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문제 정의
- 본 연구에서는 산초의 생리활성 물질로서의 작용을 알아보고자 산초 뿌리, 줄기 및 잎의 부위별 및 분획물을 이용하여 흰쥐 간 microsome의 지질과산화 억제 작용, DPPH radical 소거작용 및 activated partial thromboplastin times (APTT) 을 관찰하였다.
- 이에 본 연구에서는 산초를 이용한 식품학적 연구와 약리학적 연구36-40)를 바탕으로 하여 산초의 뿌리, 줄기 및 잎의 Methanol, Methylene chloride, Ethyl acetate, «-Buta- nol 및 H20 추출물 및 수층침전 등의 다양한 추출물을 얻어 1.000 mg/mL의 농도에서 흰쥐 간 microsome을 이용 한지 질과 산화 억제효과, DPPH radical 소거 작용 및 항혈전작용을 in 에서 관찰하고 그 중 유의적으로 높은 활성을 나타낸 물질들을 선별하여 1.000 mg/mL 내외의 농도에서 관찰함으로써 산초 뿌리, 줄기 및 잎의 추출물의 우수한 생리적 작용을 검증하고자 하였다.
제안 방법
- 1.000 mg/mL농도에서 DPPH radical 소거 작용이 높은 물질로 선별된 산초나무 뿌리, 줄기 및 잎의 methanol, methylene chloride 및 ethyl acetate 증과 잎의 n-butanol 층에 대해 활성의 변화가 나타난 0.125~40.000 mg/mL의 농도에서 DPPH radical 소거 작용을 비교하였다. 그 결과 산초나무 뿌리, 줄기 및 잎 모두 0.
- 1.000 mg/mL농도에서 지질과산화 억제활성이 높은 물질로 선별된 산초나무 뿌리, 줄기 및 잎의 methanol, methylene chloride 및 ethyl acetate 증과 잎의 n-butanol 층에대해 활성의 변화가 나타난 0.050~1.000 mg/mL의 농도에서 지질과산화 억제활성을 비교하였다. 그 결과 0.
- 1.000 mg/mL농도에서 항응고 활성이 높은 물질로 선별된 산초나무 뿌리, 줄기 및 잎의 methanol, methylene chloride 및 ethyl acetate 층과 잎의 n-butanol 층에 대해활성의 변화가 나타난 0.100~2.000 mg/mL의 농도에서 APTT를 비교하였다. 그 결과 산초나무 뿌리, 줄기 및 잎 모두 0.
- 노화나 성인병의 예방효과를 검정하기 위해 산초나무의 뿌리, 줄기 및 잎의 부위별 및 분획별 추출물을 이용하여 흰쥐 간 microsome의 지질과산화 억제 활성을 1.000 mg/mL 농도에서 우선적으로 측정한 결과는 Table 1과 같다. 산초나무의 뿌리, 줄기 및 잎의 활성을 검색한 결과 산초나무 추출물의 DPPH radical 소거 활성은 뿌리, 줄기 및 잎 모두 ethyl acetate층>methylene chloride층의 순으로 활성이 나왔으며, 부위별 지질과산화 억제 활성을 비교한 결과 잎> 줄기 > 뿌리의 순으로 활성이 높게 나타났다.
- 그 중 줄기의 "-butanol증에서 다른 부위의 분획물보다 항응고 활성이 높았다. 산초나무의 뿌리, 줄기 및 잎의 분획물 중 가장 항응고 활성이 높은 분획물에대해 가장 낮은 농도인 0.100 mg/mL 농도에서 관찰하였다. 그 결과 항응고 활성은 잎의 刀-butanol층에서 높은 활성을 나타내었다 (Fig.
- Tagashira와 Ohtake의 방법44으로 측정하였다. 시료 200 “L를 ethanol에 녹여 100 “M DPPH ethanol solution 4 mL를 혼합하여 상온에서 10분 동안 반응 시킨 후 517 nm 에서 흡광도를 측정하였으며, 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도에 대한 sample의 흡광도의 감소를 3회 반복 실험하여 얻은 결과를 백분율 (%)로 나타내었다.
- 05 mL를 취하여 sample cup에 넣고 정확히 6분간 37℃에서 반응시켰다. 여기에 370로 데워진 35 mM CaCl2 용액 0.1 mL 를 넣고 Amelung Kcia micro (Sigma Diagnostics) 를 사용하여 응고시간을 측정하였다.
