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문제 정의
- Paper-disc 방법에 의한 항균활성 검색 실험에서 연교의 methanol 추출물과 수용액 추출물이 Staphylococcus epidermidis 및 Shigella /Zexner”게 가장 높은 항균력을 보였으므로 본 실험에서는 이 추출물이 이들 균주의 생육 저해에 미치는 영향을 성장 곡선을 통해 알아보기로 하였다. 연교의 수용액 추출물이 Staphylococcus epidermidis에 대해 미치는 생육 저해 정도는 Fig.
- 본 연구에 사용한 연교는 개나리의 과실로 한방과 민간에서는 종창, 치질, 소염, 임파선염 등에 응용되어 오고 있다(육창수 1982). 본 실험에서는 이와 같은 연교 추출물의 항균활성을 검색하고 각종 식중독 유발세균의 중식에 미치는 영향을 조사해 보고자 하였다.
- 본 연구에서는 식중독 유발세균에 대한 항균활성이 우수한 천연 항균성 물질을 검색하기 위해 예로부터 민간과 한방에서 널리 이용되어 온 연교를 각종 유기 용매로 주줄하여 식중독 유발세균에 대한 항균활성을 조사해 보았다. 연교를 petroleum ether, chloroform, ethly acetate, methanol이용하여 실온에서 각각 용매별로 계통 분획하고, 열수추출물을 얻은 후, 9종의 식중독 유발세균 (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella paratyphimurium, Shigella flexneri, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa, Shigella sonnet)^ 대하여 항균효과를 조사하였다.
제안 방법
- 이 배지 위에 멸균된 paper disc를 시료 수에 맞게 올리고 밀착시킨 후 연교의 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol, 열수추출물을 각각 250 ppm, 500 ppm, 1, 000 ppm으로 희석하여 20 ㎕씩 천천히 흡수시켰다. Control로 연교 추출물이 들어 있지 않은 70% ethanol을 실험 군과 동 일한 방법으로 점적하였다. 준비된 모든 plate는 37 °C 에서 24시간 배양한 후 disc 주변에 생성된 clear zone(mm)의 크기를 측정하여 각 분획물의 항균 활성 정도를 측정하였다.
- 건조시킨 연교 500 g에 대해 연교 중량의 2배 분량인 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol-g-사용하여 항균성 물질을 추출하였다. 추출관에 연교를 넣고 1 L의 methanol을 넣은 후 실온에서 6시간 방치한 후, Whatman No.
- Japan)를 사용하여 35°C 에서 감압. 농축하였으며 농축한 추출물은petroleum ether, chloroform, ethyl acetate 및 methanol 을 각각 사용하여 용매 계통 분획하였다. 이 때 methanol 추출물과 각종 유기용매를 분별 깔대기에 넣고 5분간 수작업으로 흔들어 혼합한 후, 15분간 실온에 방치시킨 후 분리하였다.
- 연교 추출물을 다른 항균성 식물 추출물과 혼합했을 시 항균력의 상승 여부를 확인하고자 느릅나무 추출물과의 혼합을 시도하였다. 본 실험의 예비 실험에서 항균력이 있음이 입증된 연교의 열수 추출물과 느릅의 methanol추출물을 각각 500 ppm씩 섞고, 연교의 수 물 1, 000 ppm 및 느릅의 methanol추출물 1, 000 ppm과 항균력을 비교하였다. 대상 균주는 Staphylococcus epidermidis 및 Shigella jlexneri를 사용하고, 대조군으로 70% ethanol를 각 시료와 동일한 양인 20 ㎕씩 분주하여 검증하였다.
- Japan)로 제균시키고, 액체 배지에 각 추출물을 2, 500 ppm, 5, 000 ppm, 및 10, 000 ppm 농도별로 첨가하였다. 여기에 O.D.값을 0.4로 맞춘 세균 배양액을 IO'배 희석하여 무균적으로 접종하고 37 °C 에서 72시간 배양하면서 12시간마다 세균 배양액의 중식정도를 660 nm에서 spectrophotometer로서 측정하였다.
