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문제 정의
- 본 실험은 홍조해조류의 하나인 불등가사리를 추출 후 각 용매별로 분획하여 암세포 성장억제 효과와 QR 유도활성 효과 등 생리활성을 연구하였다. 불등가사리를 이용하여 4 종의 인체 암세포주 HepG2, HeLa, MCF-7 및 HT-29와 정상 간세포에 대한 암세포 증식억제 실험을 한 결과 사용한 4종의 암세포주에서 모두 시료첨가 농도에 의존적으로 증식 저지 효과가 나타났고, 특히 불등가사리의 methanol 분획층인 GFMM에서 는 매우 낮은 농도의 시료첨가에도 불구하고 괄목할 만한 높은 암세포 성장 억제효과를 나타내었으며, 정상 간세포에서는 모든 분획층에서 약한 세포증식 억제율 을 나타내어 정상 세포에 미치는 독성이 낮음을 확인하였다.
- 본 연구에 사용한 불등가사리 (GSapeltis/imWa)는 조간대의 바위 위나 돌 위에서 자라며 한국, 일본, 미국 태평양 연안 등에 분포하고, 줄기는 원주 모양을 하고 속이 비어 있으며 가지의 선단은 가늘고 뾰족하며 불등가사리를 시료 로 하여 이를 추출 및 분획하여 암세포 증식 억제 효과 및 quinone reductase(QR) 유도효과에 관하여 연구함으로서 항 발암 효과를 가진 기능성 식품으로서의 대체 가능성 유무를 본 실험을 통해 타진해 보고자 한다.
제안 방법
- 실험에 사용한 각 세포주를 celis/well의 농도로 맞추고 24 well에 각각 1 mL씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% COa incubator에서 배양한 후 용매 종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여서 20, 40, 60, 80 및 100 mg/mL의 농도로 첨가하였다. 48시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT 용액(3 mg/ mL)을 100 UL씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거 하고 DMSO와 ethanol을 1: 1로 혼합한 용액 1 mL를 첨가하여 천천히 녹인 후 UV-visible spectrophotometer를 이용 하여 570 nm, 690 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 대조군 세포수를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
- QR생성 유도 효과는 Prochaska와 Santamaria(14)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 즉 T-75 flask에서 배양중인 HepG2세포가 80%이상 증식하게 되면 24 well plate의 각 well에 1X104 cells/mL 되도록 HepG2 세포를 분주하여, 37℃ 5% CO2 incubator에 24시간 동안 배양한 후 불등가사리 추출물을 각각 DMSO 에 녹여 10, 20, 30 및 40 Ug/mL 농도로 첨가하고, 다시 24시간 동안 배양한 다음 배양액을 제거하였다.
- 즉 T-75 flask에서 배양중인 HepG2세포가 80%이상 증식하게 되면 24 well plate의 각 well에 1X104 cells/mL 되도록 HepG2 세포를 분주하여, 37℃ 5% CO2 incubator에 24시간 동안 배양한 후 불등가사리 추출물을 각각 DMSO 에 녹여 10, 20, 30 및 40 Ug/mL 농도로 첨가하고, 다시 24시간 동안 배양한 다음 배양액을 제거하였다. 배지가 제거된 각 well에 250 J1L의 lysis buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 14 mM NaCl, 15 mIVLMgCh)를 혼합하여 well에 1 mM씩 첨가하여 5분 동안 반응시킨 후, 반응 정지 용액인 10.3 mM dicumarol, 0.5% pyridine, 5 mM potassium phosphate(pH 7.4) 혼합액을 250 μL씩 첨가하여 효소반응을 정지시키고 UV-visible spectrophotometer를 이용하여 610nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 그리고 단백질량은 동일한 set의 well plate에 대한 crystal violet 염색 방법으로 정량하였다(15).
- 시료로 사용된 불등가사리는 건조 후 메탄올을 첨가하고 37℃에서 진탕한 후 4시간 동안 3회 반복 추출하고 회전식 진공 농축기로 감압 농축시킨 후 동결 건조하여 적채의 methanol 추출물(GFM)을 얻고, 이 추출물을 각 용매별로 분획 하여 hexane층(GFMH), methanol층(GFMM); butanol 층(GFMB) 및 수층분획물(GFMA)로 각각 분획하고 각 층 을 감압 농축 후 동결 건조하여 분말로 만들어 시료로 사용 하였다.
