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문제 정의
- 기존의 면역조직화학 분석에선 horseradish peroxidase (HRP)나 alkaline phosphatase (ALP)에 의해 촉매되는 면역침전반응은 침전물에 의한 시각적 감지법이 일반적이었으나, 본 연구에서는 개발된 방법론에 기초한 전기화학(18) 및 광학적(19, 20) 센싱 방법을 통하여 항원-항체간 면역반응들을 매우 정량적인 신호로 전환하는 방법을 각각 제작된 바이오칩 상에서의 구현을 시도하였다. 또한 항혈청 및 면역조직화학 샘플에 대한 신호 증폭과 정량적 기능 분석을 제작된 면역센서에서 시도함으로써 다양한 면역 샘플의 분석에 대한 응용 가능성을 제시하였다.
- 따라서 칩 표면의 설계와 단백 질의기능을 유지할 수 있는 환경을 조성하고 생체인식반응을 최적화하기 위해 고정화 밀도, 분자의 배향성, 비특이적 결합의 최소화라는 여러 관점에서 연구가 진행되고 있다. 본 연구에서는 면역 물질들에 대한 바이오칩을 제작함에 있어 두 가지 큰 관점, 즉 면역글로불린 (immunoglobulin)과 같은 단백질의 생체 인식반응이 효율적으로 이루어 질수 있는 센서막을 구성하는 것과 항원-항체 결합반응들을 매우 정량적인 신호로 전환하는 신호화 방법론의 개발에 초점을 맞추었다. 이를 위한 생체 물질과 고체 기판 (substrate) 간의 가교 물질로 64개의 아민기가 분자 표면에 노출된 G4 (fourth generation) 폴리아미도아민 (polyamidoamine) 덴드리머를 센싱 표면에 도입하였다(13, 14).
- 효율적인 바이오칩을 개발을 위해 칩 표면에 생체 물질들의 상호반응이 효과적으로 일어날 수 있는 센싱 표면의 조성과 항원-항체반응과 같은 생체 인식반응을 정 량적 신호로 전환하는 방법에 대해 연구하였다. 전기화학식 센서의 표면을 개선하기 위해 폴리아미도아민 덴드리머를 가교 물질로 도입하였다.
제안 방법
- 1의 오른쪽 패널에 도식적으로 요약하였다. 목적 항체의 농도에 따른 인지 반응을 위해, 5 X 10"에서 5 X 1042 g/mL까지의 단백질 농도 영역에서 항체-HRP 샘플의 등량 (100 此)을 준비하였고, 이 샘플들은 실온 (22 ± 2℃)에서 30분간 전극에서 각각 반응되었다. 반응 이후, 이차 IgG-HRP/일차 IgG가 결합된 바이오칩의 표면에서 신호화 반응을 진행하였다.
- 형 광 측정을 위해 슬라이드 2 에 사용된 Envision™은 mouse IgG와 인식반응을 하는 anti-mouse IgG와 HRP가 덱스트란 고분자에 결합된 형태의 물질로서, 정확한 HRP와 anti-mouse IgG의 중합숫자는 알려지지 않았다. 슬라이 드 2에서는 mouse IgG의 인식 반응을 통해 부동화된 Envision"1에 표지 되어 있는 HRP에 의하여 촉매되는 기질인 tyramide-Cy3를 이용하여 형광 신호를 측정하였다. Tyramide는 HRP의 촉매작용에 의해 활성화된 형태의 tyramide 로 전환되어 센싱 표면에 존재하는 단백질들의 tyrosine잔기에 결합된다.
- 2에서와 동일한 센서 구동 조건하에서, 제작된 면역센서들은 적용된 목적 단백질의 농도의 상호관계에 따라 피크 높이들이 감쇄하는 순환전압전류곡선을 보여주었다. Fig. 5에서 보여주고 있는 센서 신호들은 목적 단백질의 다양한 농도들에서 등록되었고, 모든 전기화학적 신호값들은 각 실험에서 바탕 전해질에 의해 기록된 전류를 뺀 ferrocene methanol의 산화환원 전류의 피크들을 모아 검 량 곡선화 하였다. 면역반응 전후의 전류차이를 발생된 신호로 기록하였으며, 이렇게 얻어진 결과는 반응된 항체의 10-"에서 1(尸 g/mL까지의 농도 영역에서 대수 농도에 대해 선형 비례함을 보여주는 검량곡선을 나타내었다(Fig.
