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문제 정의
- 그 중 death receptor pathway에서는 Fas (CD95/Apo1) 및 이와 결합하는 ligand인 FasL가 널리 알려져 있다[17,21]. 따라서 본 연구에서는 MEGF 처리에 의한 백혈병세포의 apoptosis 유발에 이러한 death receptor를 경유할 가능성의 여부를 조사하였다. 이를 위하여 Fas 및 FasL 두 유전자의 mRAN 및 단백질 발현에 미치는 MEGF의 영향을 조사한 결과는 Fig.
- 본 연구에서는 다양한 인체암세포의 증식에 미치는 등불가사리 메탄올 추출물(MEGF)의 영향을 조사하였다. MEGF는 처리 농도의존적으로 암세포의 형태적변이 및 증식억제가 효과를 보여주었으며, 특히 백혈병세포에서 가장 높은 감수성을 보여주었다.
- 본 연구에서는 우리나라를 포함한 세계적으로 널리 분포하고 있으며, 항돌연변이 효능이 우수하여 항암활성효능이 높을 것으로 예상되는 해조류의 한 종류인 홍조식물 풀가사리과의 불등가사리(G.loiopeltis furcata)[7,8,13,20]에 함유된 항암/암예방 후보물질의 도출을 위하여 불등가사리의 메탄올 추출물이 인체 암세포의 증식에 미치는 영향을 조사하였으며, 특히 불등가사리 메탄올 추출물에 높은 감수성을 보이는 인체백혈병세포를 대상으로 암세포 증식 억제 효과가 apoptosis 유발과 연관성이 있는지의 여부를 조사하였다.
제안 방법
- MEGF 처리에 의한 암세포의 apoptosis 유발 여부 확인을 위한 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 정상 및 MEGF가 처리된 배지에서 48시간 동안 배양된 세포를 모은 다음 37% formaldehyde 용액과 PBS를 1 : 9의 비율로 섞은 fixing solution을 모아진 세포에 500 ㎕ 첨가하여 잘 섞어준 후, 실온에서 10분 동안 고정하였다. 2,000 rpm으로 5분간 원심 분리한후 상층액을 제거하고 PBS 200 ㎕ 를 넣어서 충분히 섞은 후, slide glass 위에 120 ㎕ 정도 떨어뜨려 1200 rpm에서 5분간 cytospin하였다.
- MEGF의 처리농도에 따라 가장 증식억제 효과가 크게 나타났던 인체 백혈병 세포인 U937을 이용하여서 그 증식 억제 효과가 apoptosis 유발과 상관성이 있는지를 조사하였다. Fig.
- MEGF의 처리에 의한 백혈병세포의 증식억제 현상이 종양억제 유전자 또는 세포주기 조절 억제인자들의 발현 변화와 상관성이 있는지의 여부를 조사하기 위하여 현재까지 알려진 종양억제 유전자 중 가장 중요한 p53 및 전체적인 세포주기 조절에 중요한 역할을 하는 cyclin-dependent kinase (Cdk) inhibitor p21(WAF1/CIP1)의 발현[5,12]에 미치는 MEGF의 영향을 조사하였다. Fig.
- 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 ethi- dium bromide (EtBr, Sigma)을 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하고 Picture works' photo enhancer를 이용하여 사진 촬영을 하였다. RT-PCR을 이용하여 분석을 시도한 유전자의 종류는 Table 1에 나타낸 바와 같으며, 이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 internal control로 사용하였다.
- 각 PCR 산물들을 양적 차이를 확인하기 위하여 1x TAE buffer로 1% agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 6x agarose gel loading buffer (BIONEER, Korea)를 섞어서 20 μl씩 well에 loading 한 후 100 V로 전기영동을 하였다.
- 몇 가지 인체암세포의 증식에 미치는 불등가사리 메탄올 추출물(MEGF)의 영향을 비교하기 위하여 인체 전립선암세포(PC-3), 대장암세포(HT-29), 폐암세포(A549), 위암세포(AGS) 및 인체 백혈병세포(U937)에 MEGF를 다양한 농도(20~150 μg/ml)로 48시간동안 처리한 후 각 암세포들의 형태를 정상배지에서 자란 암세포와 먼저 비교하였다(Fig. 1).