- 실험에 사용한 각 세포주를 celis/well의 농도로 맞추고 24 well에 각각 1 mL씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% COa incubator에서 배양한 후 용매 종류별 분획물을 각각 일정량의 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여서 20, 40, 60, 80 및 100 mg/mL의 농도로 첨가하였다. 48시간 동안 배양한 후 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT 용액(3 mg/ mL)을 100 UL씩 첨가하여 4시간 동안 다시 배양시킨 후, well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거 하고 DMSO와 ethanol을 1: 1로 혼합한 용액 1 mL를 첨가하여 천천히 녹인 후 UV-visible spectrophotometer를 이용 하여 570 nm, 690 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 대조군 세포수를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
- QR생성 유도 효과는 Prochaska와 Santamaria(14)의 방법을 일부 변형하여 측정하였다. 즉 T-75 flask에서 배양중인 HepG2세포가 80%이상 증식하게 되면 24 well plate의 각 well에 1X104 cells/mL 되도록 HepG2 세포를 분주하여, 37℃ 5% CO2 incubator에 24시간 동안 배양한 후 불등가사리 추출물을 각각 DMSO 에 녹여 10, 20, 30 및 40 Ug/mL 농도로 첨가하고, 다시 24시간 동안 배양한 다음 배양액을 제거하였다. 배지가 제거된 각 well에 250 J1L의 lysis buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 암 세포주는 인체 간암 세포인 HepG2 (human hepatocellular carcinoma), 자궁경부암 세포인 HeLa (human cervices adenocarcinoma), 유방암 세포인 MCF-7 (human breast adenocarcinoma pleural effusion), 대장암 세포인 HT-29(human colon cancer cell) 및 정상 간세포인 liver cell이며 , 2004년 6월 부산대학교 의과대학 생화학교실에서 제공받았다. HepG2, HeLa, MCF-7, HT-29 및 liver 정상 세포주는 DMEM medium 에 10% fetal bovine serum (FBS) 100 mL와 1% 100 units/mL의 penicillin streptomycin 10 mL가 함유된 배지를 사용하여, 37℃ 5% CO2 incubator 에서 monolayer로 배양하였다.
- QR 유도 활성 측정을 보다 신속하고 정확하게 측정하기 위해 본 실험에서는 유일하게 QR 유도활성을 가진 인체간 암세포주인 HepG2를 사용하여 실험을 행하였으며, 그 결과는 Fig. 6에 나타내었다.
- 본 실험에 사용된 불등가사리 (GWopems/Spafa, GF)는 2004년 5월 전남 무안군에 위치한 (주)삼일물산에서 제공받 았다.
- 본 실험에 사용된 불등가사리는 전남 무안군에 위치한 (주)삼일물산에서 제공된 것으로 (주)삼일물산 사장님 께 감 사드립니다.
- 본 실험에 사용한 암 세포주는 인체 간암 세포인 HepG2 (human hepatocellular carcinoma), 자궁경부암 세포인 HeLa (human cervices adenocarcinoma), 유방암 세포인 MCF-7 (human breast adenocarcinoma pleural effusion), 대장암 세포인 HT-29(human colon cancer cell) 및 정상 간세포인 liver cell이며 , 2004년 6월 부산대학교 의과대학 생화학교실에서 제공받았다. HepG2, HeLa, MCF-7, HT-29 및 liver 정상 세포주는 DMEM medium 에 10% fetal bovine serum (FBS) 100 mL와 1% 100 units/mL의 penicillin streptomycin 10 mL가 함유된 배지를 사용하여, 37℃ 5% CO2 incubator 에서 monolayer로 배양하였다.
- 암세포 증식억제 실험에 사용된 시약 중 NP-40, menadione, flavin adenine dinucleotide(FAD), dicumarol 및 glucose- 6-phosphate dehydrogenase는 Sigma사(St. Louis, USA) 제품을 구입하였으며, minimum essential medium (MEM), Dulbeco's Eagle modified medium(DMEM)과 phosphate buffered saline(PBS) 등은 Gibco-BRL(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였으며, 그 외 연구에 사용된 용매 및 시약은 특급을 사용하였다.
