4。(2에 냉장 보관하면서 시료로 사용하였다.
- 화살나무 열수 추출 분획물이 활성산소종 제거능 효과가 있는지 알아보기 위해 CHO-kl 세포에 각 분획물을 농도별로 처리하였다(Fig 3). Fig.
- 화살나무 열수 추출물의 주요 구성성분은 다당체로서 크기와 구조를 알아보고자 각 분획물 시료에 2-AB를 표지하여 NP- HPLC를 이용해 다당체를 분석하였다. 이를 위해 먼저 표준물로 2-AB가 표지된 dextran을 분석하여 dextran ladderJS.
대상 데이터
- CHO-kl (Chinese hamster ovary) 세포를 한국 세포주 은행에서 분양 받아 25 mM Hepes(pH 7.4), 10%(v/v) fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100 |ig/mL streptomycin을 함유한 Dubelcco's modified Eagle's 배지에 CHO-kl 세포를 round coverslip에 분주하고 36.5±0.5°C의 CO2 incubator에서 3일 동안 정상 배양하여 실험에 사용하였다. CHO-kl 세포내에서 화살나무 추출물의 ROS 저해 효과는 Lee 등(15)의 방법을 변형하여 5 p, g/mL apo-transferrin, 1 mg/mL bovine serum albumin, 25 mM Hepes(pH 7.
- 산화적 스트레스의 원인이 되는 유리 라디칼에 대한 소거능은 Aldrich 사에서 구입한 시약 1, 1-diphenyl 2-piciyl-hydrazyl (DPPH)을 이용하여 측정하였다(14).
- 실험에 사용된 화살나무의 줄기와 날개는 2004년 7월에 전북 전주시 재래시장에서 구입하여 먼지 등을 제거하기 위해 물로 수세한 후 60°C 열풍 건조기에서 24시간 건조한 후, 건식분쇄기(CR-581W, Samsung Electrics Co., Korea)로 마쇄하여 표준체 150 mesh(Standard testing sieve, 1TOH Co., Japan)로 통과시킨 균질한 분말시료를 추출용 시료로 사용하였다.
- 표준 당으로 maltose(Sigma Co., USA)를 이용하였다.
- 유리당, 아미노당, 가수분해 구성당은 high-pH anion exchangechromatography with pulsed amperometric detection(HPAEC-PAD)을 이용하여 Kim 등(11)의 방법으로 분석하였다. 표준 당은 Sigma 사에서 구입한 fucose, glucose, galactose, mannose, glucosamine, galactosamine으로 하였다.
이론/모형
- Freeradical scavenging activities of Euonymus alatus extracts treated with different concentrations of ultrafiltered fraction (F I-F Ⅳ) were assayed by DPPH (1, l-diphenyl 2-picryl hydrazyl) method (14). Fraction name: See Table 1.
- 아미노산 조성은 Pico-Tag 아미노산 분석 방법 (13)에 따라 각 분획물의 10mg 정도를 취하여 phenylisothiocyanate(PITC)로 유도 체화시킨 후 HPLC(Mod이 M990, Waters Co., USA)로 분석하였다. 아미노산 표준물질은 amino acid general standard(Sigma Co, .
- 유리당, 아미노당, 가수분해 구성당은 high-pH anion exchangechromatography with pulsed amperometric detection(HPAEC-PAD)을 이용하여 Kim 등(11)의 방법으로 분석하였다. 표준 당은 Sigma 사에서 구입한 fucose, glucose, galactose, mannose, glucosamine, galactosamine으로 하였다.
- 종단백질 함량은 Bradford 법(12)에 의해 BSA(Bovine serum albumin, Sigma Co., USA)을 표준시료로 하여 595nm에서 흡광도를 즉정함으로써 구하였다';
- 총당은 phenol-#법(10)에 의해 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 당으로 maltose(Sigma Co.
