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문제 정의
- 그러나, 조직배양은 자연환경의 제약을 받지 않고도 식물이 생산하는 생리활성물질을 안정적으로 생산할 수 있으며 기내의 최적 환경에서 원하는 시기에 대량생산이 가능하므로 상업적으로 중요하다고 할 수 있다. 본 연구에서는 thiamine-HCI 과 polyvinylpyrrolidone (PVP)가 차나무 잎 캘러스의 생장과 카테킨 함량에 미치는 영향을 분석하여 이들 화합물이 캘러스 내 카테킨류의 함량과 조성의 변화를 확인한 바, 카테킨류의 효율적 생산을 위한 방안이 될 것으로 판단하여 보고하고자 한다.
제안 방법
- Thiamine-HCl과 PVP가 첨가된 캘러스 증식 배지에서 배양된 캘러스의 카테킨류의 함량을 분석하여 비교하였다 (Table 5). HPLC로 확인한 결과, Thiamine-HCl 또는 PVP를 첨가하여 배양한 캘러스에는 배양조건에 따라 차이가 있으나 EC, ECG, EGC, EGCG 등 4가지 성분이 모두 포함되어 있다.
- 0 mg/L TDZ가 첨가된 MS 배지)에 치상하여 증식하였다. Thiamine-HCl과 PVP가 캘러스의 생장에 미치는 영향을 조사하기 위해 동일한 배지에 thiamine-HCl (0, 10, 20, 30, 40, 50 mg/L)과 PVP (0, 100, 200, 300, 400, 500 mg/L)를 농도별로 첨가한 후, 0.2 g의 캘러스를 각각의 배지에 옮겨 배양하였으며, 4주 후에 캘러스의 생체중을 측정하여 비교하였다. 캘러스의 유도 및 증식은 온도 25±1℃, 조도 4,000 lux, 광주기는 16/8시간의 조건에서 수행하였다.
- 신초를 0.2x0.5 cm크기로 잘라 캘러스 유도 배지 (0.5 mg/L NAA와 1.0 mg/L BA가 첨가된 MS 배지)에 치상하여 캘러스를 유도하였다 (오등, 1996). 유도된 캘러스는 식물체 절편으로부터 분리하여 캘러스증식배지 (0.
- 0 mg/L BA가 첨가된 MS 배지)에 치상하여 캘러스를 유도하였다 (오등, 1996). 유도된 캘러스는 식물체 절편으로부터 분리하여 캘러스증식배지 (0.2 mg/L 2, 4-D 와 1.0 mg/L TDZ가 첨가된 MS 배지)에 치상하여 증식하였다. Thiamine-HCl과 PVP가 캘러스의 생장에 미치는 영향을 조사하기 위해 동일한 배지에 thiamine-HCl (0, 10, 20, 30, 40, 50 mg/L)과 PVP (0, 100, 200, 300, 400, 500 mg/L)를 농도별로 첨가한 후, 0.
- 더군다나, 배양중에 캘러스 생장이 저조하거나 갈변현상이 일어날 수 있어 이를 해결하는 것이 우선적으로 필요하다. 차나무 신초를 캘러스 유도 배지에서 배양하여 캘러스를 유도하였으며, 유도된 캘러스는 캘러스증식배지에서 증식하였다 (데이타 미제시).
- 차나무 신초와 그 신초로부터 유도된 캘러스에서 카페인과 카테킨류의 함량을 HPLC를 이용하여 분석하여 비교하였다. 캘러스의 카페인 함량은 o.
- 차나무 카테킨류의 생산성을 높이기 위하여 차나무 잎의 캘러스 배양시 thiamine~HCl과 PVP의 효과를 조사하였다. 캘러스의 생장은 20 mg/L thiamine-HCl이 포함된 캘러스 증식배지 (0.
- A)를 이용하였으며, 분석 조건은 Table 1과 같다. 카테킨류 중에 EC, EGC, EGCG는 method I 으로, ECG는 method Ⅱ로 분석 하였다. 카페인과 카테킨류의 함량은 카페인과 4 가지 카테킨 '(EC, ECG, EGC, EGCG) 표준물질의 표준곡선을 작성하여 정량하였다.
- 카페 인과 카테킨류의 함량 분석 은 UV detector가 장착된 HPLC (Waters 590, U.S.A)를 이용하였으며, 분석 조건은 Table 1과 같다. 카테킨류 중에 EC, EGC, EGCG는 method I 으로, ECG는 method Ⅱ로 분석 하였다.
