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문제 정의
- 본 연구는 천연의 (-)-l-octen-3-ol을 생산하기 위하여 고함량의 linoleic acid를 함유하고 있는 국내산 홍화유와 함께 국내에서 생산되고 있는 다양한 버섯의 LOX와 HPOL를 이용하여 생물전환법으로 선택적인 광활성을 지닌 천연 (-)-l-octen-3-ol의 생물공정을 개발하는데 목적을 두고 있다. 개발된 생물공정의 생산성은 fermenter에서 검토하였다.
가설 설정
- 2) The experimental condition was the same at 4℃. The stirred speed changed from 500 rpm to 800 rpm.
- 3)l-octen~3-ol was Quantitated by using gas chromatography.
제안 방법
- (-)-l-octen-3-ol을 대량생산하기 위한 상업형 생물공정 을 개발하기 위하여 다량의 버섯을 5-liter jar fermenter를 이용하여 개발하였다. 5-liter jar fermenter에 500 mL의 인 산 완충액 과 500 mL의 증류수, 가수분해된 홍화유 20 mL를 첨가한 후 신선하게 공급된 양송이 버섯을 분쇄기를 이용하여 분쇄하여 첨가하고 양송이 버섯의 LOX의 활성을 높이기 위하여 공기(2.
- 10-hydroxyperoxidee HPOL에 의해 (-) octen-3-ol로 분해되었다. (-)T-octen-3-。1을 상업적으로 생산하기 위하여 5-liter jar fermenter와 충남 부여 에서 수 확된 Agaricus bisporus 자실체를 이용하여 개발되었다. (-) -l-octen-3-이은 4℃, pH 6.
- 5 liter jar fermenter(Biotron, Korea)에 500 mL의 인산용 액 (pH 6.5)과 500 mL의 증류수, 가수분해된 홍화유 20 mL을 첨가한 후, grinder(Hanil, Korea)■> 이용해 1 kg의 버섯을 5분간 분쇄 하여 첨 가하였다. 전체 working volumee 2 liter 로 하여, 분쇄된 버섯을 첨가한 후 공기 (2.
- (-)-l-octen-3-ol을 대량생산하기 위한 상업형 생물공정 을 개발하기 위하여 다량의 버섯을 5-liter jar fermenter를 이용하여 개발하였다. 5-liter jar fermenter에 500 mL의 인 산 완충액 과 500 mL의 증류수, 가수분해된 홍화유 20 mL를 첨가한 후 신선하게 공급된 양송이 버섯을 분쇄기를 이용하여 분쇄하여 첨가하고 양송이 버섯의 LOX의 활성을 높이기 위하여 공기(2.0 v/v/m)를 주입하였다. 반응 중 pH는 25% NaOH-1- 이용하여 6.
- 농축된 시 료는 ethyl ace- tate로 희 석 시 켜 gas chromatography로 분석하였다. GC 분석을 위하여 Rtx-1 capillary column(60 m, crossband 100% dimethyl polysiloxanecolumn, Phenomes, USA)과 helium carrier gas를 사용하였으며, column의 온도는 100℃에서 200℃까지 5℃/min으로 높였으며, FID detector와 injector 의 온도는 각각 320℃로 하였다(7). 생물전환을 이용한 l-octen-3-ol의 생산은 GC-MS(Supelco, Supelcowas™-10, USA)를 이용하여 확인하였다.
- 생물전환을 이용한 l-octen-3-ol의 생산은 GC-MS(Supelco, Supelcowas™-10, USA)를 이용하여 확인하였다. GC/MS 분석을 위하여 fused silica capillary column(30 m x 0.25 mm x 0.25 Um)과 helium carrier gas를 사용하였으며, column의 온도는 70℃에서 240℃까지 3℃/min으로 높였으며, FID detector와 injector 의 온도는 각각 250℃로 하였다.
- 가수분해된 홍화유는 65℃로 가열하여 효소 반응을 정 지 시 킨 후, 지 방산을 함유하고 있는 상등액 을 회수하여 기질로 이용하였다. 가수분해된 홍화유 상등액의 linoleic acid의 함량은 methylation후 gas chromatography (GC) 분석을 이용하여 정량하였다.