성능/효과
- 나타냈다. CHO-kl 동물 세포에서 활성산소종 제거 능을 조사한 결과는, 분획물을 l-100|ig/mL까지 처리한 농도에 비례하여 활성 이 상승되는 것으로 나타났으나 100 ng/mL 이상의 처리농도에서는 거의 변화를 보이지 않았다. 각 분획물별로 F IV이 가장 높은 활성을 보였으며, 그 다음 F HI, F I 이었으며, F II은 가장 낮은 활성을 나타냈다.
- 각 분획물을 처리했을 때 분자량이 10kDa 이상이며 단백질이 비교적 많이 함유된 F IV에서 가장 높은 활성을 보였으며, 그 다음 F III였고, F I이었으며, F II는 가장 낮은 활성을 나타냈다.
- 같다. 네 분획물 모두 진한 탄수화물 정색반응을 보였으며, 환원당 정색반응도 나타났다. 단백질 및 펩타이드 정색반응도 모든 분획물에서 나타났으며, 그 중에서 특히 F IV 분획물에서 상대적으로 강한 반응을 보였다.
- 분획물 F III와 F II의 유리 라디칼 소거능은 거의 비슷한 수준이었다. 네 분획물 중 F I은 가장 낮은 유리 라디칼 소거 능을 나타냈으나 처리된 농도에 비례해서 활성을 나타냈으며, 1, 000㎍/mL 처리했을 때에는 52% 소거능으로 다른 3개의 분획물과 비슷한 수준으로 나타났다.
- 주요 구성성분인 총당과 총단백질 함량은 448mgg과 21 mg/g이었으며, 총당의 함량은 F III가 가장 높았고, F IV, F II 및 F I의 순서였다. 네 분획물을 가수분해하여 이들의 구성당을 분석한 결과,중성 당은 mannose: fucose: galactose: glucose가 0.01 : 0.02 :0.14 : 0.83의 비율로, 아미노당은 galactosamine : glucosamine0] 0.01 :0.99의 비율로 구성되어 있었으며, 전체 구성당 함량에서 중성당 : 아미노당의 비율은 0.94 : 0.04로 조성 된 다당체 였다. 분획물별로 총단백질과 구성 아미노산은 F IV가 가장 높았으며, F III, F II 및 F I의 순서로 함유하였다.
- 네 분획물을 각 농도별로 처리하여 DPPH 유리 라디칼 소거 능을 조사한 결과는 50-1, 000 |ig/rnL 처 리 했을 때 농도에 비 례하여 네 분획물 모두에서 F IV, F III, F II 및 F I의 순서로 활성을 나타냈다. CHO-kl 동물 세포에서 활성산소종 제거 능을 조사한 결과는, 분획물을 l-100|ig/mL까지 처리한 농도에 비례하여 활성 이 상승되는 것으로 나타났으나 100 ng/mL 이상의 처리농도에서는 거의 변화를 보이지 않았다.
- 농도별로 분획물을 처리한 CHO-kl의 활성산소종 제거 능을 살펴보면 l-100|ig/mL까지는 처리한 분획물의 농도가 증가할수록 이에 비례하여 활성이 상승되는 것으로 나타났으나 100 pg/mL 이상의 처리 농도에서는 활성이 완만해지면서 거의 변화를 보이지 않아 활성이 포화되는 한계점에 이르는 것으로 판단된다. 각 분획물을 처리했을 때 분자량이 10kDa 이상이며 단백질이 비교적 많이 함유된 F IV에서 가장 높은 활성을 보였으며, 그 다음 F III였고, F I이었으며, F II는 가장 낮은 활성을 나타냈다.
- 네 분획물 모두 진한 탄수화물 정색반응을 보였으며, 환원당 정색반응도 나타났다. 단백질 및 펩타이드 정색반응도 모든 분획물에서 나타났으며, 그 중에서 특히 F IV 분획물에서 상대적으로 강한 반응을 보였다. 유기산 함유 여부는 F 1 분획 물에 중간정 도의 정 색 반응이 나타났으며 , F II 분획물에 도약한 반응을 나타내서 소량 함유하는 것으로 보이나 F III와 F IV 분획물에서는 정색반응을 나타내지 않았다.