- 카테킨류 중에 EC, EGC, EGCG는 method I 으로, ECG는 method Ⅱ로 분석 하였다. 카페인과 카테킨류의 함량은 카페인과 4 가지 카테킨 '(EC, ECG, EGC, EGCG) 표준물질의 표준곡선을 작성하여 정량하였다.
- 캘러스 생장에 가장 적합한 배지를 선정하기 위해 차나무 신초로부터 유도된 캘러스를 캘러스 증식 배지에 thiamine-HCl 또는 P* VP 첨가하여 4주간 배양한 후 캘러스 생장량을 조사하였다 (Table 2). Thiamine-HCl 농도에 따른 캘러스의 생장은 대조구에 비하여 thiamine-HCl 처리시 증가하였다.
- 2 g의 캘러스를 각각의 배지에 옮겨 배양하였으며, 4주 후에 캘러스의 생체중을 측정하여 비교하였다. 캘러스의 유도 및 증식은 온도 25±1℃, 조도 4,000 lux, 광주기는 16/8시간의 조건에서 수행하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 차나무 (Camellia sinensis) 는제주대학교 농장에 식재되어 있는 Yabukita 품종이며 캘러스 유도 및 증식을 위해서 신초를 사용하였다. 시험분석을 위한 시약으로 표준품인 카페인, (-)-epicatechin (EC), (-)-epicatechingallate (ECG), (+)-epigallocatechin (EGG), (-)-epigallocatechin -3-gallate (EGCG) 는 Sigma 사제품을 사용하였다.
- 시험분석을 위한 시약으로 표준품인 카페인, (-)-epicatechin (EC), (-)-epicatechingallate (ECG), (+)-epigallocatechin (EGG), (-)-epigallocatechin -3-gallate (EGCG) 는 Sigma 사제품을 사용하였다. 그리고, acetonitrile, N, Ndimethyl formamide, ethyl acetate, tetrahydrofurane 등의 용매들은 Sigma사의 HPLC용을, 그 밖의 전처리 과정에 사용된 시약은 특급시약을 사용하였다.
- 캘러스 또는 신초는 80℃의 건조기에서 20시간 건조시켜 분쇄한 후 카페인과 카테킨류 함량을 분석하기 위한 재료로 사용하였다. 먼저 분쇄한 시료 100 mg을 시험관에 넣고 10 ml 증류수를 첨가한 다음 80℃ 항온 수조에서 50~60분간 가온 추출하여 TOYO 여과지로 여과하였다.
성능/효과
- 비교하였다 (Table 5). HPLC로 확인한 결과, Thiamine-HCl 또는 PVP를 첨가하여 배양한 캘러스에는 배양조건에 따라 차이가 있으나 EC, ECG, EGC, EGCG 등 4가지 성분이 모두 포함되어 있다. 이러한 결과는 Table 3에서 차나무 신초와 그 신초로부터 유도된 캘러스에서 EC가 검출되지 않았음을 고려했을 때 thiamine-HCl과 PVP가 EC 합성에 관여하는 것으로 보이며, 배양조건에 따라 카테킨류의 함량이나 조성이 달라질 수 있음을 시사한다고 할 수 있다.
- 이러한 결과는 Table 3에서 차나무 신초와 그 신초로부터 유도된 캘러스에서 EC가 검출되지 않았음을 고려했을 때 thiamine-HCl과 PVP가 EC 합성에 관여하는 것으로 보이며, 배양조건에 따라 카테킨류의 함량이나 조성이 달라질 수 있음을 시사한다고 할 수 있다. 각 배양조건에서 카테킨 함량을 비교흐H 보면, EC는 대조구에서 검출되지 않았으나 thiamine-HC과 PVP 하에서는 농도에 관계없이 l.ll~2.83mg/g 범위의 비교적 높은 함량이 검출되었다. 하지만, EGC는 thiamine-HCl이나 PVP를 첨가한 배지에서 모두 대조구보다 그 함량이 낮았다.
- 6배나 높게 검출되었다. 그리고, thiamine-HCl 이나 PVP를 첨가한 배지에서 배양된 캘러스에서는 EGC와 EGCG 함량이 신초보다 낮았으며, EC와 ECG 함량은 신초에서 보다 높은 함량을 나타내었다. 즉, 신초에서는 검출되지 않았던 EC가 thiamine-HCl 또는 PVP를 첨가한 배지에서 배양된 캘러스에서는 모든 처리에서 검출되었으며, ECG는 50 mg/L thiamine-HCl 이 첨가된 배지에서 배양된 캘러스가 신초에서 보다 4.