- 본 연구는 천연의 (-)-l-octen-3-ol을 생산하기 위하여 고함량의 linoleic acid를 함유하고 있는 국내산 홍화유와 함께 국내에서 생산되고 있는 다양한 버섯의 LOX와 HPOL를 이용하여 생물전환법으로 선택적인 광활성을 지닌 천연 (-)-l-octen-3-ol의 생물공정을 개발하는데 목적을 두고 있다. 개발된 생물공정의 생산성은 fermenter에서 검토하였다.
- 시중에서 구입한 대부분의 홍화유 는 oleic acid를 다량으로 함유하고 있어, 경북 의성 홍화원을 통해 직접 홍화씨를 구매, 주문 생산하여 공급 받았다. 경 북 의 성 홍화원 에서 공급받은 홍화유를 lipase(AMANO, Japan) 로 가수분해 시 킨 후, 추출된 불포화 지 방산을 methyl ester화 하여 GC 분석과 산가 정 량법으로 분석하여 linoleic acid 함 량을 분석하였다. 경북 의성 홍화유의 전체 지방산의 분포는 palmitic acid(9~10%), oleic acid(10~15%), linoleic acid (>75%)로 분석되었다(Fig.
- 유기 용매증은 무수황산나트륨(NazSOQ 으로 수분을 제거 한 후 농축시 켰다. 농축된 시 료는 ethyl ace- tate로 희 석 시 켜 gas chromatography로 분석하였다. GC 분석을 위하여 Rtx-1 capillary column(60 m, crossband 100% dimethyl polysiloxanecolumn, Phenomes, USA)과 helium carrier gas를 사용하였으며, column의 온도는 100℃에서 200℃까지 5℃/min으로 높였으며, FID detector와 injector 의 온도는 각각 320℃로 하였다(7).
- 반응 온도를 4℃로 유지하기 위하여 추가적으로 얼음을 첨가한 후, 가수분해된 홍화유 5 mL을 더 첨가하고 15분 더 반응시 켰다. 생물전환 반응 후 50% 황산(H2SO4)을 이용하여 반응 액의 pH를 4.0으로 낮춘 후, 원심 분리 (5,000 rpm X 10 min, 4℃)하여 상등액을 회수한 후, GC를 이용하여 l-octen-3-ol 의 양을 정량하였다.
- 생물전환에 이용되는 버섯은 LOX와 HPOL의 활성을 최 대로 유지하기 위하여 석성 버섯 농가의 협조로 실험 전날 수확되어 바로 배송된 후 당일 실험에 이용하였다. 생물전환 에 미치는 pH의 영향을 연구하기 위하여 신선한 상태로 공 급된 250 g의 양송이 버 섯을 ITiter Waring blend jar에 첨 가 한 후, 5 mL의 가수분해된 홍화유를 125 mL의 각각의 초산 완충액 (0.2 M, pH 5.0), 인산완충액 (0.2 M, pH 6.5) 혹은 borate 완충액 (0.2 M, pH 9.0)과 혼합하여 15분간 최대 속도로 버 섯 을 분쇄하며 반응을 진행시킨 후 l-octen-3-ol의 생산량을 비교하였다. 양송이 버섯에서 추출된 LOX와 HPOL의 최적 pH 범위는 5.
- GC 분석을 위하여 Rtx-1 capillary column(60 m, crossband 100% dimethyl polysiloxanecolumn, Phenomes, USA)과 helium carrier gas를 사용하였으며, column의 온도는 100℃에서 200℃까지 5℃/min으로 높였으며, FID detector와 injector 의 온도는 각각 320℃로 하였다(7). 생물전환을 이용한 l-octen-3-ol의 생산은 GC-MS(Supelco, Supelcowas™-10, USA)를 이용하여 확인하였다. GC/MS 분석을 위하여 fused silica capillary column(30 m x 0.
- 분리 된 지 방산은 boron trifluoride methanol complex(Lancaster, England)와 혼합 하여 100℃에서 5분간 가열하여 methyl ester로 변환시 켰다. 홍화유내 linoleic acid의 함량은 gas chromatography(Donam, Model DS 6200, Korea)로 확인하였다.