- Lee 등(8)은 동물실험에서 화살나무 추출물이 종양세포의 증식을 억제하는 동시에 면역계를 활성화시킴으로써 항암효과를 입증하였다. 또, 화살나무 추출물은 각 분획물에 따라서 히스타민 유리억제, 염증성 싸이토카인의 분비 억제 및 세포의 안정화 작용을 가지고 있음을 구명하였다.
- 61 mg/g 함유하였다. 분획 별로는 F I이 glucose, galactose, fucose 모두 다른 분획물에 비해 가장 높게함유하였으며, 분자량이 큰 분획일수록 예상대로 유리당 함량이 더 낮았다. 이는 한외여과에 의한 추출물 분획이 정확히 수행되었음을 보여주는 결과이다.
- 페놀 화합물의 정색반응은 F IV 분획물에서 중간 정도의 반응을 보였고, F II 와 F III 분획물에서는 약한 반응을 보였으며 F I에서는 반응하지 않았다. 스테로이드, 테르페노이드 및 사포닌의 정색반응은 모든 분획물에서 적자색을 나타내지 않았으며, 진한 H2SO4 를 가했을 때 모두 갈색으로 변했다.
- 열수 추출물의 정성반응 결과, 네 분획물 모두 대부분 탄수화물이었고, 소량의 단백질을 함유하였으며, 일부 분획물에는 소량의 페놀 화합물 및 유기산이 함유되어 있었다. 주요 구성성분인 총당과 총단백질 함량은 448mgg과 21 mg/g이었으며, 총당의 함량은 F III가 가장 높았고, F IV, F II 및 F I의 순서였다.
- 이러한 결과로 화살나무 열수 추출물의 주요 구성성분 중에는 다른 식물 추출물에 비해 특이하게 중성당 중에서 fucose를 함유하는 것과 아미노당 중에서 glucosamine과 galactosamine을 함유하고 있다는 것을 알 수 있었다. 식품 및 의약계에서는 이들 단당류들의 생체 기능성이 잘 알려져 있어서(16-18) 새우 나게 등 갑각류 껍질에서 추출 .
- 이상의 결과, 탄수화물과 단백질 함량이 비교적 높은 F IV 에서 항산화능과 활성산소종 제거능이 가장 높음을 알 수 있었다. 그러나 다른 분획(F I-F III)에서도 정도의 차이는 있지만 활성을 보였다.
- 전 분획물에 함유된 아미노산 종류와 함량은 Glu>Asp>Pro> Gly > Leu > Vai > Ser > Ala > Thr > He > Phe > Cys > His > Arg > Met>Lys>Try>Trp>Cys2의 순서로 19종의 아미노산을 함유하는 것으로 나타났으며, 특히 Glu과 Asp의 산성 아미노산의 함량이 높았는데, 이 중 Asp의 높은 함량은 분석 중에 Asn의 -NH3기가 가수분해 되면서 Asp와 겹쳐져서 분리되어 나오는 것으로 예측할 수 있다. 중성 아미노산은 비교적 고루 함유되어 있었으며, 상대적으로 Arg이나 Lys의 염기성 아미노산 함량은 낮았다.
- 분획물별로 총단백질과 구성 아미노산은 F IV가 가장 높았으며, F III, F II 및 F I의 순서로 함유하였다. 조 추출물에 함유된 아미 노산의 종류와 양은 Glu > Asp > Pro > Gly > Leu > Vai > Ser > Ala > Thr > lie > Phe > Cys > His > Arg > Met > Lys > Try > Trp >Cys2의 순서로 19종의 아미노산이 분석되었으며, 특히 산성 아미노산과 중성 아미노산 함량이 높았다.
- 화살나무의 조 추출물의 총단백질 함량은 21 mg/g이었으며, 분획별로는 F IV에서 107 mg/g으로 가장 높았으며, F III 은 24 mg/g, F II은 22 mg/g로 비슷한 수준이었으며, F I는 3mg/g으로 가장 낮았다. 조 추출물에서 총당과 총단백질의 존재 비율은 0.96: 0.04로 대부분이 다당체임을 알 수 있었다.