- 수층은 ethyl acetate (600 mL x 3회)로 추출하고 추출액을 농축하여 ethyl acetate 분획을 얻었다. 이어서 수층을 w-butanol (600 mL x 8회) 로 추출하여, 儿-butanol층을 농축하여 n-butanol 분획을 얻었으며, 나머지 수층에는 침전이 있었으므로 침전을 여과하여 자연 건조시켜 수층침전을 얻었으며, 수층은 농축하여 수층분획을 얻었다 (Scheme 1).
대상 데이터
- 세절하여 실험재료로 사용하였다. 산초나무 잎은 2004년 6월 중순에 경북 경산시 자인면 소재동 아임장에서 구입하여 동결건조 후 가루로 한 다음 실험재료로 사용하였다.
- 산초나무의 뿌리 및 줄기는 2004년 6월 경상북도 팔공산에서 채취하여 건조 . 세절하여 실험재료로 사용하였다.
데이터처리
- 67% TBA 수용액 1 mL를 가하고 마개를 하여 100P에서 30 min 간 가열시킨 후 얼음물에서 냉각하고 이를 535 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 지질과산화 저해율은 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 시료 첨가군의 활성을 백분율로 나타내었으며 3회 반복 실험하여 얻은 결과를 평균한 값으로 나타내었다.
이론/모형
- . 7H2O/L-ascorbic acid, "에 의해 유도된 쥐 간 microsome 의 지질과산화도를 Ohkawa 등의 방법淘으로 측정하였다. 즉쥐 간 microsome (2 mL/mg, 0.
- 따라 측정하였다. Activated partial thromboplastin time (APTT) 측정은 APTT reagent (Sigma Diagnostics, No. A1801/A1926) 를 사용하였다. Citrated plasma 0.
- DPPH (l, l-Diphenyl-2-picryl hydrazyl)의 환원에 의한 free radical 소거활성을 관찰하기 위한 DPPH 소거 활성은 Tagashira와 Ohtake의 방법44으로 측정하였다. 시료 200 “L를 ethanol에 녹여 100 “M DPPH ethanol solution 4 mL를 혼합하여 상온에서 10분 동안 반응 시킨 후 517 nm 에서 흡광도를 측정하였으며, 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도에 대한 sample의 흡광도의 감소를 3회 반복 실험하여 얻은 결과를 백분율 (%)로 나타내었다.
- 각 부위별, 분획별 시료의 항혈전 작용은 Thompson 등의 방법妁에 따라 측정하였다. Activated partial thromboplastin time (APTT) 측정은 APTT reagent (Sigma Diagnostics, No.
성능/효과
- 5). 그 중 줄기의 "-butanol증에서 다른 부위의 분획물보다 항응고 활성이 높았다. 산초나무의 뿌리, 줄기 및 잎의 분획물 중 가장 항응고 활성이 높은 분획물에대해 가장 낮은 농도인 0.
- 그 중 잎의 ethyl acetate층이 다른 부위의 분획물보다 DPPH radical 소거 활성이 높았다. 산초나무의 뿌리, 줄기 및 잎의 분획물 중 가장 DPPH radical 소거 활성이 높은 ethyl acetate층 및 잎의 儿-butanol증에 대해 0.500 mg/mL 농도에서 관찰한 결과항산화 물질의 지표가 되는 a-tocopherol보다 각각 2.4배및 1.7배의 효과를 나타내어 산초나무 잎의 ethyl acetate 층 및 "-butanol층의 높은 DPPH radical 소거활성을 관찰할 수 있었다 (Fig. 4).
- 산초나무의 뿌리, 줄기 및 잎의 활성을 검색한 결과 산초나무 추출물의 DPPH radical 소거 활성은 뿌리, 줄기 및 잎 모두 ethyl acetate층>methylene chloride층의 순으로 활성이 나왔으며, 부위별 지질과산화 억제 활성을 비교한 결과 잎> 줄기 > 뿌리의 순으로 활성이 높게 나타났다. 결론적으로 산초나무는 높은 지질과산화 억제 효과가 있으며, 특히 산초나무 잎의 ethyl acetate층에서 가장 높은 효과를 나타냄을 알 수 있었다. Mun 등贖의 연구에서 산초 추출물은 사염화탄소를 투여한 마우스 간조직의 지질과산화 정도를 절반 이상 감소시켰다는 보고가 있으며 Mun">의 연구에서도 산초는 혈청 지질성분을 저하시키는 효과가 있다고 하였다.
- 000 mg/mL의 농도에서 지질과산화 억제활성을 비교하였다. 그 결과 0.050~ 0.250 mg/mL까지 농도 의존적으로 지질과산화 억제활성이 증가하였다 (Fig. 1). 그리고 지질과산화 억제활성의 차이가 가장 큰 0.