- HRP가 표지 된 anti-mouse IgG conjugate는 센서 표면에 고정화된 mouse IgG와의 면 역 반응을 위해 사용되 었고, HRP에 의한 반응을 센서 신호의 검출에 이용하였다. 제작된 바이오센서 표면에서 일어나는 생체 특이성 반응과 제안된 신호화 반응은 Fig.
- 신호화 반응을 위한 반응 용액은 15분 동안 실온 및 빛을 차단한 조건하에서 반응되었다. 각각 조성 된 반응시 편은 GenePix 4000B를 이용하여 Cy3에 대한 형 광신호를 측정하여 분석하였다.
- 총 64개의 아민기가 노출된 4세 대 (G4) 덴드리 머 에 의한 단일분자막을 형성함으로써 다수의 아민기로 수식된 표면과 면역글로불린 단백질의 고정화 수준이 높은 전극 표면을 만들었다(15). 고정화 시킬 항체 샘플의 분자표면에 존재하는 탄수화물 가지들을 periodate로 산화시켜 알데하이드기를 부여함으로서 단백질의 덴드리머에 대한 접착성을 제공하였고 이를 통하여 아민-알데하이드 간의 결합 반응을 유도하였다. 형성된 Schiff base는 sodium borohydride를 사용하여 단일결합으로 환원되었고 따라서 더욱 안정화되었다.
- 슬라이드를 사용하였다. 고정화될 anti-mouse IgG의 분자표면에 존재하는 아민기와 센서 표면에 노출된 알데하이드기를 통해 결합반응을 유도하였다. Anti-mouse IgG와 결합반응을 하는 mouse IgG를 농도에 따라 반응시키고 이들 간의 인식반응에 대한 결과를 광학적으로 측정하는 샌드위치 면역분석과 신호화 방법은 Fig.
- 면역조직 화학 샘플로서 Envisione1은 앞에서 설명했듯이 정확한 효소 및 항체의 중합 분자수를 알지 못하며, 단백질 칩 표면에서의 TSA 방법에선 tyramide가 비특이적으로 단백질과 결합하므로 정밀한 신호를 산출할 수 없었다. 그러나 면역침전반응에 의한 기초한 전기화학식 신호화 방법을 이용함으로써 Envision^을 정 량적으로 평가할 수 있었다. Fig.
- 신호화 방법으론 면역조직화학 (immuno-histochem- istry) 반응에서 전통적으로 사용되어온 효소에 의해 촉매 되는 신호 증폭법을(17) 응용하였다. 기존의 면역조직화학 분석에선 horseradish peroxidase (HRP)나 alkaline phosphatase (ALP)에 의해 촉매되는 면역침전반응은 침전물에 의한 시각적 감지법이 일반적이었으나, 본 연구에서는 개발된 방법론에 기초한 전기화학(18) 및 광학적(19, 20) 센싱 방법을 통하여 항원-항체간 면역반응들을 매우 정량적인 신호로 전환하는 방법을 각각 제작된 바이오칩 상에서의 구현을 시도하였다. 또한 항혈청 및 면역조직화학 샘플에 대한 신호 증폭과 정량적 기능 분석을 제작된 면역센서에서 시도함으로써 다양한 면역 샘플의 분석에 대한 응용 가능성을 제시하였다.
- 이를 위한 생체 물질과 고체 기판 (substrate) 간의 가교 물질로 64개의 아민기가 분자 표면에 노출된 G4 (fourth generation) 폴리아미도아민 (polyamidoamine) 덴드리머를 센싱 표면에 도입하였다(13, 14). 덴드리머에 의해 개선된 센싱표면에 생체 리간드의 수식화와 생체 특이성 인지반응에 대한 전기화학적 측정을 위한 효율적인 센서막을 구성하였다 (15, 16). 신호화 방법으론 면역조직화학 (immuno-histochem- istry) 반응에서 전통적으로 사용되어온 효소에 의해 촉매 되는 신호 증폭법을(17) 응용하였다.