- Table 5와 갇다. 조 추출물의 구성당 중에 중성당은 mannose : fucose : galactose : glucose 가 0.01 : 0.02 : 0.14 : 0.83 의 비 율로, 아미 노당은 galactosamine : glucosamine0] 0.01: 0.99의 비율로 구성되어 있었으며, 전체 구성당 함량에서 중성당 : 아미노당은 0.96: 0.04의 비율로 조성 된 다당체 였다.
- 예측할 수 있다. 중성 아미노산은 비교적 고루 함유되어 있었으며, 상대적으로 Arg이나 Lys의 염기성 아미노산 함량은 낮았다.
- 04로 화살나무의 줄기 및 날개에서 열수 추출한 분획물의 상당부분이 10 kDa 이상의 고분자 화합물 이었다. 한외여과법의 특성상 완벽하게 분자량대로 분획될 수는 없겠으나 3회 이상 실시하였을 때 상당히 재현성 있게 나타남을 확인할 수 있었다.
- 화살나무 열수 추출물 중에는 항산화능과 활성산소종 제거 능을 나타내는 물질이 여러 가지 있을 것으로 추정되지만 분자량 크기별로 분획한 네 분획물의 정색반응과 성분조성을 조사한 결과, 주요 구성성분은 단백질이 결합되어 있을 가능성이 높으며, DPPH 유리 라디칼 소거능과 CHO-kl의 세포에서 활성산소종 제거 능의 생리 활성을 나타내는 다당체 (bioactive car- bohydrate)일 것으로 사료된다.
- 화살나무 열수 추출물의 유리당 조성은 Table 4와 같이 조추출물에서 glucose가 45.69 mg/g로 가장 높았으며, galactose가 5.94 mg/g, fiicose는 0.61 mg/g 함유하였다. 분획 별로는 F I이 glucose, galactose, fucose 모두 다른 분획물에 비해 가장 높게함유하였으며, 분자량이 큰 분획일수록 예상대로 유리당 함량이 더 낮았다.
후속연구
- 분리하여 기능성 식품 및 의약품의 소재로 제조 . 가공하여 이미 이용을 하고 있는 실정(19- 21)에서 화살나무 열수 추출물은 식물성 다당체로서 인체내 생리활성(22)을 나타낼 가능성이 높으며, 구체적인 다당체 화합물의 구조와 세포 및 동물에 대한 실험 결과를 제시한다면 이를 이용해 건강기능(보조)식품을 제조할 수 있을 것으로 기대된다.
- 추세식을 구한 후, 각 분획물을 분석하여 얻어진 머무름 시간 값을 이 식에 적용해 구하였다. 각 피크의 GU 값과 소당체 표준 물의 데이터베이스(28)에 나와 있는 GU 값을 비교하여 몇 가 지소 당류를 예측할 수 있었지만, GU값이 상대적인 값이기 때문에 본 실험에서 정확한 소당체 구조를 해석하기에는 한계점이 있었다.
- fhedelane와 olefinic group이 활성 분획임을 제시한 바 있다. 그러나 이는 전체 추출물의 일부가 관여하는 것으로 화살나무 추출물에서 아직 알려져 있지 않은 구성성분을 조사해야 하며, 이를 더 자세하게 분리 . 정제하여 그 특징을 검토하는 것이 필요하다고 제안하였다.
- 화살나무 열수 추출물 중에는 항산화능과 활성산소종 제거능을 나타내는 물질이 여러 가지 있을 것으로 추정되며, 그 중 F IV에는 조성이나 분자량 크기로 보아 생리 활성을 가지면서 열에 강한 단백다당체가 다량 포함되어 있을 것으로 사료된다. 현재, 정밀분석과 구조 결정을 통해 활성 성분의 존재를 구명하고 기전을 밝히는 실험을 진행 중이다.
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