- 연교 추출물을 다른 항균성 식물 추출물과 혼합했을 시 항균력의 상승 여부를 확인하고자 느릅나무 추출물과의 혼합을 시도하였다. 본 실험의 예비 실험에서 항균력이 있음이 입증된 연교의 열수 추출물과 느릅의 methanol추출물을 각각 500 ppm씩 섞고, 연교의 수 물 1, 000 ppm 및 느릅의 methanol추출물 1, 000 ppm과 항균력을 비교하였다.
- 본 연구에서는 식중독 유발세균에 대한 항균활성이 우수한 천연 항균성 물질을 검색하기 위해 예로부터 민간과 한방에서 널리 이용되어 온 연교를 각종 유기 용매로 주줄하여 식중독 유발세균에 대한 항균활성을 조사해 보았다. 연교를 petroleum ether, chloroform, ethly acetate, methanol이용하여 실온에서 각각 용매별로 계통 분획하고, 열수추출물을 얻은 후, 9종의 식중독 유발세균 (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella paratyphimurium, Shigella flexneri, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa, Shigella sonnet)^ 대하여 항균효과를 조사하였다. 연교 추출물의 농도별 항균 활성 검색에서는 연교의 열수 추출물이 가장 큰 항균 효과를 보였으며 Staphylococcus epidermidis 와 Shigella flexneri7} 가장 민감하게 반응하는 균주였다.
- 연교의 열수 추출물을 membrane filter(0.2 ㎛, pore size. Toyoroshi Kaisha. Ltd. Japan)로 제균시키고, 액체 배지에 각 추출물을 2, 500 ppm, 5, 000 ppm, 및 10, 000 ppm 농도별로 첨가하였다. 여기에 O.
- 4로 흡광도를 조절하고 pour-plate method에 따라 Tryptic Soy Agar(TSA)배지가 분주된 배양접시에 균일하게 섞은 후 실온에서 굳혔다. 이 배지 위에 멸균된 paper disc를 시료 수에 맞게 올리고 밀착시킨 후 연교의 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol, 열수추출물을 각각 250 ppm, 500 ppm, 1, 000 ppm으로 희석하여 20 ㎕씩 천천히 흡수시켰다. Control로 연교 추출물이 들어 있지 않은 70% ethanol을 실험 군과 동 일한 방법으로 점적하였다.
- Control로 연교 추출물이 들어 있지 않은 70% ethanol을 실험 군과 동 일한 방법으로 점적하였다. 준비된 모든 plate는 37 °C 에서 24시간 배양한 후 disc 주변에 생성된 clear zone(mm)의 크기를 측정하여 각 분획물의 항균 활성 정도를 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험의 예비 실험에서 항균력이 있음이 입증된 연교의 열수 추출물과 느릅의 methanol추출물을 각각 500 ppm씩 섞고, 연교의 수 물 1, 000 ppm 및 느릅의 methanol추출물 1, 000 ppm과 항균력을 비교하였다. 대상 균주는 Staphylococcus epidermidis 및 Shigella jlexneri를 사용하고, 대조군으로 70% ethanol를 각 시료와 동일한 양인 20 ㎕씩 분주하여 검증하였다.
- 본 실험에서 사용한 항균성 시험 대상 식물인 연교는 한국산으로, 대구시 중구 남성로 약전 골목에서 건조 상태의 것을 구입하였다. 불순물을 제거하기 위해 가볍게 2번 수세하여 건조시킨 후, 추출용 시료로 사 용하였다.
- 연교 추출물의 항균실험에 사용한 균주는 한국인에게 가장 빈번히 발생하는 대표적 식중독 유발 세균 가운데 Gram(+)세균 2종과 Gram(-)세균 7종을 선택하여 한국과학기술연구원 생명공학연구소에서 분양 받아 사 용하였다(Table 1). 균의 생육배지로는 모든 균주에 대하여 Tryptic Soy Broth(Difco, TSB)를 사용하여 37°C, incubator에서 18~24시간 배양하였다.