- , Carlsbad, CA, USA)를 4℃에서 1시간 동안 처리하여 total RNA를 각 처리 농도 별로 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, 관련된 primer, DEPC water 그리고 ONE-STEP RT-PCR PreMix Kit (Intron, Korea)를 넣고 Mastercycler gradient (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 증폭하였다. 각 PCR 산물들을 양적 차이를 확인하기 위하여 1x TAE buffer로 1% agarose gel을 만들고 well 당 각각의 primer에 해당하는 PCR 산물에 6x agarose gel loading buffer (BIONEER, Korea)를 섞어서 20 μl씩 well에 loading 한 후 100 V로 전기영동을 하였다.
- 5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), 5 mM dithiothreitol (DTT)]로 용해한 후, 고속원심분리기를 이용하여 14,000 rpm에 15 분간 세포내 잔사물을 분리시킨 다음 동량의 단백질을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 전이시킨 후, 특정 단백질에 대한 항체와 그에 대한 이차 항체 반응을 실시한 후 암실에서 Enhanced Chemiluminoesence (ECL) 용액(Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 처리시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다. 본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc.
- 세포 배양용 6 well plate에 각 암세포의 성장 속도에 따라 적정량 분주하여 24시간 동안 안정화시킨 다음 MEGF를 적정 농도로 배지에 희석 처리하여 다시 48시간 동안 배양한 후, 위상차 현미경(inverted microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 200배의 배율로 각 암세포주의 농도에 따른 형태의 변화를 관찰하였다.
- 세포 배양용 6 well plate에 각 암세포주를 적정량 분주하여 24시간 동안 안정화시킨 다음 MEGF를 적정량 처리하여 48시간 동안 재배한 후 각 well의 배지를 깨끗하게 제거한 후 tetrazolium bromide salt (MTT, Amresco, Solon, OH, USA)를 0.5 mg/ml 농도가 되게 희석하여 2 ml씩 분주하고 3시간 동안 CO2 incubator에서 빛을 차단하여 반응시킨 다음 MTT 시약을 제거하고 DMSO로 각 well에 생성된 formazin을 각각 동량으로 녹인 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 세 번을 하였으며, 그에 대한 평균값과 표준 오차를 Sigma Plot 4.
- Louis, MO, USA) 용액을 세포가 고정된 slide glass 위에 적당량을 떨어뜨린 후 빛을 차단하고 실온에서 염색시켰다. 약 10분 가량 염색시킨 후, 형광 현미경(Carl Zeiss)을 이용하여 400배의 배율로 각 MEGF 처리 농도에 따른 인체 백혈병 세포의 핵의 형태 변화를 관찰하였다.
- 정상 및 MEGF을 처리한 배지에서 48시간 동안 배양시킨 각 암세포주를 2,000 rpm에 5분간 원심분리하여 상층의 배지를 버리고 세포 pallet만 모아서 PBS 1 ml로 충분히 재부유 시킨 후 2,000 rpm으로 5분간 원심분리 한 후 상층의 PBS만 버리고 남은 세포 pallet에 CycleTEST PLUS DNA REAGENT KIT (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 고정 및 propidium iodide (PI, concentration, 50ug/ml; Sigma) 염색액을 처리하여 암실, 4℃에서 15분 동안 염색하였다. 염색 후 DNA flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 대조군 및 MEGF 처리군을 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 ModiFit LT (Becton Dickinson) program으로 분석하였다.
- 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 gel을 ethi- dium bromide (EtBr, Sigma)을 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하고 Picture works' photo enhancer를 이용하여 사진 촬영을 하였다.
- 정상 및 MEGF을 처리한 배지에서 48시간 동안 배양시킨 각 암세포주를 2,000 rpm에 5분간 원심분리하여 상층의 배지를 버리고 세포 pallet만 모아서 PBS 1 ml로 충분히 재부유 시킨 후 2,000 rpm으로 5분간 원심분리 한 후 상층의 PBS만 버리고 남은 세포 pallet에 CycleTEST PLUS DNA REAGENT KIT (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 사용하여 고정 및 propidium iodide (PI, concentration, 50ug/ml; Sigma) 염색액을 처리하여 암실, 4℃에서 15분 동안 염색하였다. 염색 후 DNA flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 대조군 및 MEGF 처리군을 적용시켜 형광반응에 따른 histogram을 ModiFit LT (Becton Dickinson) program으로 분석하였다.
