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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 화살나무잎을 이용하여 열수추출물에 대한 항산화활성 및 생리활성과 화살나무잎을 고온에서 덖음처리시 가열처리가 화살나무잎의 생리활성 물질에 미치는 영향을 검토하여 천연물소재로서 기능성제품 개발을 위한 기초자료로 제시하고자 수행하였다.
제안 방법
- 0) 50gL와 혼합하여 37P에서 15분간 preincubation한 후 3 mM /?NPG(4-nitrophenyl-a-D-glu- copyranoside) 100 uL를 가하여 37。(:에서 10분간 반응시 켰다. 0.1 M Na2CO3 750 uL로 반응을 정지시킨 후, 분광광도계를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하여 a-glucosida%의 IC50을 계산하였다.
- 심각한 손상을 초래한다. Hydroxyl 라디칼 소거활성은 Fenton reaction에 의해 생성된 hydroxyl 라디칼을 deoxyribose를 분해하고 이때 생성된 MDA(malondialdehyde)양을 측정함으로써 화합물의 hydroxyl 라디칼 소거능을 측정하였다. Fig.
- MTT를 이용하여 화살나무잎 열수추출물의 Raw 264.7세포에대한 세포독성을 확인하였다(Fig. 6). 세포독성측정은 LPS 무처리군에 대한 처리군의 비율로 계산하여 세포생존율을 나타내었다.
- Mitocondrial dehydrogenase activity의 index를 나타내는 MTT colorimetric reduction assay를 수행하여 추출물이 세포 생존율에미치는 영향을 측정하였다(17). Raw 264.
- 7세포는 10%의 FBS가 함유된 RPMI 1640 media에서계대배양하였다. NO 소거활성을 측정하기 위하여 Raw 264.7세포를 96 well에 well당 1 x 105 cells을 분주한 다음 시료를 10 ug/ mL 및 100ug/mL의 농도가 되도록 세포배양 well에 첨가하여 37℃, 48시간 동안 5% CO/ 공기조건에서 배양하였다. 시료에대한 대조구로는 10mg/mL의 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하여활성화 유도한 세포를 사용하였다.
- 즉 시료 1 mg에 Folin reagent 2mL을 넣은 후 3분간 정치하고 10% sodium carbonate (10% NajCQ) 2mL을 첨가하여 혼합한 후 30℃에서 40분 정치한 뒤 분광광도계를 이용하여 760 run에서 흡광도를 측정하였다. Tannic acid를 이용하여 표준곡선을 작성한 후 이 검량곡선으로부터 시료중의 총폴리페놀 함량을 구하였다.
- 2 mL을 가하고 25。0에서 10분간 방치한 후 1 N HC1 1 mL로 반응을 정지시킨 후 분광광도계를 이용하여 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구에는 시험용액 대신 탈이온수를 첨가하였다. SOD 유사활성 측정은 다음과 같은 식으로 계산하였다.
- 4 mL를 가하고 vortex mixing 후 37℃에서 30분간 반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH의 환원에 의한 흡광도 감소를 조사하였다. 무처리구와 처리구의 값을 비교하여 free radical 소거활성을 결정하였다. 이때 IGoQig/mL)은 추출물을 첨가하지 않은 대조군의 값을 50% 감소시키는 추출물의 농도를 나타냈으며, 기존의 항산화제 인 a-tocopherol, ascorbic acid 및 BHT(buty- lated hydroxytoluene)를 대조구로 사용하여 비교하였다.
- 그러나 최근에 과량의 NO 생성이 염증반응을 일으키고, 조직의 파괴 및 면역체계의 이상을 일으킨다고 보고되고 있다(30). 본 연구에서는 Raw 264.7세포를 LPS로 활성화시킴과 동시에 화살나무잎 열수추출물을 첨가하고 18시간 경과한 후 생성된 NO 의 양을 측정하였다(Fig. 5). LPS로 활성화된 Raw 264.