이론/모형
- 4) 혼합액을 250 μL씩 첨가하여 효소반응을 정지시키고 UV-visible spectrophotometer를 이용하여 610nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 그리고 단백질량은 동일한 set의 well plate에 대한 crystal violet 염색 방법으로 정량하였다(15).
- 불등가사리 추출 분획물의 암세포 증식억제 효과는 MTT (3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyl tetrazolium bro mide) assay를 사용하여 행하였다(11, 12).
성능/효과
- 82%의 비교적 높은 암세포 증식 억 제 효과를 나타내었다. Fig. 5는 정상 간세포 에 대한 효과를 나타내었으며 메탄올 분획층 GFMM에서는 약 38% 정상세포 억제효과를 나타내었고, 나머지 분획층에서는 약 10~20%이하의 낮은효과를 보여 정상 세포에 미치는 시료분획물의 성장 억제효과는 아주 미약하였다. 이 결과들을 종합하여 볼 때 불등가사리의 메탄올 분획 층 속에는 암 세포 증식을 억제하는 극성 물질이 존재할 것으로 믿으며 본 시료는 대표적인 여성 암인 유방암과 자궁경부암에 그 효과가 탁월한 것으로 생각된다.
- HepG2 세포주에 불등가사리 시료의 각 분획물을 10, 20, 30 및 40 Ug/mL의 농도로 첨가했을 때 대체적으로 각 첨가물의 농도에 따라서 QR 유도활성 이 증가하는 경향을 보였으며, 특히 암세포 성장저지효과가 아주 높았던 GFMM에서 아주 좋은 효과를 나타내었고 시료의 농도를 증가시 킬수록 이 효과가 대체적으로 증가하는 편이었다. 즉 용매 대조군을 1.
- 본 실험은 홍조해조류의 하나인 불등가사리를 추출 후 각 용매별로 분획하여 암세포 성장억제 효과와 QR 유도활성 효과 등 생리활성을 연구하였다. 불등가사리를 이용하여 4 종의 인체 암세포주 HepG2, HeLa, MCF-7 및 HT-29와 정상 간세포에 대한 암세포 증식억제 실험을 한 결과 사용한 4종의 암세포주에서 모두 시료첨가 농도에 의존적으로 증식 저지 효과가 나타났고, 특히 불등가사리의 methanol 분획층인 GFMM에서 는 매우 낮은 농도의 시료첨가에도 불구하고 괄목할 만한 높은 암세포 성장 억제효과를 나타내었으며, 정상 간세포에서는 모든 분획층에서 약한 세포증식 억제율 을 나타내어 정상 세포에 미치는 독성이 낮음을 확인하였다. 특히 본 시료는 여 성 암의 대표적인 유방암과 자궁경부암의 암세포 성장저지효과가 탁월하였다.
- 5는 정상 간세포 에 대한 효과를 나타내었으며 메탄올 분획층 GFMM에서는 약 38% 정상세포 억제효과를 나타내었고, 나머지 분획층에서는 약 10~20%이하의 낮은효과를 보여 정상 세포에 미치는 시료분획물의 성장 억제효과는 아주 미약하였다. 이 결과들을 종합하여 볼 때 불등가사리의 메탄올 분획 층 속에는 암 세포 증식을 억제하는 극성 물질이 존재할 것으로 믿으며 본 시료는 대표적인 여성 암인 유방암과 자궁경부암에 그 효과가 탁월한 것으로 생각된다. 특히 첨가시료의 양은 본 연구실에서 등 다른 육상생물에 첨가한 시료양의 약 1/5에 해당 되는 낮은 농도에서 아주 높은 암세포 성장억 제효과가 나타났으므로 육상생물 추출물 첨가시의 암세포성장 억제효과 (16, 17)와 비교해 보면 해양식물인 불등가사리의 암세포 성장억제효과가 아주 높으며 또 이 결과는 다른 해조류에서 보인 암세포 성장저지 효과(18, 19)보다도 월등히 높다고 하겠다.
- 3은 MCF-7세포주에 대한 결과이며 HepG2와 HeLa에서와 같이 GFMM 분획물 첨가시 암세포증식 억제 효과가 높게 나타났다. 즉 시료 첨가농도 60 Pg/mL에서 98.08%로 거의 모든 세포증식을 억제시켰고, 이후 첨가 농도에서는 성장을 거의 다 억제시켜 실험에 사용한 암세포 중에서 가장 높은 효과를 보였다. Fig.
