흑두로 제조한 청국에서 분리된 Bacillus subtillus BB-1으로 부터 혈전용해효소 유전자 크로닝 및 특성규명 Cloning and Characterization of a Gene for Fibrinolytic Enzyme from Bacillus subtilis BB-1 Isolated from Black Bean Chung-kuk원문보기
흑두로 제조한 청국으로부터 혈전용해력이 우수한 균을 선발하여 동정하였으며, 그를 Bacillus subtilis BB-1로 명명하였다. 이 균은 혈전용해효소 isozyme을 적어도 5개이상 생성하는 균주로 확인되었다. 이 균으로부터 크로모좀을 분리하여 shot gun법으로 혈전용해효소 유전자를 크로닝하였으며, 이 유전자를 BSF-1이라 명명하였다. 이 유전자는 714개의 아미노산을 암호화하고 있으며 기존에 밝혀진 혈전용해효소 유전자와 상동성은 검출되지 않은 새로운 혈전용해효소 유전자였다. 혈전용해효소활성 최적 pH 및 온도는 5.0과 $35^{\circ}C$였다. 기질특이성은 적혈구 배지 또는 skim milk, gelatin등에 전혀 분해활성이 없었다. 이는 혈전만을 특이적으로 분해하는 기질특이성을 보였으며, 혈전분해효소로서의 이용가능성이 충분한 것으로 판단된다.
흑두로 제조한 청국으로부터 혈전용해력이 우수한 균을 선발하여 동정하였으며, 그를 Bacillus subtilis BB-1로 명명하였다. 이 균은 혈전용해효소 isozyme을 적어도 5개이상 생성하는 균주로 확인되었다. 이 균으로부터 크로모좀을 분리하여 shot gun법으로 혈전용해효소 유전자를 크로닝하였으며, 이 유전자를 BSF-1이라 명명하였다. 이 유전자는 714개의 아미노산을 암호화하고 있으며 기존에 밝혀진 혈전용해효소 유전자와 상동성은 검출되지 않은 새로운 혈전용해효소 유전자였다. 혈전용해효소활성 최적 pH 및 온도는 5.0과 $35^{\circ}C$였다. 기질특이성은 적혈구 배지 또는 skim milk, gelatin등에 전혀 분해활성이 없었다. 이는 혈전만을 특이적으로 분해하는 기질특이성을 보였으며, 혈전분해효소로서의 이용가능성이 충분한 것으로 판단된다.
A bacterium producing five fibrinolytic isozymes was isolated from black bean chung kuk. The bacterium was identified as Bacillus subtilis BB-1 by 16s rDNA sequence homology search. A gene out of five fibrinolytic genes in the Bacillus subtilis BB-1 was cloned by shot-gun method. A Cla I DNA fragmen...
A bacterium producing five fibrinolytic isozymes was isolated from black bean chung kuk. The bacterium was identified as Bacillus subtilis BB-1 by 16s rDNA sequence homology search. A gene out of five fibrinolytic genes in the Bacillus subtilis BB-1 was cloned by shot-gun method. A Cla I DNA fragment of B. subtilis BB-1 chromosome was cloned in to pBluescript II SK(-) and showed the fibrinolytic activity to bacterial cells. The Cla I DNA fragment was sequenced and the sequences did not show homology with gene for protease or fibrinolytic enzyme genes in other organisms. The Cla I DNA fragment was reduced to 2,142 bp by activity-guided PCR cloning method. The optimum pH and temperature of the enzyme were 5.0 and $35^{\circ}C$, respectively. Substrate specificity of the fibrinolytic enzyme was detected in skim milk, casein, gelatin and blood agar plates. The activity of the enzyme was not detected with these substrates. Taken together, this enzyme is a new fibrinolytic enzyme and may be used to prevent thrombosis and arteriosclerosis.
A bacterium producing five fibrinolytic isozymes was isolated from black bean chung kuk. The bacterium was identified as Bacillus subtilis BB-1 by 16s rDNA sequence homology search. A gene out of five fibrinolytic genes in the Bacillus subtilis BB-1 was cloned by shot-gun method. A Cla I DNA fragment of B. subtilis BB-1 chromosome was cloned in to pBluescript II SK(-) and showed the fibrinolytic activity to bacterial cells. The Cla I DNA fragment was sequenced and the sequences did not show homology with gene for protease or fibrinolytic enzyme genes in other organisms. The Cla I DNA fragment was reduced to 2,142 bp by activity-guided PCR cloning method. The optimum pH and temperature of the enzyme were 5.0 and $35^{\circ}C$, respectively. Substrate specificity of the fibrinolytic enzyme was detected in skim milk, casein, gelatin and blood agar plates. The activity of the enzyme was not detected with these substrates. Taken together, this enzyme is a new fibrinolytic enzyme and may be used to prevent thrombosis and arteriosclerosis.