이론/모형
- Paper disc 방법으로 연교의 각종 유기용매 분획물 및 열수추출물을 각종 식품부패균 및 식중독균에 적용시켜 항균 활성을 실험해 본 바 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다. Gram 양성균에 대한 연교의 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol 추출
- 항균성 물질을 검색하기 위해 본 실험에서는 paperdisc 방법을 사용하였다 (Lorian V 1991). Tryptic Soy Broth (TSB) 배지에 배양한 세균을 spectrophotometer (Nontron instruments.
성능/효과
- 연교의 열수 추출물과 느릅나무의 methanol 추출물을 혼합하여 항균력을 측정해 본 결과 두 추출물을 섞어 첨가했을 경우가 단독으로 사용했을 시 보다 상승효과를 나타내었다. 또한 연교의 열수 추출물이 식중독 유발세균의 성장에 미치는 효과를 검정하기 위해 Staphylococcus epidermidis 및 Shigella jlexneri 의 배양액 에 연교의 열수 추출물을 각각 10,000 ppm 농도로 첨가했을 시, Staphylococcus epidermidis의 생육이 12시간 이상까지 억제됨을 관찰할 수 있었고, Shigella flexneri 의 생육도 24시간까지 지연시킬 수 있었다. 이상의 결과 연교의 열수 추출물은 S.
- 물 및 열수추출물의 항균활성은 Table 3과 같이 나타나 disc에 점적한 연교의 각종 추출물의 농도가 증가 할수록 항균 활성이 크게 나타났다. 본 실험에 사용한 각종 연교 추출물의 Gram 음성균에 대한 항균력 검색 결과는 Table 4와 같이 나타났다 즉 농도가 증가할수록 항균 활성을 나타내는 inhibition zone의 크기가 증가하여 methanol 추출물의 경우 Salmonella paratyphimutium 에 대해 1, 000 ppm 농도에서 17 mm로 가장 큰 활성도를 나타내었다.
- 연교의 추출물을 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate 및 methanol로 각각 분리한 결과, 각 분획물의 추출 수율은 Table 2와 같이 나타났다. 백화사설초의 petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, methanol 분획물 및 열수추출물은 각각 0.29%, 7.15%, 0.70%, 1.67%, 6.34%로 나타나, petroleum ether의 수율이 가장 낮았고 chloroform 추출물의 수율이 가장 높았다.
- 물 및 열수추출물의 항균활성은 Table 3과 같이 나타나 disc에 점적한 연교의 각종 추출물의 농도가 증가 할수록 항균 활성이 크게 나타났다. 본 실험에 사용한 각종 연교 추출물의 Gram 음성균에 대한 항균력 검색 결과는 Table 4와 같이 나타났다 즉 농도가 증가할수록 항균 활성을 나타내는 inhibition zone의 크기가 증가하여 methanol 추출물의 경우 Salmonella paratyphimutium 에 대해 1, 000 ppm 농도에서 17 mm로 가장 큰 활성도를 나타내었다. 연교 추출물의 종류 및 농도에 따라 각 균주들에 대한 다른 활성을 나타내 균의 종류에 따라 각기 다른 항균활성을 나타내, 연교의 ethyl acetate 추출물은 Salmonella paratyphimmutium에 대해 주된 항균 활성을 나타내었고, 연교의 열수추출물은 Shigella yZexieri 에서 가장 큰 활성을 나타내었다.
- 연교의 열수 추출물과 느릅나무의 methanol 추출물를 섞었을 경우 나타나는 항균효과는 Table 5와 같이 나타났다. 본 실험에서 가장 민감한 항균효과를 보였던 Shigella jlexneri에 대한 두 식물 추출물의 항균력은, 연교 추출물과 느릅 추출물을 혼합했을 경우 더 크게 나타나, 연교의 열수 추출물만을 단독으로 1, 000 ppm 준 경우(12 mm)보다 느릅의 methanol 추출물 500 ppm에 연교의 열수 추출물 500 ppm을 섞어 준 경우가 더 큰 항균력을 보였다(16 mm). S.