- 일반적으로 전통적으로 손에 의해 이루어지는 제다법은 차 품질에 큰 영향을 미치기 때문에 이를 균일화시키기 위해 덖음차 제조 공정 중 덖음회수가 녹차의 품질에 미치는 영향을 검토한 결과, 5회 덖음처리를 한 것이 최적의 조건이었음을 밝혔다(18). 본 연구에서는 덖음처리 전 시료의 수분함량이 25% 정도로 낮은 수분함량과 화살나무잎의 색이 과도한 열처리로 의한 변색으로 화살나무 잎의 덖음처리는 3단계로 실시하였다. 3단계 덖음처리 후 수분함량은 2.
- 배양 후, 상징액 100 uL를 회수하고 여기에 동량의 Griess solution을 첨가하여 15분간 방치한다음 상징액의 발색도를 microplate reader를 사용하여 520 nm 및 550 nm의 흡광도로 측정하였다. 세포가 생산한 NO를 정량하기위하여 sodium nitrate를 사용하여 표준곡선을 작성하였다.
- Louis, MO, USA) lOOpL를 첨가하고 37。(3에서 3시간 처리한 다음 DMSO 150]1!를 첨가한 상태에서 10분간 진탕시켜 세포내에 들어간 색소를 충분히 용출시킨 후 microplate reader를 사용하여 540 nm 및 595nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성실험은 LPS 무처리군에 대한 처리군의 비율로 계산하여 세포 생존율을 나타내었다.
- 6). 세포독성측정은 LPS 무처리군에 대한 처리군의 비율로 계산하여 세포생존율을 나타내었다. 덖음처리하지 않은 시료는 열수추출물의 첨가량이 증가하여도 세포생존율이 일정하게 나타났지만, 덖음처리한 시료는 열수추출물의 첨가량 증가와 함께 세포생존율이 감소하였다.
- 7세포를 96 well에 well당 1 x 105 cells을 분주한 다음 시료를 10 ug/ mL 및 100ug/mL의 농도가 되도록 세포배양 well에 첨가하여 37℃, 48시간 동안 5% CO/ 공기조건에서 배양하였다. 시료에대한 대조구로는 10mg/mL의 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하여활성화 유도한 세포를 사용하였다. 배양 후, 상징액 100 uL를 회수하고 여기에 동량의 Griess solution을 첨가하여 15분간 방치한다음 상징액의 발색도를 microplate reader를 사용하여 520 nm 및 550 nm의 흡광도로 측정하였다.
- 5 M NaOH) 발색시 약 500 pL를 넣고, lOITC에서 15분간 끊여 발색시킨 후 충분히 냉각시켰다. 이 반응액에 3배의 물을 가하고 잘 교반한 후 분광광도계를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하고 저해율을 계산하였다. a-Amylase 의 활성을 50% 저해하는 저해제의 농도를 [C50으로 계산하였다.
- 무처리구와 처리구의 값을 비교하여 free radical 소거활성을 결정하였다. 이때 IGoQig/mL)은 추출물을 첨가하지 않은 대조군의 값을 50% 감소시키는 추출물의 농도를 나타냈으며, 기존의 항산화제 인 a-tocopherol, ascorbic acid 및 BHT(buty- lated hydroxytoluene)를 대조구로 사용하여 비교하였다.
- 화살나무잎 열수추출물을 각 농도별(50, 100, 200, 500 |Ag/mL) 로 제조한 시료 0.4 mL에 0.2 mM DPPH 0.4 mL를 가하고 vortex mixing 후 37℃에서 30분간 반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH의 환원에 의한 흡광도 감소를 조사하였다. 무처리구와 처리구의 값을 비교하여 free radical 소거활성을 결정하였다.
대상 데이터
- 본 연구의 시료는 정선군 농업기술센터에서 분양받은 화살나무[Euonymus alatus(Thumb.) Sieb.] 잎으로 2007년 5월에 채취한것을 사용하였다. 시료는 230。(2로 유지된 솥에 넣고 10분간 덖음처리하고 덖음처리 온도는 3 단계(230-150-80。。)로 실시하였다.