대상 데이터
- , Arlington Heights, IL, USA)을 처리시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다. 본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 및 Calbiochem (Cambridge, MA, USA)에서 구입하였으며, 2차 항체로 사용된 peroxidase-labeled donkey anti-rabbit 및 peroxidase-labeled sheep anti-mouse immunoglobulin은 Amersham Life Science에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용한 인체 전립선암세포인 PC-3, 대장암세포인 HT-29, 폐암세포인 A549, 위암세포인 AGS 그리고 백혈병세포인 U937은 생명공학연구소(KRIBB, Taejeon, Korea)에서 분양 받았으며, 세포의 배양을 위해 10%의 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)과 1%의 penicillin-streptomycin 등이 포함된 RPMI-1640 및 DMEM 배지(Gibco BRL)를 사용하여 37℃, 5% CO2조건하의 CO2 incubator에서 배양하였다. 불등가사리는 전라남도 무안군에 위치한 (주)삼일물산에서 제공받았으며, 메탄올 추출물(methanol extracts of G.
- incubator에서 배양하였다. 불등가사리는 전라남도 무안군에 위치한 (주)삼일물산에서 제공받았으며, 메탄올 추출물(methanol extracts of G. furcata, MEGF)을 얻기 위하여 건조 후 메탄올을 첨가하고 37℃에서 진탕한 다음 4시간 동안 3회 반복 추출하고 회전식 진공 농축기로 감압 농축시킨 후 동결 건조하였다[13].
데이터처리
- 5 mg/ml 농도가 되게 희석하여 2 ml씩 분주하고 3시간 동안 CO2 incubator에서 빛을 차단하여 반응시킨 다음 MTT 시약을 제거하고 DMSO로 각 well에 생성된 formazin을 각각 동량으로 녹인 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 세 번을 하였으며, 그에 대한 평균값과 표준 오차를 Sigma Plot 4.0 프로그램(SPSS Ins.)으로 구하였다.
성능/효과
- MEGF의 처리농도에 따라 가장 증식억제 효과가 크게 나타났던 인체 백혈병 세포인 U937을 이용하여서 그 증식 억제 효과가 apoptosis 유발과 상관성이 있는지를 조사하였다. Fig. 3 및 Fig. 4B의 flow cytometry 결과에서 나타난 것과 같이 정상 배지에서 자란 U937 세포의 주기와 비교하였을 경우 MEGF를 처리한 세포에서 처리 농도 의존적으로 세포의 사멸이 일어난 집단으로 알려진 sub-G1기가 상당량 증가하는 것을 확인하였으며, 각 세포 주기의 감소는 sub-G1기의 증가와 관련지어 보면 별다른 변화는 관찰되지 않았다. 이와 같은 sub-G1기의 증가가 MEGF처리에 의한 apoptosis에 의한 것인지 직접 조사하기 위하여 DAPI staining을 실시한 결과는 Fig.
- MEGF의 처리에 의한 백혈병세포의 증식억제 현상이 종양억제 유전자 또는 세포주기 조절 억제인자들의 발현 변화와 상관성이 있는지의 여부를 조사하기 위하여 현재까지 알려진 종양억제 유전자 중 가장 중요한 p53 및 전체적인 세포주기 조절에 중요한 역할을 하는 cyclin-dependent kinase (Cdk) inhibitor p21(WAF1/CIP1)의 발현[5,12]에 미치는 MEGF의 영향을 조사하였다. Fig. 5A 및 B의 결과는 RT-PCR 및 Western blotting에 의한 p53 및 p21의 발현에 미치는 MEGF의 영향을 조사한 것으로서, p53의 상대적인 발현량은 정상 배지에서 배양된 경우와 MEGF처리군에서 전사 및 번역 수준에서 큰 변화가 관찰되지 않았으나, p21의 경우는 전사 및 번역 수준에서 MEGF 처리 농도 의존적으로 다소 증가되었다. 이는 MEGF 처리에 의한 백혈병세포의 증식억제가 p53 비의존적인 p21의 발현 증가와 연관성이 있으며, MEGF가 p53 유전자가 결손된 암세포에서도 항암효능이 매우 높을 것이라는 것으로 의미하며 이에 관한 보다 구체적인 연구가 요구된다.