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문제 정의
본 연구에서는 대두청국보다도 혈전용해력이 우수한 흑두청국으로부터 혈전용해력이 가장 우수한 미생물을 선발하고 그 미생물이 생산하는 혈전용해효소의 특성을 조사하고, 또한 그 유전자를 크로닝하여 특성을 규명하고 산업적 이용 가 능성을 조사하였다.
제안 방법
Astrup와 Hullertz의 방법[1]을변형하여 사용하였다. 0.
IntRon사의 Genomic DNA Extraction kit를 이용하여 분리하였다. 흑두에서 분리한 미생물을 OD가 1.
12% (W/ V)가 되게 polyacrylamide 용액에 혼합한 후 즉시 thrombin (1,000 uW/ml)을 첨가하여 제조한 12% fibrin- polyacrylamide gel에서 수행하였다. 각 lane에 혈전용해능이 우수한 분리균주의 배양상 등액을 점적한 후 전기영동을 실시한 다음 SDS에 의해 불활성화된 효소를 재활성화시키기 위하여 gel을 2.5% Triton X-100을 포함한 Tris-니C1 (50 mM, pH 7.4)에 3시간 동안 침적하여 단백질을 활성화시킨 후 Triton X-100을 제거하기 위하여 멸균수로 15분간 2회 세척하였다. 분획된 단백질의 혈천분해 활성은 활성반응 완충용액(20。mM NaCl, 10 mM CaC12, 0.
분리된 colony를 LB broth 5 ml에 접종하여 37℃에서 optical density (OD)가 L0이 되게 배양한 후 fibrin plate에 20 ul씩 loading하여 혈전용해능 이 가장 우수한 미생물을 선발하였다. 미생물의 동정은 한국 미생물 보존센터 (KCCM)에 의뢰하여 16s rDNA sequence에 의한 유전자 간의 상동성비교로 동정하였다.
MeKk)에 녹인 후 직경 87x15 mm petridish에 10 ml 넣은 후 thrombin (1,000 unit/ ml Sigma) 20 unit를 첨가하여 실온에 30분간 방치하여 응고시켰다. 응고된 fibrin plate에 각 시료를 적당량 점적하여 6hrs 동안 37℃에서 반응시켜 용해된 분해면적을 측정하였으며, 활성의 세기를 측정하기 위하여 혈전분해 효소 plasmin과 비교 후unit로 환산하여 단위를 정하였다.
이 균은 혈전용해효소 isozyme을 적어도 5개 이상 생성하는 균주로 확인되었다. 이 균으로부터 크로모 좀을 분리하여 shot gun법으로 혈전용해효소 유전자를 크로닝하였으며, 이 유전자를 BSF-1 이라 명명하였다. 이 유전자는 714개의 아미노산을 암호화하고 있으며 기존에 밝혀진 혈전용해효소 유전자와 상동성은 검출되지 않은 새로운 혈전용해효소 유전자였다.
0 kb의 insert 단편을 확인하였다. 이때 CM I으로 절단시 inserts] size와 vector size가 유사하여 vector5] multi cloning site (MCS)에 있는 BamH I으로 절단한 결과 6.0 kb 인 하나의 band를 얻었으며, 염기서열의 결정은 먼저 T7 primer와 T3 primer를 이용하여 양방향으로 염기서열을 확인하고 확인된 후 다시 연속적으로 새로운 primer을 합성하여 확인함으로서 최종적으로 중복되는 연결 순서에 의해 전체적인 염기서열을 결정하였다. 염기서열을 토대로 제한 효소 지도를 작성한 후 PCR을 이용하여 크로닝한 결과 약 2.
이미 제조된 청국으로부터 혈전용해효소 생성능이 우수한 미생물을 선별하기 위하여 청국lg을 멸균 생리식염수에 현탁, 희석하고 이를 LB agar plate (Tryptone 1.0%, Yeast extract 0.5%z NaCl 1.0%, Agar 1.5%. pH 7.2. Difc。)에 0.1 ml를 도말한 후 단일 colony를 분리하였다. 분리된 colony를 LB broth 5 ml에 접종하여 37℃에서 optical density (OD)가 L0이 되게 배양한 후 fibrin plate에 20 ul씩 loading하여 혈전용해능 이 가장 우수한 미생물을 선발하였다.
청국의 발효는 starter를 접종하지 않고 자연 상태로 40±l℃, 습도는 포화습도를 유지하도록 조절하였으며, 발효시간은 48시간으로 하였다.
0 이상에서는 강산과 강염기로 인해 fibrin plate가 만들어 지질 않았다. 최적 활성온도는 20℃부터 40℃로 온도를 조절 후 6시간 반응시켜 용해된 분해면적을 측정하였다.