- 연교를 petroleum ether, chloroform, ethly acetate, methanol이용하여 실온에서 각각 용매별로 계통 분획하고, 열수추출물을 얻은 후, 9종의 식중독 유발세균 (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Salmonella paratyphimurium, Shigella flexneri, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa, Shigella sonnet)^ 대하여 항균효과를 조사하였다. 연교 추출물의 농도별 항균 활성 검색에서는 연교의 열수 추출물이 가장 큰 항균 효과를 보였으며 Staphylococcus epidermidis 와 Shigella flexneri7} 가장 민감하게 반응하는 균주였다. 연교의 열수 추출물과 느릅나무의 methanol 추출물을 혼합하여 항균력을 측정해 본 결과 두 추출물을 섞어 첨가했을 경우가 단독으로 사용했을 시 보다 상승효과를 나타내었다.
- 본 실험에 사용한 각종 연교 추출물의 Gram 음성균에 대한 항균력 검색 결과는 Table 4와 같이 나타났다 즉 농도가 증가할수록 항균 활성을 나타내는 inhibition zone의 크기가 증가하여 methanol 추출물의 경우 Salmonella paratyphimutium 에 대해 1, 000 ppm 농도에서 17 mm로 가장 큰 활성도를 나타내었다. 연교 추출물의 종류 및 농도에 따라 각 균주들에 대한 다른 활성을 나타내 균의 종류에 따라 각기 다른 항균활성을 나타내, 연교의 ethyl acetate 추출물은 Salmonella paratyphimmutium에 대해 주된 항균 활성을 나타내었고, 연교의 열수추출물은 Shigella yZexieri 에서 가장 큰 활성을 나타내었다. 연교의 methanol 추출물은 본 실험에 사용한 모든 균주에 대해 항균활성을 나타내었고 250 ppm농도에서도 항균효과가 나타났다.
- 연교 추출물의 종류 및 농도에 따라 각 균주들에 대한 다른 활성을 나타내 균의 종류에 따라 각기 다른 항균활성을 나타내, 연교의 ethyl acetate 추출물은 Salmonella paratyphimmutium에 대해 주된 항균 활성을 나타내었고, 연교의 열수추출물은 Shigella yZexieri 에서 가장 큰 활성을 나타내었다. 연교의 methanol 추출물은 본 실험에 사용한 모든 균주에 대해 항균활성을 나타내었고 250 ppm농도에서도 항균효과가 나타났다. 한편 짚신나물의 methanol 추출물도 S.
- 3과 같이 나타났다. 연교의 수용액 추출물을 첨가 하지 않은 control의 경우 배양 6시간 이후부터 증식이 급격하게 일어났으나, 수용액 추출물을 넣은 경우 10, 000 ppm 농도에서 균의 증식을 24시간 억제할 수 있음을 알 수 있었다. Kang 등(1994)은 갓의 ethanol추출물이 Staphylococcus aureus 및 Escherichia coli 에 대해 생육 억제 효과가 있음을 보고한 바 있고, Park CS(1998)는 Pseudomonas aeruginosa 에 대해 솔잎 ethanol 추출물을 첨가하지 않은 대조군은 24시간 배양 후 O.
- 또한 연교의 열수 추출물이 식중독 유발세균의 성장에 미치는 효과를 검정하기 위해 Staphylococcus epidermidis 및 Shigella jlexneri 의 배양액 에 연교의 열수 추출물을 각각 10,000 ppm 농도로 첨가했을 시, Staphylococcus epidermidis의 생육이 12시간 이상까지 억제됨을 관찰할 수 있었고, Shigella flexneri 의 생육도 24시간까지 지연시킬 수 있었다. 이상의 결과 연교의 열수 추출물은 S. epidermidis와 Shigella flexneri 의 성장을 효과적으로 억제시킴을 알 수 있었다.
후속연구
- 2정도로 균의 증식이 억제됨을 보고한 바 있어 천연물에서 추출한 다양한 종류의 항균성 물질을 잘 활용하면 각종 식중독 유발 세균의 증식을 효율적으로 억제할 수 있을 것으로 판단된다. 본 연구의 경우 Gram(+)균이나 Gram(-)균의 경우 특정 세균만을 대상으로 한 실험 결과로, 추후 좀 더 광범위한 식중독 유발 세균에 대한 항균성 검색이 필요하리라 사료된 다.
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