[국내논문]한우 체외수정란이 이식된 수란우의 임신과 유산에 영향을 미치는 수정란측 요인 Effect of Embryo Factors on Pregnancy and Abortion Rate after Transfer of In Vitro Produced Korean Native Cattle Embryos원문보기
본 연구에서는 한우 체외수정란의 이식에 있어서 수정란 측 요인들이 수란우의 임신과 유산에 미치는 영향을 검토하였다. 이식에 제공하는 배반포의 수량에 따른 임신율은 1개, 2개 및 3개 이식 군에서 각각 32, 44 및 $32\%$였고, 유산율은 $6.3\~13.6\%$로서 2개 이식군의 임신율과 유산율이 가장 높았으나 유의차는 인정되지 않았다. 배반포 등급에 따른 임신율은 $40.8\~44.2\%$, 유산율은 $9.4\~16.3\%$로서 유사한 경향이었다. 배반포의 발생 단계에 따른 임신율은 $39.1\%\~45.3\%$로서 비슷하였으나, 유산율은 HB군$(20.8\%)$이 LB군의 $9.0\%$에 비해서는 유의하게 높았다(p<0.05). 배반포의 발생일령에 따른 임신율은 배반포 $7\cdot7$일째와 $7\cdot8$일째가 각각 $47.1\%$와 $53.9\%$로서 $9\cdot9$일 및 $8\cdot9$일째(29.8 및 $R27.7\%$)에 비해 유의하게 높았다(p<0.05). 유산율은$8\cdot9$일령이 $30.8\%$로 가장 높았고 $7\cdot7$일령의 $10.1\%$와는 유의차가 인정되었다.
본 연구에서는 한우 체외수정란의 이식에 있어서 수정란 측 요인들이 수란우의 임신과 유산에 미치는 영향을 검토하였다. 이식에 제공하는 배반포의 수량에 따른 임신율은 1개, 2개 및 3개 이식 군에서 각각 32, 44 및 $32\%$였고, 유산율은 $6.3\~13.6\%$로서 2개 이식군의 임신율과 유산율이 가장 높았으나 유의차는 인정되지 않았다. 배반포 등급에 따른 임신율은 $40.8\~44.2\%$, 유산율은 $9.4\~16.3\%$로서 유사한 경향이었다. 배반포의 발생 단계에 따른 임신율은 $39.1\%\~45.3\%$로서 비슷하였으나, 유산율은 HB군$(20.8\%)$이 LB군의 $9.0\%$에 비해서는 유의하게 높았다(p<0.05). 배반포의 발생일령에 따른 임신율은 배반포 $7\cdot7$일째와 $7\cdot8$일째가 각각 $47.1\%$와 $53.9\%$로서 $9\cdot9$일 및 $8\cdot9$일째(29.8 및 $R27.7\%$)에 비해 유의하게 높았다(p<0.05). 유산율은$8\cdot9$일령이 $30.8\%$로 가장 높았고 $7\cdot7$일령의 $10.1\%$와는 유의차가 인정되었다.
In this study, we investigated the effects of number, grade, stage and day of embryos on pregnancy and abortion rates of Holstein heifer recipients after transfer of in-vitro produced Korean Native Cattle (Hanwoo) embryos. When one, two or three blastocysts were transferred to recipients, pregnancy ...
In this study, we investigated the effects of number, grade, stage and day of embryos on pregnancy and abortion rates of Holstein heifer recipients after transfer of in-vitro produced Korean Native Cattle (Hanwoo) embryos. When one, two or three blastocysts were transferred to recipients, pregnancy (32.0, 44.0 and $32.0\%$) and abortion (12.5, 13.6 and $6.3\%$) rates did not differ among treatments. The pregnancy and abortion rates of different grades of blastocysts were $40.8\~44.2\%\;and\;9.4\~16.3\%$, respectively. However, they were not significantly different. According to the stage of blastocyst, the pregnancy rates were similar between $39.1\%\;and\;45.3\%$. However, the abortion rate in hatched blastocyst stage $(20.8\%)$ was significantly higher than that in late blastocyst stage $(9.0\%)$. The pregnancy rates in day $7\cdot7$ and day $7\cdot8$ blastocyst (47.1 and $53.9\%$, respectively) was significantly higher than that in the day $9\cdot9\;and\;8\cdot9$ blastocyst (29.8 and $27.7\%$, respectively). The abortion rate was the highest in the day $9\cdot9$ blastocyst $(30.8\%)$ among treatments, and it was significantly different compared to that in the day $7\cdot7$ blastocyst $(10.1\%)$. Therefore, this study suggested that the pregnancy rate was affected by only day of embryos, while the abortion rate was affected by stage and day of embryos.