- 침전반응 전의 전극은 ferrocene methanol에 대하여 약 65 mV의 피크 분리도를 가지며 Ag/AgCl 기준 전극에 대해 +235 mV (산화)와+170mV (환원)에서 잘 발달된 산화환원 피크 전위를 가지는 전형적인 전기화학적 특성을 보인다. 따라서 목적 단백질의 친화 반응과 침전 반응에 기초한 신호화 반응을 수행한 후, 조성된 칩 표면에서 목적 단백질의 농도에 따른 신호 검출을 실험하였다. 목적 단백질 농도에 대응하여 ferrocene methanol에 대한 산화 환원 피크 전류가 순차적으로 감소하는 결과를 전압전류곡선을 통해 볼 수 있다(Fig.
- 또한 우리는 광학적 측정을 통해선 정밀한 신호를 얻기 어려웠던 Envisione1의 분석 성능을 제안된 전기화학식 면역센서를 통한 신호들로부터 정 량적 평가를 하였다. 면역조직 화학 샘플로서 Envisione1은 앞에서 설명했듯이 정확한 효소 및 항체의 중합 분자수를 알지 못하며, 단백질 칩 표면에서의 TSA 방법에선 tyramide가 비특이적으로 단백질과 결합하므로 정밀한 신호를 산출할 수 없었다.
- 목적 항체의 농도에 따른 인지 반응을 위해, 5 X 10"에서 5 X 1042 g/mL까지의 단백질 농도 영역에서 항체-HRP 샘플의 등량 (100 此)을 준비하였고, 이 샘플들은 실온 (22 ± 2℃)에서 30분간 전극에서 각각 반응되었다. 반응 이후, 이차 IgG-HRP/일차 IgG가 결합된 바이오칩의 표면에서 신호화 반응을 진행하였다.
- H2SO4를 1 : 4의 부피비로 혼합된 piranha 용액으로 5분간 세척한다(주의: piranha 용액은 대부분의 유기물들과 격렬히 반응하므로 취급시 매우 주의를 기울여 다루어야 한다). 세척을 마친 후, 아민 (amine)에 대한 반응잔 기를 제공하는 DTSP 자기조립 단분자막을 금 표면상에 형성시키기 위해 DMSO에 녹인 5 mM DTSP 용액을 1시간 동안 전극에서 반응시켰다. DMSO와 에탄올로 전극을 세척한 다음, DTSP 자기조립 단분자막으로 활성화된 표면은 에 탄올로 희석된 덴드리 머 용액 (1% w/w)으로 1시간 동안 수식되었다.
- 순환전압전류법의 측정은 바탕 (background) 전해질로서 PBS와 신호 등록을 위한 전기 활성종으로 0.1 mM의 ferrocene methanol이 포함된 PBS 용액에서 공히 50 mV/s의 scan rate로 각각 수행되었다. 침전반응 전후의 등록된 전압 전류 곡선들은 기본 전해질에 의한 전류 값을 뺀 전압전류곡선들을 수집하였다.
- 신호 발생을 위해, HRP의 기질로 4-CN을 사용하여 HRP에의해 촉매되는 침전물 형성 반응이 수행되었다. 먼저, 에탄올에 녹인 4-CN 용액은 50 mM의 농도로 준비한 후, 30% hydrogen peroxide와 준비 된 50 mM의 4-CN 용액을 각각 50 pL 씩 PBS에 혼합하여 총 1 mL이 되게 하였다.