- 홍화유의 linoleic acid의 함량을 측정 하기 위하여 홍화유 (20%)와 lipase-MY(1.0%, 홍화유 기준)를 0.2 M의 인산용 액(pH 6.5)에 용해시켜 37℃에서 4시간 반응시켜 가수분해 시킨 후, 65℃에서 30분간 가열하여 효소 반응을 중지하였다. 가수분해된 지 방산은 50% 황산(H2SQ1)으로 산성화(pH 4.
대상 데이터
- 소비 자의 천연 버 섯향에 대한 선호도가 상승함에 따라 유기합성으로 만들어지는 광활성 이성질체를 포함하고 있는 (±)-l-octen-3-ol와 다르게 더 강한 향의 강도를 갖는 천연 광활성의 (-)-l-octen-3-ol 생산에 대한 연구가 필요하다. (-)T-octen-3-oIe 호기성 상태에서 시장에서 구입 한 버섯으로 추출된 lipoxygenase(LOX)와 hydroperoxide Lyase(HPOL)을 이용하여 생합성되었다. 75%이상의 linoleic acid를 포함하고 있는 경 북 의 성 에서 생산된 홍화유는 lipase 를 이용하여 가수분해하였다.
- 버섯을 이용한 생물전환반응 schemee 다음과 같다. LOX 와 HPOL의 효소의 활성을 지닌 버섯을 선별하기 위하여 시장에서 구입한 버섯과 석성 버섯 조합에서 공급된 신선한 버섯은 불순물을 제거한 깨끗한 상태에서 4℃에서 Waring blender(Waring, USA)을 이용하여 분쇄하였다. ITiter의 blender jar에 250 g의 버섯을 125 mL의 각각의 0.
- 버섯의 신선도를 유지하기 위하여 매 실험에 필요한 양송이 버섯은 석성 버섯 농장에서 전날 수확되어 공급되었다. 반응물의 추출은 ethyl acetate (대정)을 사용하였다. 지방산의 methylation 은 boron tri fluoride methanol complex(Lancaster, England)을 이용하였다.
- 실험에 이용한 느타리 버 섯 (Reuc切s ostreatius, 경기 양주), 새송이 버섯(Reutofus eryngii, 강원 원주), 팽이버섯(F/arn- mulina velutipes, 충북 제 천)은 가락동 농산물 시 장에서 구 입 하였으며 , 양송이버 섯(Agaricus bisporus)은 충남 부여 의 석성 버섯농장에서 공급 받았다. 버섯의 신선도를 유지하기 위하여 매 실험에 필요한 양송이 버섯은 석성 버섯 농장에서 전날 수확되어 공급되었다. 반응물의 추출은 ethyl acetate (대정)을 사용하였다.
- 생물전환에 이용되는 버섯은 LOX와 HPOL의 활성을 최 대로 유지하기 위하여 석성 버섯 농가의 협조로 실험 전날 수확되어 바로 배송된 후 당일 실험에 이용하였다. 생물전환 에 미치는 pH의 영향을 연구하기 위하여 신선한 상태로 공 급된 250 g의 양송이 버 섯을 ITiter Waring blend jar에 첨 가 한 후, 5 mL의 가수분해된 홍화유를 125 mL의 각각의 초산 완충액 (0.
- 에서 구입 하였다. 실험에 이용한 느타리 버 섯 (Reuc切s ostreatius, 경기 양주), 새송이 버섯(Reutofus eryngii, 강원 원주), 팽이버섯(F/arn- mulina velutipes, 충북 제 천)은 가락동 농산물 시 장에서 구 입 하였으며 , 양송이버 섯(Agaricus bisporus)은 충남 부여 의 석성 버섯농장에서 공급 받았다. 버섯의 신선도를 유지하기 위하여 매 실험에 필요한 양송이 버섯은 석성 버섯 농장에서 전날 수확되어 공급되었다.
- 일반 홍화유는 시장에서 구입 하고, 고함량의 linoleic acid 를 함유하고 있는 홍화유는 경북의성의 경북의성 홍화식품 에서 주문 생산하여 사용하였다. 홍화유의 가수분해를 위한 lipase(Amano-MY)는 Amano사(Japan)에서 구입하였다.