In this study, we investigated the effects of number, grade, stage and day of embryos on pregnancy and abortion rates of Holstein heifer recipients after transfer of in-vitro produced Korean Native Cattle (Hanwoo) embryos. When one, two or three blastocysts were transferred to recipients, pregnancy (32.0, 44.0 and $32.0\%$) and abortion (12.5, 13.6 and $6.3\%$) rates did not differ among treatments. The pregnancy and abortion rates of different grades of blastocysts were $40.8\~44.2\%\;and\;9.4\~16.3\%$, respectively. However, they were not significantly different. According to the stage of blastocyst, the pregnancy rates were similar between $39.1\%\;and\;45.3\%$. However, the abortion rate in hatched blastocyst stage $(20.8\%)$ was significantly higher than that in late blastocyst stage $(9.0\%)$. The pregnancy rates in day $7\cdot7$ and day $7\cdot8$ blastocyst (47.1 and $53.9\%$, respectively) was significantly higher than that in the day $9\cdot9\;and\;8\cdot9$ blastocyst (29.8 and $27.7\%$, respectively). The abortion rate was the highest in the day $9\cdot9$ blastocyst $(30.8\%)$ among treatments, and it was significantly different compared to that in the day $7\cdot7$ blastocyst $(10.1\%)$. Therefore, this study suggested that the pregnancy rate was affected by only day of embryos, while the abortion rate was affected by stage and day of embryos.
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문제 정의
본 연구에서는 한우 체외수정란의 이식에 있어서 수정란 측 요인들이 수란우의 임신과 유산에 미치는 영향을 검토하였다. 이식에 제공하는 배반포의 수량에 따른 임신율은 1개, 2개 및 3개 이식 군에서 각각 32, 44 및 32%였고, 유산율은 6.
제안 방법
한우 동결정액 1개를 실온에서 10초간, 37℃의 항온수조에서 30초간 처리하여 융해한 후 90%, percoll(Sigma, P4937) 2ml 용액이 담겨져 있는 15ml 원심분리관(Coming, 430052)에 조심스럽게 놓은 후 700g에서 20분간 원심분리 후 하층부의 정자괴 만을 회수하여, 2ml의 신선 체외수정용액 으로 350g에서 10분간 원심분리함으로써 정자를 세척하였다. 그리고 정자 농도는 25x10° sperms/ml 가 되도록 조절하여, 15개씩의 난포란이 함유되어져 있는 46〃1의 체외수정용액에 heparin 2#1와 정자 21를 각각 첨가하여(최종 정자농도 Ml" sperms/ml) 39℃, 5% CO2 배양기에 20시간 동안 배양함으로써 체외 수정을 유도하였다.
2tng/ml pyruvate(Sigma, P3662), 1 n g/ml FSH(Sigma, F8174), 10//g/ml LH(Sigma, L9773) 및 10% FBS(Sigma, F0643)가 첨가된 TCM199(Gibco, 12340-030) 용액, 체외 수정용은 6 mg/ml BSA오｝ 10"g/ml heparin(Sigma, H3149)이 첨가된 TALP 용액, 체외배양용은 3mg/ml BSA 또는 10% FBS가 첨가된 CRlaa 용액을 각각 이용하였다. 그리고 실험에 제공되는 배양액의 미세소적은 mineral oil(Sigma, M8410)을 도포하여 39℃, 5% CO2 배양기에서 최소한 4시간 이상 평형을 하였다.
배양 7일 또는 8일째의 배반포를 발생 단계에 따라 Middle Blastocyst(MB), Late Blastocyst(LB) 및 Hatched Blastocyst(HB)로 구분하였고, 배반포 2개씩을 이식하였다.
배양 7일령의 배반포를 실험 목적에 따라 1, 2 및 3개씩을 각각 이식하였다.
배양 7일령의 배반포의 등급을 Linder와 Wright (1983)의 기준에 의하여 Grade 1, Grade 2 및 Grade 3으로 분류하였고, 각 등급의 배반포 1개씩을 이식 하였다.