- 덴드리머에 의해 개선된 센싱표면에 생체 리간드의 수식화와 생체 특이성 인지반응에 대한 전기화학적 측정을 위한 효율적인 센서막을 구성하였다 (15, 16). 신호화 방법으론 면역조직화학 (immuno-histochem- istry) 반응에서 전통적으로 사용되어온 효소에 의해 촉매 되는 신호 증폭법을(17) 응용하였다. 기존의 면역조직화학 분석에선 horseradish peroxidase (HRP)나 alkaline phosphatase (ALP)에 의해 촉매되는 면역침전반응은 침전물에 의한 시각적 감지법이 일반적이었으나, 본 연구에서는 개발된 방법론에 기초한 전기화학(18) 및 광학적(19, 20) 센싱 방법을 통하여 항원-항체간 면역반응들을 매우 정량적인 신호로 전환하는 방법을 각각 제작된 바이오칩 상에서의 구현을 시도하였다.
- 이를 위하여 100 ug/mL의 anti- mouselgG를 준비하여 센싱 표면에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 항원-항체간 인지 반응을 수행하기위해 1(广에서 10'12 g/mL의 농도 영역에서 준비된 mouse IgG 용액을 1시간 동안 반응시켰다. 형성된 센싱 표면에서 생체 특이성 반응과 신호화 반응을 수행하였고, 두 가지 면역 샘플들을 비교하기 위해 anti-mouse IgG-Cy3 샘플과 Envision™ 샘플을 각각 준비하였다.
- 우선 금 박막 표면에 DTSP 자기조립 단분자막을 형성시키면 전극은 아민기와 반응하는 Mhydroxysuccinimide ester 기가 노출된 표면을 띄게 된다. 이를 이용하여 생체 분자들의 효율적인 고정화를 위한 생체 적합성 가교 물질로서 폴리아미도아민 덴드리머를 도입하여 전극 표면에 단일분자막을 형성시켰다. 총 64개의 아민기가 노출된 4세 대 (G4) 덴드리 머 에 의한 단일분자막을 형성함으로써 다수의 아민기로 수식된 표면과 면역글로불린 단백질의 고정화 수준이 높은 전극 표면을 만들었다(15).
- 전극 표면의 아민 말단의 덴드리 머 분자들과 항체간의 고정화 반응을 위해 일차 항체의 보존부위에 존재하는 탄수화물 사슬에 알데하이드 (aldehyde) 기를 부여하기위해 sodium meta-periodate를 사용하여 항체를 산화시 켰다. 산화 반응을 위하여 20 mM sodium meta-periodate를 PBS에 녹인 50 ug/mL의 mouse IgG 용액에 첨가하였다.
- 방법에 대해 연구하였다. 전기화학식 센서의 표면을 개선하기 위해 폴리아미도아민 덴드리머를 가교 물질로 도입하였다. 생체 분자들의 인식작용을 정 량적인 신호로 전환하기 위해 전형적인 면역조직화학분석에서 사용된 반응들을 바이오센서에 적용한 방법론을 사용하였다.
- 제안된 면역침전반응에 의한 신호화 방법은, 효소의 기질로 사용된 가용성의 4-CN이 HRP에 의해 불용성물질로 변화되어 이때 유효전극면적의 감소로 인해 변화하는 전류량을 측정하는 것이다. 불용물들의 침전은 생체 특이적으로 결합된 이차항체 분자에 표지 된 효소인 HRP의 촉매 반응에 의해 유도되었다.
- 제작된 전기화학식 면역센서를 이용한 신호화 시험은 다양한 농도의 항체샘플들을 이용하여 수행되었다. Fig.
- 이를 이용하여 생체 분자들의 효율적인 고정화를 위한 생체 적합성 가교 물질로서 폴리아미도아민 덴드리머를 도입하여 전극 표면에 단일분자막을 형성시켰다. 총 64개의 아민기가 노출된 4세 대 (G4) 덴드리 머 에 의한 단일분자막을 형성함으로써 다수의 아민기로 수식된 표면과 면역글로불린 단백질의 고정화 수준이 높은 전극 표면을 만들었다(15). 고정화 시킬 항체 샘플의 분자표면에 존재하는 탄수화물 가지들을 periodate로 산화시켜 알데하이드기를 부여함으로서 단백질의 덴드리머에 대한 접착성을 제공하였고 이를 통하여 아민-알데하이드 간의 결합 반응을 유도하였다.