- 일반 홍화유는 시장에서 구입 하고, 고함량의 linoleic acid 를 함유하고 있는 홍화유는 경북의성의 경북의성 홍화식품 에서 주문 생산하여 사용하였다. 홍화유의 가수분해를 위한 lipase(Amano-MY)는 Amano사(Japan)에서 구입하였다. Linoleic acid(95%)는 ICN Chemical Co.
성능/효과
- 생물전환공정 중 온도 와 교반속도가 l-octen-3-ol에 미치는 영향은 Table 2에 요 약되었다. l-octen-3-ol의 생물전환반응은 4℃에서 가장 많은 생산량을 보였으며 교반속도는 큰 차이를 보이 진 않았지 만 800 rpm에서 가장 높게 나타났다. 최적 생물전환반응 조 건에서 748 mg/버섯 kg이 생합성되었다.
- 이러한 결과는 Chen과 Wu(13)의 결과와 일치한다. 또한 LOX와 HPOL의 활성은 양송이 버섯의 자실체의 갓을 이용하였을 경우 가장 높았으며, 양송이 버섯 의 자실 체 자루 부분을 이 용할 경우 l-octen-3-ol의 생산량 이 미비하였다(자료 미제시). 이러한 결과는 양송이 버섯이 수확 후 자실체의 조직이 손상되거나 분쇄될 경우 버섯 특유 의 향을 형성하는 보고와 일치한다(5).
- 신선도가 떨어진 버섯의 균질액에서는 LOX 및 HPOL의 활성이 나타나지 않아 l-octen-3-ol。] 생성되 지 않았다. 또한 버섯의 균질액을 상온에서 분쇄하거나, 저 온에서 분쇄된 균질액을 상온에 방치할 경우 빠른 시간 내에 LOX 및 HPOL의 활성을 잃어버려 l-octen-3-ol의 생산성 이 현저하게 떨어졌다(자료 미제시). 이러한 결과는 양송이 버섯의 LOX 및 HPOL이 구조적으로 불안정하여 급격하게 불활성화 되었다는 보고와 일치한다(10T2).
- l-octen-3-ole 버섯의 LOX 및 HPOL의 작용에 의하여 불포화 지방산인 linoleic acid로부터 생성되는데, LOX 및 HPOL의 양은 버섯의 종류와 버섯 의 신선도에 따라 활성이 다르다. 양송이 버섯(충남 .부여), 느타리 버섯(경기 양주), 새송이 버섯(강원 원주), 팽이버섯 (충북 제천)의 균질액과 가수분해된 홍화유와 반응시 켜 얻어진 l-octen-3-ol을 분석한 결과, 양송이 버섯을 이용할 경우 상대적으로 가장 많은 l-octen-3-ol이 생합성됨을 알 수 있었다(Table 1). l-octen-3-ol의 생합성은 GC-MS로 확인 하였다(Fig.
- 0)과 혼합하여 15분간 최대 속도로 버 섯 을 분쇄하며 반응을 진행시킨 후 l-octen-3-ol의 생산량을 비교하였다. 양송이 버섯에서 추출된 LOX와 HPOL의 최적 pH 범위는 5.5에서 7.0 사이로 pH 6.5에서 가장 많은 활성을 보였다(자료 미제시). 이러한 결과는 Chen과 Wu(13)의 결과와 일치한다.
후속연구
- l-octen-3-ole 버섯향의 성분 중 가장 중요한 방향 물질 이다. 소비 자의 천연 버 섯향에 대한 선호도가 상승함에 따라 유기합성으로 만들어지는 광활성 이성질체를 포함하고 있는 (±)-l-octen-3-ol와 다르게 더 강한 향의 강도를 갖는 천연 광활성의 (-)-l-octen-3-ol 생산에 대한 연구가 필요하다. (-)T-octen-3-oIe 호기성 상태에서 시장에서 구입 한 버섯으로 추출된 lipoxygenase(LOX)와 hydroperoxide Lyase(HPOL)을 이용하여 생합성되었다.
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