- 8배나 높은 함량을 나타내었다. 따라서 thiamine-HCl과 PVP는 EC와 ECG 합성에 관여하는 것으로 보이며, 첨가된 농도에 따라서 이들 함량을 조절할 수 있을 것으로 보인다. 또한 본 연구의 결과는 차나무 잎의 주요 생리활성물질인 카테킨류 생산에 캘러스의 기내배양이 보다 유용하게 이용될 수 있는 가능성을 보여주었다.
- 더욱이 이들 캘러스는 신초에서 보다 카페인 함량이 낮았다. 따라서 조직배양을 통해 카페인 함량은 낮추면서 차의 주요 생리활성물질로 작용하는 카테킨류의 생산을 증대시킬 수 있을 것으로 보인다. 그리고 Table 2에서 20-30 mg/L의 thiamine-HCl에서 캘러스 생장량이 높은 것을 고려하였을 때 카테킨류의 효율적 생산을 위해서는 30 mg/L thiamine-HCl이 포함된 배지에서 배양하는 것이 바람직할 것으로 보이며, 본 연구 결과는 고효율의 카테킨의 생산성을 향상시키기 위한 기초자료로 응용될 수 있을 것으로 보인다.
- 7 배의 생장을 보였다. 배양된 캘러스의 카페인 함량은 신초에 비해 10%이하로 낮아졌고 총 카테킨류 함량은 40 mg/L thiamine-HCl에서 가장 높아 신초의 1.6배까지 증가하였다. 특히 신초에서는 검출되지 않았던 (-)-epicatechin(EC)이 thiamine-HCl 또는 PVP를 처리하여 배양하였을 경우 모든 처리에서 검출되었으며, (-)-epicatechingallate(ECG)는 신초에서 보다 4.
- 2배나 높게 검출되었다. 본 실험의 결과 thiamine-HCle Table 2에서 보는 바와 같이 캘러스의 증식에 효과가 있을 뿐만 아니라 차의 주요 생리활성물질로 작용하는 카테킨류의 생산에도 영향을 미침을 알 수 있다. 총 카테킨 함량은 대조구에서는 2.
- 이상의 결과를 종합해 볼 때 thiamine-HCl 과 PVP를 첨가한 캘러스증식배지에서 배양된 캘러스에서는 총 카테킨 함량이 높았으며 신초에서 검출되지 않는 EC가 비교적 높은 농도로 검줄되었다. 더욱이 이들 캘러스는 신초에서 보다 카페인 함량이 낮았다.
- 그리고, thiamine-HCl 이나 PVP를 첨가한 배지에서 배양된 캘러스에서는 EGC와 EGCG 함량이 신초보다 낮았으며, EC와 ECG 함량은 신초에서 보다 높은 함량을 나타내었다. 즉, 신초에서는 검출되지 않았던 EC가 thiamine-HCl 또는 PVP를 첨가한 배지에서 배양된 캘러스에서는 모든 처리에서 검출되었으며, ECG는 50 mg/L thiamine-HCl 이 첨가된 배지에서 배양된 캘러스가 신초에서 보다 4.8배나 높은 함량을 나타내었다. 따라서 thiamine-HCl과 PVP는 EC와 ECG 합성에 관여하는 것으로 보이며, 첨가된 농도에 따라서 이들 함량을 조절할 수 있을 것으로 보인다.
- 본 실험의 결과 thiamine-HCle Table 2에서 보는 바와 같이 캘러스의 증식에 효과가 있을 뿐만 아니라 차의 주요 생리활성물질로 작용하는 카테킨류의 생산에도 영향을 미침을 알 수 있다. 총 카테킨 함량은 대조구에서는 2.67mg/g으로 낮았으나 thiamine-HCl이나 PVP를 첨가한 배지에서 배양된 캘러스에서는 전반적으로 높게 검출되었다. 특히 40~50mg/L thiamine-HCl을 첨가한 배지에서 배양된 캘러스에서 7.
- 카테킨류는 신초와 캘러스에서 모두 ECG, EGC, EGCG가 검출되었으나 EC는 검출되지 않았다. 캘러스의 EGC, EGCG 함량은 각각 1.63mg/g, 0.3mg/g으로 신초의 73%, 13%에 해당하였다. 그러나 캘러스의 ECG 함량은 0.