- 침전반응 전후의 등록된 전압 전류 곡선들은 기본 전해질에 의한 전류 값을 뺀 전압전류곡선들을 수집하였다. 침전 반응 전후의 전압전류곡선의 산화환원 전류의 피크값들의 차이를 센서 신호로 등록하여 분석하였다.
- 이때 센서 표면을 1 mL의 4-CN 용액에 10분간 담가두어 충분한 신호 발생 반응을 수행하였다. 침전반응 이후, 전극 표면을 PBS로 완전히 세척 하고 전기화학적 측정 을 수행하였다.
- 갖고 있는 슬라이드 glass를 사용하였다. 항혈청 내의 mouse IgG를 검출하기 위한 샌드위치 (sandwich) 면역분석을 위 흐H, mouse IgG와 인식 반응을 하는 anti-mouse IgG를 센서 표면에 일차로 고정화하였다. 이를 위하여 100 ug/mL의 anti- mouselgG를 준비하여 센싱 표면에서 1시간 동안 반응시켰다.
대상 데이터
- 폴리아미도아민 덴드리머 (fourth generation), ferrocene methanol, hydrogen peroxide는 Aldrich사, 3, 3-dithiopropionic acid bis-N-hydroxysuccinimide ester (DTSP), sodium meta periodate, ethylene glycol, sodium cyanoborohydride, 4-chloro-l-naphtol (4-CN), dimethyl sulfoxide (DMSO) 는 Sigma 사, mouse IgG, anti-mouse IgG, anti-mouse IgG-horseradish peroxidase (HRP), anti-mouse IgG-Cy3 는 Amersharm Bioscience (Buckinghamshire, England) 사", Envision「M 은 Dako (Carpinteria, US A) 사, phosphate buffer saline (PBS) (0.1 M, pH 7.2)는 Pierce사로부터 구매하여 사용하였다. 또한 aldehyde-activated slide glass는 Telechem (Cupertino, CA)사에서 구입하여 사용하였다.
- 표지된 HRP에 의한 촉매반응과 형광 신호의 등록을 위한 기질로서 H2O2와 tyramide-Cy3를 사용하였다. 친화 반응을 마친 후, 슬라이드를 PBS로 세척 하고 10 RM의 氏。2와 100 J1M의 tyramide-Cy3를 PBS에 녹여 준비 하였다. 신호화 반응을 위한 반응 용액은 15분 동안 실온 및 빛을 차단한 조건하에서 반응되었다.
- 광학적 측정을 위한 기초 기판은 알데하이드기로 활성화된 표면을 갖고 있는 슬라이드 glass를 사용하였다. 항혈청 내의 mouse IgG를 검출하기 위한 샌드위치 (sandwich) 면역분석을 위 흐H, mouse IgG와 인식 반응을 하는 anti-mouse IgG를 센서 표면에 일차로 고정화하였다.
- 2)는 Pierce사로부터 구매하여 사용하였다. 또한 aldehyde-activated slide glass는 Telechem (Cupertino, CA)사에서 구입하여 사용하였다. 그 밖에 시 약들은 최상급 순도의 시약을 구입하였고 모든 수용액은 비저항이 18MQ cm 이상인 증류 탈이온수를 사용하였다.
- 본 연구에서는 면역 물질들에 대한 바이오칩을 제작함에 있어 두 가지 큰 관점, 즉 면역글로불린 (immunoglobulin)과 같은 단백질의 생체 인식반응이 효율적으로 이루어 질수 있는 센서막을 구성하는 것과 항원-항체 결합반응들을 매우 정량적인 신호로 전환하는 신호화 방법론의 개발에 초점을 맞추었다. 이를 위한 생체 물질과 고체 기판 (substrate) 간의 가교 물질로 64개의 아민기가 분자 표면에 노출된 G4 (fourth generation) 폴리아미도아민 (polyamidoamine) 덴드리머를 센싱 표면에 도입하였다(13, 14). 덴드리머에 의해 개선된 센싱표면에 생체 리간드의 수식화와 생체 특이성 인지반응에 대한 전기화학적 측정을 위한 효율적인 센서막을 구성하였다 (15, 16).