- 본 연구에서는 다양한 인체암세포의 증식에 미치는 등불가사리 메탄올 추출물(MEGF)의 영향을 조사하였다. MEGF는 처리 농도의존적으로 암세포의 형태적변이 및 증식억제가 효과를 보여주었으며, 특히 백혈병세포에서 가장 높은 감수성을 보여주었다. 따라서 백혈병세포의 증식억제 효과가 apoptosis 유발과 연관성이 있는지를 flow cytometry 분석 및 DAPI staining 법으로 조사한 결과, MEGF 처리에 의한 백혈병세포의 증식억제는 세포주기 교란과 무관한 apoptosis 유발에 의한 것임을 sub-G1기 세포의 빈도 증가 및 apoptotic body 형성의 증가 등으로 확인하였다.
- 4A에 나타낸 바와 같다. 결과에서 알 수 있듯이 정상 배지에서 배양된 U937 세포에서는 핵의 형태가 뚜렷하고 밝게 염색되었지만, MEGF를 처리한 배지에서 배양된 세포는 핵 내의 chromatin이 응축에 의한 apoptotic body의 출현이 MEGF 처리 농도의존적으로 증가됨을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 MEGF의 처리에 의한 백혈병세포에서의 증식 억제 효과가 apoptosis의 유발과 직접적인 연관성이 있음을 의미하여 주는 것이다.
- 6A에 나타낸 바와 같이 Fas의 발현량은 MEGF의 처리 농도 의존적으로 대조군에 비해 증가하였지만 FasL의 발현량은 큰 변화가 없었다. 그러나 단백질 발현에서는 MEGF의 처리 농도 의존적으로 Fas 및 FasL 모두 매우 증가하는 것을 확인하였다. 즉 MEGF의 처리에 의한 인체 백혈병 세포 U937에서의 증식억제효과는 번역 수준에서 Fas/FasL death receptor를 경유하는 apoptosis의 유발과 상관관계가 있음을 의미한다.
- 먼저 전립선암세포 PC-3과 폐암세포 A549에서는 세포의 모양이 MEGF의 처리 농도가 증가할수록 수상돌기와 같은 형태가 점점 신장되기 시작하면서 마지막 처리 농도에서는 세포의 부착력 상실하는 등의 심한 형태적인 변형을 보였으며 세포의 밀도 역시 처리 농도 의존적으로 줄어들었다. 그리고 대장암세포인 HT-29 및 위암세포인 AGS에서는 MEGF 처리 농도가 증가할수록 부착력의 상실이 증가함에 따라 세포가 성장 배지에 부유하여 죽어가며 따라서 그 밀도가 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 백혈병세포인 U937에서는 세포밀도가 정상 배지에서 자란 세포와 비교하였을 때 MEGF의 처리 농도 의존적으로 상당히 감소하는 것을 관찰하였으며, 세포의 사멸에 의한 잔존물들이 배양된 플라스크 상에서 처리 농도 의존적으로 점차 늘어나는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 동일 조건에서 MTT assay를 이용하여 정상 배지에서 자란 암세포와 MEGF를 희석 처리한 배지에서 자란 암세포의 상대적인 성장률을 비교하였을 때, Fig. 2의 결과에서와 같이 PC-3, HT-29 및 A549 암세포에서보다 AGS와 U937 암세포에서 상대적인 성장률이 매우 감소한 것을 확인할 수 있었으며, MEGF를 150 μg/ml 농도로 처리한 실험군에서는 대조군과 비교하였을 때 상대적인 성장률이 실험된 모든 암세포주에서 50% 미만으로 감소한 것을 관찰할 수 있었다.
- MEGF는 처리 농도의존적으로 암세포의 형태적변이 및 증식억제가 효과를 보여주었으며, 특히 백혈병세포에서 가장 높은 감수성을 보여주었다. 따라서 백혈병세포의 증식억제 효과가 apoptosis 유발과 연관성이 있는지를 flow cytometry 분석 및 DAPI staining 법으로 조사한 결과, MEGF 처리에 의한 백혈병세포의 증식억제는 세포주기 교란과 무관한 apoptosis 유발에 의한 것임을 sub-G1기 세포의 빈도 증가 및 apoptotic body 형성의 증가 등으로 확인하였다. 또한 MEGF 처리에 의한 백혈병세포의 증식억제 및 apoptosis 유발은 p53 비의존적인 p21의 발현 증가 및 Fas/FasL system의 발현 증가와 연관성이 있음을 알 수 있었다.