- 000 mg/mL의 농도에서 APTT를 비교하였다. 그 결과 산초나무 뿌리, 줄기 및 잎 모두 0.100~0.500 mg/mL 농도까지 농도 의존적으로 증가하였다 (Fig. 5). 그 중 줄기의 "-butanol증에서 다른 부위의 분획물보다 항응고 활성이 높았다.
- 000 mg/mL의 농도에서 DPPH radical 소거 작용을 비교하였다. 그 결과 산초나무 뿌리, 줄기 및 잎 모두 0.125~5.000 mg/mL에서 농도 의존적으로 증가하였다 (Fig. 3). 그 중 잎의 ethyl acetate층이 다른 부위의 분획물보다 DPPH radical 소거 활성이 높았다.
- 100 mg/mL 농도에서 관찰하였다. 그 결과 항응고 활성은 잎의 刀-butanol층에서 높은 활성을 나타내었다 (Fig. 6).
- 3). 그 중 잎의 ethyl acetate층이 다른 부위의 분획물보다 DPPH radical 소거 활성이 높았다. 산초나무의 뿌리, 줄기 및 잎의 분획물 중 가장 DPPH radical 소거 활성이 높은 ethyl acetate층 및 잎의 儿-butanol증에 대해 0.
- 1). 그리고 지질과산화 억제활성의 차이가 가장 큰 0.050 mg/mL 농도에서 선별된 물질의 지질과산화 억제활성을 관찰한 결과 산초나무 잎의 ethyl ace- tate층 methylene chloride층 및 n-butanol층에서 높았으며, 특히 ethyl acetate층의 지질과산화 억제 활성은 항산화의 표준물질이 되는 a-tocopherol의 활성과 비교하여 검색한 결과 약 1.05배 더 높았다 (Fig. 2).
- 따라서 산초나무 뿌리, 줄기 및 잎의 분획물 중에서 잎의 ethyl acetate증이 지질과산화 억제효과 및 DPPH radical 소거 작용이 가장 높았으며, APTT의 측정의 경우 산초나무 뿌리의 ”-butanol층에서 가장 높게 나타났다. 이상의 결과로부터 산초나무의 항산화 및 항응고의 생리적 작용을 검증할 수 있었다.
- 따라서 산초추출물의 지질과산화 억제작용은 잎의 ethyl acetate층 및 methylene chloride층에서 전반적으로 높은활성을 나타내어 산초나무 잎의 항산화 효과를 규명할 수 있었으며, DPPH radical 소거 작용은 지질과산화 억제 작용과같은 경향이었다. 또 항응고 활성은 산초나무 잎의 M-buta- nol층에서 가장 높았다.
- 뿌리 및 줄기는 잎과 같은 경향이었다. 산초 부위별 DPPH radical 소거 활성을 비교한 결과 잎>줄기 > 뿌리의 순으로 활성이 측정되었다.
- 산초 추출물의 분획별 APTT 활성을 1.000 rng/mL의 농도에서 관찰한 결과 뿌리, 줄기 및 잎 모두 n-butanole > methylene chloride층의 순으로 높은 저해 활성을 나타내었다. 산초나무 추출물의 부위별 APTT 활성은 잎>줄기> 뿌리의 순으로 높았다.
- 산초 추출물의 분획별 DPPH radical 소거 활성은 잎에서는 ethyl acetate층 > zi-butanol층의 순으로 활성이 높았으며, 뿌리 및 줄기는 잎과 같은 경향이었다. 산초 부위별 DPPH radical 소거 활성을 비교한 결과 잎>줄기 > 뿌리의 순으로 활성이 측정되었다.
- 000 rng/mL의 농도에서 관찰한 결과 뿌리, 줄기 및 잎 모두 n-butanole > methylene chloride층의 순으로 높은 저해 활성을 나타내었다. 산초나무 추출물의 부위별 APTT 활성은 잎>줄기> 뿌리의 순으로 높았다. 각 부위별 모두 w-butanol 층에서 높은 항응고 시간을 나타내었다.
- 부위별 APTT 활성을 비교했을 때 잎>줄기>뿌리의 순으로 응고 시간이 지연되었다. 산초나무 추출물의 항응고 활성은 n-butanol층에서 높은 활성을 나타내었으며 그 중에서도 잎의 “-butanol 층의 활성이 가장 높았다.