본 연구는 2002년부터 2003년까지 2년간 동안에 수행한 1,000여 건의 수정란 이식을 분석하여, 이식에 제공하는 배반포의 수량, 품질, 발생 단계 및 발생 일령이 수란우의 임신과 유산에 미치는 효과를 분석하였다.
한우 수정란을 이식한 후 60일에 직장검사로 임 신을 판정하였다. 임신이 확인된 수란우가 재발정 및 태아 또는 태반의 배출이 확인된 경우에 직장 검사를 다시 실시하여 태아의 존재 유무와 자궁변 화의 소견을 기초로 유산을 판정하였다.
체외배양 7, 8 및 9일째의 MB 또는 LB 단계의 것을 조합하여 각각 이식하였다.
4.체외배양
체외수정 후 실체 현미경 하에서 형태적으로 정상이라고 판단된 수정란만을 회수하여, 15개씩의 수정란(배양 1일)을 3mg/ml BSA가 첨가된 CRlaa 용액 20“1에 넣고, 39℃, 5% CO2 배양기에서 배 양하였으며, 배양 3일째와 5일째에는 10% FBS가 첨가된 CRlaa 용액으로 교환하여 배양하였다.
한우 수정란을 이식한 후 60일에 직장검사로 임 신을 판정하였다. 임신이 확인된 수란우가 재발정 및 태아 또는 태반의 배출이 확인된 경우에 직장 검사를 다시 실시하여 태아의 존재 유무와 자궁변 화의 소견을 기초로 유산을 판정하였다.
수집된 난소는 penicillin G (Sigma, P3032)가 첨가된 생리식염수로 3~4회 세척하여, 18G 주사침이 부착된 10ml 주사기를 이용하여 직경 2~8mm의 가시난포로부터 난포란을 회수하였다. 회수된 난포란은 실체 현미경 하에서 난구세포의 부착 상태가 치밀한 것만을 선별하여, 50“1의 체외성숙용 배지에 15개 난포란을 옮겨 22시간 동안 39℃, 5% CO2 배양기에 배양함으로 써 체외성숙을 유도하였다.
대상 데이터
본 연구에 사용된 배양액 중 난소로부터 난포란의 세척 및 회수용은 25mM HEPES와 3mg/ml BSA(Sigma, A6003)가 첨가된 Hepes-TALP 용액, 체외 성숙용은 0.2tng/ml pyruvate(Sigma, P3662), 1 n g/ml FSH(Sigma, F8174), 10//g/ml LH(Sigma, L9773) 및 10% FBS(Sigma, F0643)가 첨가된 TCM199(Gibco, 12340-030) 용액, 체외 수정용은 6 mg/ml BSA오｝ 10"g/ml heparin(Sigma, H3149)이 첨가된 TALP 용액, 체외배양용은 3mg/ml BSA 또는 10% FBS가 첨가된 CRlaa 용액을 각각 이용하였다. 그리고 실험에 제공되는 배양액의 미세소적은 mineral oil(Sigma, M8410)을 도포하여 39℃, 5% CO2 배양기에서 최소한 4시간 이상 평형을 하였다.
도축 한우에서 난소를 적출하여 25 ng/ml gentamycin(Sigma, G1264)이 첨가된 0.9% 생리식염 수(30~33 ℃)가 들어있는 보온병에 담아 2~3시간에 실험실로 운반하였다. 수집된 난소는 penicillin G (Sigma, P3032)가 첨가된 생리식염수로 3~4회 세척하여, 18G 주사침이 부착된 10ml 주사기를 이용하여 직경 2~8mm의 가시난포로부터 난포란을 회수하였다.
수란우는 2003년 3월부터 2004년 9월까지 경상북도 경산, 영천, 성주, 달성, 청도, 칠곡, 대구 및 상주 지역의 젖소 사육농가에서 사육 중인 홀스타인을 이용하였다. 수정란 이식은 준비된 한우 배반 포를 비외과적 이식기(MVE, France)에 장착하여 황체가 존재하는 자궁각에 이식하였다.
9% 생리식염 수(30~33 ℃)가 들어있는 보온병에 담아 2~3시간에 실험실로 운반하였다. 수집된 난소는 penicillin G (Sigma, P3032)가 첨가된 생리식염수로 3~4회 세척하여, 18G 주사침이 부착된 10ml 주사기를 이용하여 직경 2~8mm의 가시난포로부터 난포란을 회수하였다. 회수된 난포란은 실체 현미경 하에서 난구세포의 부착 상태가 치밀한 것만을 선별하여, 50“1의 체외성숙용 배지에 15개 난포란을 옮겨 22시간 동안 39℃, 5% CO2 배양기에 배양함으로 써 체외성숙을 유도하였다.