- 전 기화학식 바이오칩 제작을 위한 기초기 판으로 40 nm 두께로 티타늄 (titanium)O] 입혀진 실리콘 웨이퍼 (Si[100]) 위에 e-beam 증착에 의해 150 nm 두께의 금 박막 표면을 만들어 전극으로 사용하였다. 센싱 표면의 구성을 위한 기초 전극 상에서의 상향식 (bottom-up) 막 형성과 생화학적 기능화 공정은 Fig.
- ,anostat (모델 630A, CH Instrument, USA)을 랩 탑 (labtop) 컴퓨터 에 연결하여 수행하였다. 전기화학측정의 전극계는 증착된 금 박막의 작업 전극, platinum gauze 보조전극, Ag/AgCl 기준 전극 (BAS, USA)으로 구성된 표준 삼-전극계를 사용하였다. 형광측정을 위한 스캔 장비는 GenePix 4000B (Axon Instruments, USA)모델을 사용하였다.
- 1 mM의 ferrocene methanol이 포함된 PBS 용액에서 공히 50 mV/s의 scan rate로 각각 수행되었다. 침전반응 전후의 등록된 전압 전류 곡선들은 기본 전해질에 의한 전류 값을 뺀 전압전류곡선들을 수집하였다. 침전 반응 전후의 전압전류곡선의 산화환원 전류의 피크값들의 차이를 센서 신호로 등록하여 분석하였다.
- Envisior/M은 anti-mouse IgG와 HRP가 덱스트란 고분자에 다수 결합된 물질로서, 슬라이드 2 에는 HRP에 의한 촉매반응을 통한 신호 증폭 방법인 TSA (tyramide signal amplification) 방법(18)을 적용하였다. 표지된 HRP에 의한 촉매반응과 형광 신호의 등록을 위한 기질로서 H2O2와 tyramide-Cy3를 사용하였다. 친화 반응을 마친 후, 슬라이드를 PBS로 세척 하고 10 RM의 氏。2와 100 J1M의 tyramide-Cy3를 PBS에 녹여 준비 하였다.
- 이 후 항원-항체간 인지 반응을 수행하기위해 1(广에서 10'12 g/mL의 농도 영역에서 준비된 mouse IgG 용액을 1시간 동안 반응시켰다. 형성된 센싱 표면에서 생체 특이성 반응과 신호화 반응을 수행하였고, 두 가지 면역 샘플들을 비교하기 위해 anti-mouse IgG-Cy3 샘플과 Envision™ 샘플을 각각 준비하였다. 슬라이 드 1은 1 ug/mL의 anti-mouse IgG-Cy3을 준비하여 빛을 차단한 조건하에서 1시간 동안 반응하였고, 슬라이드 2는 Envision1"을 추가적인 희석이나 농축과정 없이 사용하여 1시간 센서 표면에서 반응하였다.
이론/모형
- 불용물들의 침전은 생체 특이적으로 결합된 이차항체 분자에 표지 된 효소인 HRP의 촉매 반응에 의해 유도되었다. 면역침전반응 이후 감소되는 유효 전극의 면적의 변화는 전기 활성종인 ferrocene methanol의 산화환원 전류의 추이를 나타내는 순환전압전류법을 통해 알 수 있었다(Fig. 2). 침전반응 전의 전극은 ferrocene methanol에 대하여 약 65 mV의 피크 분리도를 가지며 Ag/AgCl 기준 전극에 대해 +235 mV (산화)와+170mV (환원)에서 잘 발달된 산화환원 피크 전위를 가지는 전형적인 전기화학적 특성을 보인다.