- 따라서 백혈병세포의 증식억제 효과가 apoptosis 유발과 연관성이 있는지를 flow cytometry 분석 및 DAPI staining 법으로 조사한 결과, MEGF 처리에 의한 백혈병세포의 증식억제는 세포주기 교란과 무관한 apoptosis 유발에 의한 것임을 sub-G1기 세포의 빈도 증가 및 apoptotic body 형성의 증가 등으로 확인하였다. 또한 MEGF 처리에 의한 백혈병세포의 증식억제 및 apoptosis 유발은 p53 비의존적인 p21의 발현 증가 및 Fas/FasL system의 발현 증가와 연관성이 있음을 알 수 있었다. 이상의 결과들은 인체 암세포, 특히 백혈병세포에서 MEGF의 항암작용을 이해하는데 중요한 자료가 될 것이고 나아가 MEGF 내 함유된 생리활성 물질의 분리 및 항암적용 연구를 위한 중요한 기초 자료로 활용될 것이다.
- 그리고 대장암세포인 HT-29 및 위암세포인 AGS에서는 MEGF 처리 농도가 증가할수록 부착력의 상실이 증가함에 따라 세포가 성장 배지에 부유하여 죽어가며 따라서 그 밀도가 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 백혈병세포인 U937에서는 세포밀도가 정상 배지에서 자란 세포와 비교하였을 때 MEGF의 처리 농도 의존적으로 상당히 감소하는 것을 관찰하였으며, 세포의 사멸에 의한 잔존물들이 배양된 플라스크 상에서 처리 농도 의존적으로 점차 늘어나는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1).
- 1). 먼저 전립선암세포 PC-3과 폐암세포 A549에서는 세포의 모양이 MEGF의 처리 농도가 증가할수록 수상돌기와 같은 형태가 점점 신장되기 시작하면서 마지막 처리 농도에서는 세포의 부착력 상실하는 등의 심한 형태적인 변형을 보였으며 세포의 밀도 역시 처리 농도 의존적으로 줄어들었다. 그리고 대장암세포인 HT-29 및 위암세포인 AGS에서는 MEGF 처리 농도가 증가할수록 부착력의 상실이 증가함에 따라 세포가 성장 배지에 부유하여 죽어가며 따라서 그 밀도가 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- 2의 결과에서와 같이 PC-3, HT-29 및 A549 암세포에서보다 AGS와 U937 암세포에서 상대적인 성장률이 매우 감소한 것을 확인할 수 있었으며, MEGF를 150 μg/ml 농도로 처리한 실험군에서는 대조군과 비교하였을 때 상대적인 성장률이 실험된 모든 암세포주에서 50% 미만으로 감소한 것을 관찰할 수 있었다. 이와 같이 MEGF는 다양한 암세포에서 약간씩의 감수성에 따른 차이를 보이지만 처리 농도가 증가함에 따라서 세포의 증식억제효과를 가지는 것을 실험결과 알 수 있었으며, 본 연구에 사용한 암세포 중 백혈병세포주인 U937 세포에서 가장 감수성이 크다는 것 역시 확인할 수 있었으나, 동일 조건에서 정상 간세포의 경우 상대적인 성장률은 큰 변화가 없었다[13].
후속연구
- 5A 및 B의 결과는 RT-PCR 및 Western blotting에 의한 p53 및 p21의 발현에 미치는 MEGF의 영향을 조사한 것으로서, p53의 상대적인 발현량은 정상 배지에서 배양된 경우와 MEGF처리군에서 전사 및 번역 수준에서 큰 변화가 관찰되지 않았으나, p21의 경우는 전사 및 번역 수준에서 MEGF 처리 농도 의존적으로 다소 증가되었다. 이는 MEGF 처리에 의한 백혈병세포의 증식억제가 p53 비의존적인 p21의 발현 증가와 연관성이 있으며, MEGF가 p53 유전자가 결손된 암세포에서도 항암효능이 매우 높을 것이라는 것으로 의미하며 이에 관한 보다 구체적인 연구가 요구된다.
- 또한 MEGF 처리에 의한 백혈병세포의 증식억제 및 apoptosis 유발은 p53 비의존적인 p21의 발현 증가 및 Fas/FasL system의 발현 증가와 연관성이 있음을 알 수 있었다. 이상의 결과들은 인체 암세포, 특히 백혈병세포에서 MEGF의 항암작용을 이해하는데 중요한 자료가 될 것이고 나아가 MEGF 내 함유된 생리활성 물질의 분리 및 항암적용 연구를 위한 중요한 기초 자료로 활용될 것이다.
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