- 효과를 조사하였다. 캘러스의 생장은 20 mg/L thiamine-HCl이 포함된 캘러스 증식배지 (0.2 mg/L 2, 4-D와 1.0 mg/L TDZ가 첨가된 MS 배지)에서 가장 왕성하여 대조구에 비해 1.7 배의 생장을 보였다. 배양된 캘러스의 카페인 함량은 신초에 비해 10%이하로 낮아졌고 총 카테킨류 함량은 40 mg/L thiamine-HCl에서 가장 높아 신초의 1.
- 캘러스의 카페인 함량은 thiamine-HCl과 pWp의 농도에 따라 차이가 있으나 10mg/L의 thiamine-HCl에서 0.64mg/g으로 대조구의 86%, 400~500mg/L의 PVP에서 0.33~0.35 mg/g으로 대조구의 45~47%로 낮게 분석되었다 (Table 4). 카페인은 적당량을 섭취하면 신경 활동이 활발해지고 피로가 경감되는 효과가 있으나 과잉으로 섭취하면 중추신경계에 영향을 미쳐 신경과민, 흥분, 불면 등을 유발할 수 있으며 특히 신장질환이나 위궤양 환자에게 나쁜 영향을 미친다 (Tonychou, 1992: Kunugi et al.
- 6배까지 증가하였다. 특히 신초에서는 검출되지 않았던 (-)-epicatechin(EC)이 thiamine-HCl 또는 PVP를 처리하여 배양하였을 경우 모든 처리에서 검출되었으며, (-)-epicatechingallate(ECG)는 신초에서 보다 4.8배나 높은 함량을 나타내었다. 캘러스 생장과 고효율의 카테킨 생산을 고려했을 때 30 mg/L thiamine-HCl이 포함된 배지가 최적의 배양조건으로 판단된다.
- Thiamine-HCl 농도에 따른 캘러스의 생장은 대조구에 비하여 thiamine-HCl 처리시 증가하였다. 특히, 20 mg/L thiamine-HCl 처리시 1.10g으로 대조구의 0.64g에 비해 1.7배로 증가하였고, 그 이상의 농도에서는 다소 감소하였지만 대조구에 비하여 캘러스의 생장이 증가하였다. 이러한 결과는 담배 캘러스에서 thiamine-HCl의 농도를 높였을 때 4배의 생장을 보였으며, 장미의 경단배양시 thiamine-HCl을 첨가하였을 때 캘러스 생장이 촉진된다는 결과와 유사하였다 (Linsmaier et al.
후속연구
- 따라서 조직배양을 통해 카페인 함량은 낮추면서 차의 주요 생리활성물질로 작용하는 카테킨류의 생산을 증대시킬 수 있을 것으로 보인다. 그리고 Table 2에서 20-30 mg/L의 thiamine-HCl에서 캘러스 생장량이 높은 것을 고려하였을 때 카테킨류의 효율적 생산을 위해서는 30 mg/L thiamine-HCl이 포함된 배지에서 배양하는 것이 바람직할 것으로 보이며, 본 연구 결과는 고효율의 카테킨의 생산성을 향상시키기 위한 기초자료로 응용될 수 있을 것으로 보인다.
- 따라서 thiamine-HCl과 PVP는 EC와 ECG 합성에 관여하는 것으로 보이며, 첨가된 농도에 따라서 이들 함량을 조절할 수 있을 것으로 보인다. 또한 본 연구의 결과는 차나무 잎의 주요 생리활성물질인 카테킨류 생산에 캘러스의 기내배양이 보다 유용하게 이용될 수 있는 가능성을 보여주었다.
- 캘러스 내의 카페인 함량은 thiamine-HCI 이나 PVP 농도에 따라 차이가 있으나 전반적으로 Table 3에서 제시한 차나무 신초에서보다 훨씬 낮아 10% 미만의 적은 함량을 포함하고 있다. 이러한 결과를 토대로 조직배양으로 녹차의 카페인 함량을 낮출 수 있을 것이며, 캘러스를 이용하여 제품을 생산한다면 카페인 섭취를 최소화 할 수 있을 것이다.
- 더욱이. 캘러스는 배지 내에서 무균 상태로 배양하기 때문에 연중 아무 때나 대량생산이 가능하고 여러가지 물질의 생합성 과정에 있어서의 반응 메카니즘 또는 특정물질의 생합성 과정의 각 단계를 조절하는데도 활용할 수 있을 것이다.
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