- HepG2 세포주에 불등가사리 시료의 각 분획물을 10, 20, 30 및 40 Ug/mL의 농도로 첨가했을 때 대체적으로 각 첨가물의 농도에 따라서 QR 유도활성 이 증가하는 경향을 보였으며, 특히 암세포 성장저지효과가 아주 높았던 GFMM에서 아주 좋은 효과를 나타내었고 시료의 농도를 증가시 킬수록 이 효과가 대체적으로 증가하는 편이었다. 즉 용매 대조군을 1.0으로 하여 비교한 결과, GFMM시료를 20, 30 및 40 Ug/ mL 첨가시 대조군에 비해 각각 2.06, 2.60 및 2.58배의 효과를 나타냄으로서 이와 같은 결과도 일반적으로 본 연구실에 서 사용한 해조류 분획물 첨가량의 약 1/3에 해당되 므로 아주 높은 농도 의존적인 QR 유도활성효과를 나타내었다. 특히 극성 용매층인 GFMM에서 QR 유도효과가 제일 높았으므로 이 분획 층에서의 quinone reductase inducer가 존재함 을 추정할 수 있고 앞으로 더욱더 심도 있는 연구를 통해 불등가사리의 생리활성 물질의 구조를 추적, 동정함으로서 식품산업에 있어서의 항 발암 효과를 지닌 기능성 식품의 산업화개발에 매우 중요한 자료가 될 수 있을 것으로 사료된다.
- 1은 HepG2에 불등가사리 용매별 각 시료 분획물을 20, 40, 60, 80 및 100μg/mL씩 첨가하였을 때의 암세포 증식 억제 효과를 나타낸 그림이며, 여러 용매 분획층 중 methanol 분획층인 GFMM 에서 그 효과가 뛰어났다. 즉, GFMM의 시료 농도 80 lig/mL 을 첨가했을 때 85.36%의 높은 암세포 증식억제 효과를 보였고, 100 Ug/mL를 첨가했을 때는 89.25%의 높은 효과가 나타났으며 다른 분획물은 모두 그 효과가 미약하였다. HeLa에 대한 암세포 증식억제 실험 결과는 Fig.
- 불등가사리를 이용하여 4 종의 인체 암세포주 HepG2, HeLa, MCF-7 및 HT-29와 정상 간세포에 대한 암세포 증식억제 실험을 한 결과 사용한 4종의 암세포주에서 모두 시료첨가 농도에 의존적으로 증식 저지 효과가 나타났고, 특히 불등가사리의 methanol 분획층인 GFMM에서 는 매우 낮은 농도의 시료첨가에도 불구하고 괄목할 만한 높은 암세포 성장 억제효과를 나타내었으며, 정상 간세포에서는 모든 분획층에서 약한 세포증식 억제율 을 나타내어 정상 세포에 미치는 독성이 낮음을 확인하였다. 특히 본 시료는 여 성 암의 대표적인 유방암과 자궁경부암의 암세포 성장저지효과가 탁월하였다. 한편, 사용한 4가지 암세포주 중 유일하게 QR을 가지고 있는 HepG2를 이용한 암 예방지표인 QR 효소 유도 활성 여부를 측정한 결과 분획물 첨가농도를 10, 20, 30 및 40 Ug/mL로 첨가하였을 때 GFMM 의 첨가농도 20 jig/mL 에서 대조군에 비해 약 2배 이상의 높은 QR 유도효과를 나타내어 최종농도 40 Ug/mL에서는
후속연구
- 58배의 효과를 나타냄으로서 이와 같은 결과도 일반적으로 본 연구실에 서 사용한 해조류 분획물 첨가량의 약 1/3에 해당되 므로 아주 높은 농도 의존적인 QR 유도활성효과를 나타내었다. 특히 극성 용매층인 GFMM에서 QR 유도효과가 제일 높았으므로 이 분획 층에서의 quinone reductase inducer가 존재함 을 추정할 수 있고 앞으로 더욱더 심도 있는 연구를 통해 불등가사리의 생리활성 물질의 구조를 추적, 동정함으로서 식품산업에 있어서의 항 발암 효과를 지닌 기능성 식품의 산업화개발에 매우 중요한 자료가 될 수 있을 것으로 사료된다.
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