- 잎은 마주달리고 짧은 잎자루가 있으며, 타원형 또는 달걀을거꾸로 세운 모양으로 가장자리에 잔 톱니가 있다. 화살나무는한방에서 수피와 가지를 월경불순, 무월경, 산후지혈과 자궁암 등에 이용하였으며, 민간에서는 열매를 연고로 피부병에 이용하였다. 화살나무잎은 홑잎이라고도 불리우는데, 예로부터 이른 봄에어리고 부드러운 잎을 요리재료로 이용하였다(8).
이론/모형
- 6. Celi viability was measured by MTT assay. NRE: No roasted E.
- Fenton반응으로 생성된 hydroxyl 라디칼에 의한 2-deoxjribose 의 산화정도를 Gutteridge의 방법에 따라 측정하였다(14). 시험관에 0.
- NO 소거활성은 마우스의 대식세포 세포주인 Raw 264.7세포를지시세포로 이용하여 Murakami 등의 방법에 의해 측정하였다(16). Raw 264.
- 화살나무잎 열수추출물의 총폴리페놀 함량은 페놀성 물질이 phosphomolybdic acid와 반응하여 청색을 나타내는 원리를 이용한 Folin-Denis법(13)으로 측정하였다. 즉 시료 1 mg에 Folin reagent 2mL을 넣은 후 3분간 정치하고 10% sodium carbonate (10% NajCQ) 2mL을 첨가하여 혼합한 후 30℃에서 40분 정치한 뒤 분광광도계를 이용하여 760 run에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 화살나무잎 열수추출물에 대한 hydroxyl 라디칼 소거능은 덖음처리한 시료와 덖음처리하지 않은 시료, 모두 농도의 증가에 따라 hydroxyl radical0] 감소하는 경향을 보여주어 농도의존적인 저해효과를 나타냈다. 3mg/ml 농도에서 덖음 처리하지 않은 시료가 hydroxyl 라디칼 소거능이 가장 높은 35%를 보여주었다. 대조구인 BHA에 비해 낮은 hydroxyl 라디칼 소거 능을 보여준 화살나무잎 열수추출물은 산화방지제인 BHA와는 달리 순수한 화합물이 아닌 조추출물이기 때문에 낮은 것으로 생각된다.
- 께포는약 60piM 정도의 NO를 생성하였으나, 화살나무잎 열수 추출물을 처리하였을 때 NO 생성이 현저히 억제됨을 확인하였다. NO 생성억제 효과는 화살나무잎 열수추출물 농도에 의존적이었으며, 두 시료 모두 1000|ig/mL의 농도에서 가장 좋은 결과를 보여주었다.
- 이것으로 화살나무 열수추출물이 저 농도에서는 a-a* mylase 저해하여 포도당과 같은 단당류의 분해를 지연시키나고농도일 때는 단당류로 분해를 촉진시킴을 알 수 있었다. a- Amylase 저해는 모두 덖음처리한 시료가 덖음처리하지 않은 것에 비해 다소 좋은 효과를 보여주었다. 덖음처리한 시료가 0.
- 있어 농도의 증가와 함께 항염증활성효과가 향상되었다. 그러나 MTT를 이용한 세포 생존율을 측정한 결과, 덖음처리하지 않은 시료의 열수추출물 첨가량이 증가하여도 일정하게 나타난 반면, 덖음처리한 시료의 열수추출물 첨가량이 증가함에 따라 세포 생존율은 현저하게 감소하였다. 이와 같은 결과로 볼 때덖음처리하지 않은 시료가 덖음처리한 시료에 비해 좋은 염증 저해 효과를 보여주고 있으며, 특히 덖음처리하지 않은 시료의 1, 000 pg/mL 농도에서 가장 좋은 항염증효과를 나타냈다.
- LPS로 활성화된 Raw 264. 께포는약 60piM 정도의 NO를 생성하였으나, 화살나무잎 열수 추출물을 처리하였을 때 NO 생성이 현저히 억제됨을 확인하였다. NO 생성억제 효과는 화살나무잎 열수추출물 농도에 의존적이었으며, 두 시료 모두 1000|ig/mL의 농도에서 가장 좋은 결과를 보여주었다.