- 일차 항체에 의해 수식된 면역 센서의 표면에서 생체 특이적 상호작용은 이차 항체-HRP 복합체의 샘플을 이용하여 수행되었다. 목적 분석물의 생체특이적 결합의 검출은, 이차 항체에 표지된 효소의 면역침전반응에 의해 변화되는 전기화학적 특성의 분석을 순환 전압전류법에 의하여 수행하였다.
- 전기화학식 센서의 표면을 개선하기 위해 폴리아미도아민 덴드리머를 가교 물질로 도입하였다. 생체 분자들의 인식작용을 정 량적인 신호로 전환하기 위해 전형적인 면역조직화학분석에서 사용된 반응들을 바이오센서에 적용한 방법론을 사용하였다. 효소에 의해 촉매되는 신호화 방법은 면역반응들에 대하여 광학식 센서와 전기화학식 센서에서 공히 수행되었으며, 매우 정량적인 신호로 측정되었다.
- 전기화학측정의 전극계는 증착된 금 박막의 작업 전극, platinum gauze 보조전극, Ag/AgCl 기준 전극 (BAS, USA)으로 구성된 표준 삼-전극계를 사용하였다. 형광측정을 위한 스캔 장비는 GenePix 4000B (Axon Instruments, USA)모델을 사용하였다.
성능/효과
- 그러나 면역침전반응에 의한 기초한 전기화학식 신호화 방법을 이용함으로써 Envision^을 정 량적으로 평가할 수 있었다. Fig. 2의 실험과 동일한 방법으로 Envision™1에 의해 측정된 신호를 기록한 결과, 이차 항체 -HRP 샘플의 2 X IO'9 g/mL의 경우에 해당하는 분석능을 보임을 확인할 수 있었다(Fig. 5의 막대 그래프).
- 형성된 Schiff base는 sodium borohydride를 사용하여 단일결합으로 환원되었고 따라서 더욱 안정화되었다. 결과적으로 목적 물질과 인식반응을 하는 일차 항체는 표면에 효율적으로 고정화되었고 이차 항체와의 결합반응과 신호화 반응이 수행될 친화 센싱 표면이 조성되었다 .
- DMSO와 에탄올로 전극을 세척한 다음, DTSP 자기조립 단분자막으로 활성화된 표면은 에 탄올로 희석된 덴드리 머 용액 (1% w/w)으로 1시간 동안 수식되었다. 결과적으로 전극 표면은 아민기가 분자표면에 노출된 덴드리머 단분자막이 형성되었고 이후 단백질 리간드의 수식화 반응단계를 위해 PBS (0.1 M, pH 7.2)에 보관하였다.
- 2의 화살표). 따라서 센서 표면에서 일어나는 이차 항체-HRP의 생체 특이적 결합을 매우 정량적인 전기화학적 신호로 검출할 수 있었으며, 분석 샘플의 목적 단백질 농도를 다양하게 적용시켜 측정함으로써 단백질 농도에 대응되는 신호값이 반비 례하여 나타나는 검량곡선을 얻을 수 있었다. 또한 면역침전 반응에 기초한 전기화학적 분석 시스템을 통해서 전기화학적 신호화에 의한 검출뿐만 아니라 노출된 전극 표면에서 색의 변화에 의한 시각적 구분도 가능하였다(18).
- 효소에 의해 촉매되는 신호화 방법은 면역반응들에 대하여 광학식 센서와 전기화학식 센서에서 공히 수행되었으며, 매우 정량적인 신호로 측정되었다. 측정된 신호들로부터 단백질 농도에 비 례하는 검량곡선을 획득할 수 있었으며 다양한 면역 샘플에 대한 적용 가능성을 제시하였다.
후속연구
- 끌고 있다. 이러한 융합기술을 바탕으로 바이오센서의 소형화, 대량검색 및 다중측정 등에 대한 기술 개발 및 응용 가능성이 상당할 것으로 기대하고 있다. 따라서 랩온어칩 (lab-on-a-chip) 이나(8, 9) J1-TAS (micro-total analysis system)형태의(10) 바이오센서 개발이 활발히 이루어지고 있으며 이에 부합되는 바이오칩의 개발에 많은 노력이 투입되고 있다.
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