데이터처리
실험 결과에 대한 통계학적 분석은 x2-test를 이용하였고, p<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
성능/효과
3%이었다. 2개 이식군의 임신율과 유산율이 높은 경향이었으나 유의차는 인정되지 않았다.
3 %로서 유사한 경향이었다. 배반포의 발생 단계에 따른 임신율은 39.1%~45.3%로서 비슷하였으나, 유산율은 HB군(20.8%)이 LB군의 9.0%에 비해서는 유의하게 높았다3<0.05). 배반포의 발생 일령에 따른 임신율은 배반포 7 • 7일째와 7 • 8일째가 각각 47.
05). 배반포의 발생 일령에 따른 임신율은 배반포 7 • 7일째와 7 • 8일째가 각각 47.1%와 53.9%로서 9 , 9일 및 8 • 9일째(29.8 및 27.7%)에 비해 유의하게 높았다(pvO.05). 유산 율은 8 • 9일령이 30.
배반포 발생 일령은 배양 7일째가 8일 및 9일에 비하여 임신율이 높았으나(Hasler 등, 1995), Suzuki 등(1991)은 오히려 8일째가 7일째보다 높았다. 본 연구에서는 발생 7일령의 배반포가 9일령의 것에 비하여 유의하게 높은 경향이었고, 특히 7일과 8일령의 배반포를 조합하여 이식한 경우가 가장 높았 다. 이와 같이 7일째의 배반포가 임신율이 높은 원인은 조기에 배반포 단계에도살한 것의 품질이 좋고, 특히 발생 7일령의 배반포가 다른 시기에 비하여 많은 세포수를 가지고 있기 때문인 것으로 생각된다(Park 등, 2005).
한편 수정란의 다른 요인들, 즉 배 발달 단계, 발생 일령 및 품질에 따른 유산율의 보고는 거의 없었다. 본 연구에서는 배 발달 등급에 따른 유산율의 차이가 없었으나, HB의 유산율이 LB에 비하여(20.8 vs. 9.0%) 발생 8일과 9일째가 7 • 7일째의 것(30.8 vs. 10.1 %)에 비하여 유의하게 높았다. 발생 8일과 9일째 배반포의 유산율이 높은 것은 이 시기의 배반포는 HB 단계인 것이 많고, HB 단계의 배반포는 형태 적으로 불완전하기 때문에 이식을 위한 외부 스트레스에 쉽게 영향을 받기 때문인 것으로 생각된다.
이상의 결과에서 체외수정란 이식의 산업화를 조기에 달성하기 위해서, 임신율을 향상에는 배양 7일과 8일째의 배반포를 조합하여 이식해야 하고, 유산을 예방하기 위해서는 배양 7일째의 확장 배반포를 이식하는 것이 효과적일 것으로 사료된다.
본 연구에서는 한우 체외수정란의 이식에 있어서 수정란 측 요인들이 수란우의 임신과 유산에 미치는 영향을 검토하였다. 이식에 제공하는 배반포의 수량에 따른 임신율은 1개, 2개 및 3개 이식 군에서 각각 32, 44 및 32%였고, 유산율은 6.3- 13.6%로서 2개 이식군의 임신율과 유산율이 가장 높았으나 유의차는 인정되지 않았다. 배반포 등급에 따른 임신율은 40.
1%로서 유사한 경향이었다. 한편 유산율은 MB군, LB군, HB군 및 MB-LB군에서 각각 11.8%, 9.0%, 20.8% 및 11.9% 로서, HB군이 가장 높았으며 특히 LB군과는 유의차가 인정되었다(p<0.05).
후속연구
체외 수정란이 이식된 수란우의 유산율은 9~47%로서(Schmidt 등, 1996) 인공수정과 체내 수정란의 4~8%(Hasler 등, 1987)보다 훨씬 높고, 송아지의 체중, 임신 기간, 난산 및 기형이 증가하였다(Kruip와 den Dass, 1997). 따라서 수정란 이식의 산업화를 위해서는 수정란 생산 효율 증진과 더불어 임신율 향상, 유산, 분만 및 신생 송아지에 대한 연구가 더 필요하다.
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