- 500 mg/mL 농도에서는 줄기 n-butanol 층의 반응 시간이 가장 지연되었다. 산초나무의 뿌리, 줄기 및 잎 분획물의 APTT를 0.100 mg/mL 농도에서 검색한 결과 뿌리의 n-butanol층의 활성이 가장 높았다.
- 부위별로는 잎에서 가장 강한 지질과산화 억제활성이 확인되었다. 산초나무의 뿌리, 줄기 및 잎에서 지질과산화 억제활성의 차이가 큰 0.050 mg/mL 농도에서의 지질과산화 억제활성을 검색한결과 산초나무 잎의 ethyl acetate층의 활성이 가장 높았으며, 이는 항산화의 표준물질이 되는 a-tocopherol보다 높은 활성을 나타내었다 산초나무의 뿌리, 줄기 및 잎의 DPPH radical 소거 활성을 농도별로 검색한 결과 0.125~5.000 mg/mL까지 모두 농도 의존적으로 증가하였다. 산초나무의뿌리, 줄기 및 잎의 분획물의 DPPH radical 소거 활성을 0.
- 같다. 산초나무의 뿌리, 줄기 및 잎의 농도별 지질과산화 억제활성을 측정한 결과 0.050~0.250 mg/mL까지 농도 의존적으로 지질과산화 억제 활성이 증가하였다. 부위별로는 잎에서 가장 강한 지질과산화 억제활성이 확인되었다.
- 산초나무의 뿌리, 줄기 및 잎의 분획별 추출물의 지질 과산화 억제작용을 1.000 ng/mL의 농도에서 관찰한 결과 뿌리, 줄기 및 잎 모두 ethyl acetate층>methylene chloride 층의 순으로 활성이 높았으며, 부위별 지질과산화 억제 활성은 잎>줄기>뿌리의 순으로 활성이 높게 나타났다.
- 000 mg/mL농도에서 1차 screening 한 결과는 Table 3과 같다. 산초나무의 뿌리, 줄기 및 잎의 항응고 활성을 관찰한 결과 잎의 경우에는 “-butanol층 > methylene chloride층 > 수층>methanol층의 순으로 APTT 활성이 높았으며, 이는 뿌리 및 줄기에서도 같은 경향으로 확인되었다. 부위별 APTT 활성을 비교했을 때 잎>줄기>뿌리의 순으로 응고 시간이 지연되었다.
- 000 mg/mL 농도에서 우선적으로 검색한 결과 Table 2와 같다. 산초나무의 뿌리, 줄기 및 잎의 활성을 검색한 결과 산초나무 추출물의 DPPH radical 소거 활성은 뿌리, 줄기 및 잎 모두 ethyl acetate층 > n-butanol층의 순으로 활성이 높았다. 부위별 DPPH radical 소거 활성을 비교한 결과 잎>줄기 > 뿌리의 순으로 지질과산화 억제 활성과 같은 경향을 나타내었다.
- 000 mg/mL 농도에서 우선적으로 측정한 결과는 Table 1과 같다. 산초나무의 뿌리, 줄기 및 잎의 활성을 검색한 결과 산초나무 추출물의 DPPH radical 소거 활성은 뿌리, 줄기 및 잎 모두 ethyl acetate층>methylene chloride층의 순으로 활성이 나왔으며, 부위별 지질과산화 억제 활성을 비교한 결과 잎> 줄기 > 뿌리의 순으로 활성이 높게 나타났다. 결론적으로 산초나무는 높은 지질과산화 억제 효과가 있으며, 특히 산초나무 잎의 ethyl acetate층에서 가장 높은 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
- 000 mg/mL까지 모두 농도 의존적으로 증가하였다. 산초나무의뿌리, 줄기 및 잎의 분획물의 DPPH radical 소거 활성을 0.500 mg/mL 농도에서 검색한 결과 산초나무 잎의 ethyl acetate층이 산초나무 뿌리 및 줄기보다 DPPH radical 소거 활성이 약 2.5~3.5배 정도 높았으며, 이는 항산화의 표준물질이 되는 a-tocopherol보다 높은 활성을 나타내었다산초나무의 뿌리, 줄기 및 잎의 분획물의 농도별 APTT를측정한 결과 1.000 mg/mL 농도에서는 잎의 반응 시간이가장 지연되었으나, 0.100~0.500 mg/mL 농도에서는 줄기 n-butanol 층의 반응 시간이 가장 지연되었다. 산초나무의 뿌리, 줄기 및 잎 분획물의 APTT를 0.
- 뿌리의 ”-butanol층에서 가장 높게 나타났다. 이상의 결과로부터 산초나무의 항산화 및 항응고의 생리적 작용을 검증할 수 있었다.
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