- 36%으로 보고하였다<22). 본 실험에 얻어진 화살나무잎 열수추출물에 대한 총폴리페놀 함량은 녹차보다는 낮은 수치를 보여주었다.
- 1 mg/mL 이상의 고농도에서는 오히려 a-amylase에 대한 저해활성이 감소됨을 확인하였다. 이것으로 화살나무 열수추출물이 저 농도에서는 a-a* mylase 저해하여 포도당과 같은 단당류의 분해를 지연시키나고농도일 때는 단당류로 분해를 촉진시킴을 알 수 있었다. a- Amylase 저해는 모두 덖음처리한 시료가 덖음처리하지 않은 것에 비해 다소 좋은 효과를 보여주었다.
- 이상의 결과에서 화살나무잎 열수추출물에 대한 생리활성은 덖음 처리하지 않은 시료가 덖음처리한 시료에 비해 다소 좋은 항산화 및 a-amylase 저해, 항염증효과를 보여주었다. 일반적으로 녹차는 기호성이 우수하고 페놀성 화합물, 비타민C, 탄닌, 카페인 등과 같은 성분이 함유하고 있고, 여러 성인병 예방 등의 뛰어난 약리적 특성을 가지고 있다.
- 그러나 MTT를 이용한 세포 생존율을 측정한 결과, 덖음처리하지 않은 시료의 열수추출물 첨가량이 증가하여도 일정하게 나타난 반면, 덖음처리한 시료의 열수추출물 첨가량이 증가함에 따라 세포 생존율은 현저하게 감소하였다. 이와 같은 결과로 볼 때덖음처리하지 않은 시료가 덖음처리한 시료에 비해 좋은 염증 저해 효과를 보여주고 있으며, 특히 덖음처리하지 않은 시료의 1, 000 pg/mL 농도에서 가장 좋은 항염증효과를 나타냈다.
- 2에 나타냈다. 전체적으로 SOD 유사활성은 농도에 의존하는 경향을 보여주었다. 화살나무잎 열수추출물에 대한 대조구인 ascorbic acid의경우, 3mg/mL에서 52%의 SOD 유사활성을 보인 반면, 덖음처리하지 않은 시료가 20%, 덖음처리한 시료가 18%로 덖음처리하지 않은 시료가 다소 높은 SOD 유사활성효과를 보여주었다.
- 화살나무잎 열수추출물에 대한 NO 생성 억제효과는 덖음 처리하지 않은 시료와 덖음처리한 시료, 모두 농도의존적인 효과를 보여주고 있어 농도의 증가와 함께 항염증활성효과가 향상되었다. 그러나 MTT를 이용한 세포 생존율을 측정한 결과, 덖음처리하지 않은 시료의 열수추출물 첨가량이 증가하여도 일정하게 나타난 반면, 덖음처리한 시료의 열수추출물 첨가량이 증가함에 따라 세포 생존율은 현저하게 감소하였다.
- 대조 구인 BHA는 lOOeg/mL에서 93% 정도의 높은 hydroxyl 라디칼 소거능을 보여주었다. 화살나무잎 열수추출물에 대한 hydroxyl 라디칼 소거능은 덖음처리한 시료와 덖음처리하지 않은 시료, 모두 농도의 증가에 따라 hydroxyl radical0] 감소하는 경향을 보여주어 농도의존적인 저해효과를 나타냈다. 3mg/ml 농도에서 덖음 처리하지 않은 시료가 hydroxyl 라디칼 소거능이 가장 높은 35%를 보여주었다.
- 전체적으로 SOD 유사활성은 농도에 의존하는 경향을 보여주었다. 화살나무잎 열수추출물에 대한 대조구인 ascorbic acid의경우, 3mg/mL에서 52%의 SOD 유사활성을 보인 반면, 덖음처리하지 않은 시료가 20%, 덖음처리한 시료가 18%로 덖음처리하지 않은 시료가 다소 높은 SOD 유사활성효과를 보여주었다.
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