크로닝된 혈전용해효 소 유전자를 함유한 균주의 혈전용해능을 조사하기 위하여 대조구로서 pBSK(-)를 가지고 있는 XU-blue를 사용하였으며, 재조합 균주 및 대조구를 각각 600 rm에서 OD가 1.0이 되게 배양하여 13, 000 rpm에서 30분간 원심분리 후 배양상 등액과 균체를 혈전분해활성 측정에 사용하였으며, 집균된 균체는 멸균 생리식염수로 2회 세척한 후, 20 mM Tris-HCl (pH 7.2)에 현탁시켜 10℃ 이하를 유지하면서 초음 파 파쇄기(Bandelin Co. Sonopuls GM70. USA)를 사용하여 120Hz로 파쇄시켰다. 파쇄균체는 13000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 fibrin plate, skim milk, casein, gelatin, blood agar plate에 각각 점적하여 혈전분해 활성 및 기질특이성을 조사하였다.
크로닝된 혈전용해효 소 유전자의 deletion mutation을 구축하기 위해 primer를 Table 1과 같이 합성하여 PCR에 의해 점차 size를 줄여 6가지의 DNA단편을 얻었으며, 각 DNA단 편을 크로닝하여 혈전 용해효소 활성을 조사하였다. PCR증 폭에 사용된 Perkin Elner-2400은 조건을 초기 denaturation 단계에서 95℃ 30초를 유지하였으며, 55℃ 30초, 72℃ 30초에서 30 cycle로 증폭한 후 최종 단계인 DNA합성은 72℃에서 10분 동안 실시하였다.
USA)를 사용하여 120Hz로 파쇄시켰다. 파쇄균체는 13000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 fibrin plate, skim milk, casein, gelatin, blood agar plate에 각각 점적하여 혈전분해 활성 및 기질특이성을 조사하였다.
혈전용해효소 생산의 최적 pH와 온도를 측정하기 위하여 pH는 fibrin plate를 제조함에 있어서 fibrinogen용액의 pH 를 각각 5.0부터 9.0까지 조절한 후 thrombin 10 unit를 가하여 본혈전용해효소를 적당량 점적한 후 37℃에서 6시간 반응시켜 용해된 분해면적을 측정하였다. 이때 pH 4.
혈전용해효소를 세포 외로 다량 생산하는 B. subtilis BB-1의 genomic DNA를 분리하여 CZI으로 절단한 다음 7—3 kb의 DNA단편과 Cla I으로 절단 후 Calf Intestinal Alkaline phosphatase (CIP) 처리한 pBluescript II SK(-)를 Hgation시켜 E. coli XLLblue에 형질전환시켰다. Ampicillin과 X~galz IPTG가 포함된 선별 배지에서 자란 약 L500여개의 형질전환 체 중에서 혈전용해력을 갖는 하나의 clone이 확인 되었다(Fig.
흑두로 제조한 청국으로부터 혈전용해력이 우수한 균을 선발하여 동정하였으며, 그를 Bacillus subtilis BB-1 로 명명하였다. 이 균은 혈전용해효소 isozyme을 적어도 5개 이상 생성하는 균주로 확인되었다.
흑두를 이용하여 제조된 청국에서 분리한 B. subtilis BB-1의 혈전용해동위효소를 확인하기 위하여 12% fibrin-poly- acrylamide gel상에서 전기영동을 실시하였다. Fibrin 분해능을 지닌 단백질 분획은 활성염색법에 의해gel상의 fibrin을 분해하여 Coomassie blue R-250 염색 결과 투명대로서 활성을 가지는 5종류의 혈전용해효소 isozyme band를 Fig.
대상 데이터
1 ml를 도말한 후 단일 colony를 분리하였다. 분리된 colony를 LB broth 5 ml에 접종하여 37℃에서 optical density (OD)가 L0이 되게 배양한 후 fibrin plate에 20 ul씩 loading하여 혈전용해능 이 가장 우수한 미생물을 선발하였다. 미생물의 동정은 한국 미생물 보존센터 (KCCM)에 의뢰하여 16s rDNA sequence에 의한 유전자 간의 상동성비교로 동정하였다.
사용된 숙주 세포로서는 Escherichia coli XLl-blue (swpE+ lac- hsdR17 recAl F μmAB+ lad Z Z1M15)[4]을 사용하였고 cloning 및 subcloning vector로서 pBluescript II SK(-) [Stratagene®]와 pET-28a(+) [Novagen®] vector# 사용하였다
청국 제조를 위해 원료인 콩은 재래시장에서 시판중인 한 국산 흑두를 구입하여 사용하였다. 연등의[15]의 방법을 변형하여 원료콩을 세척 후 20℃의 멸균수에서 10시간 동안 침지하여 100℃에서 1시간의 조건으로 증자한 후 상온에서 냉각시 켰다.
이론/모형
Gel electrophoresis는 TAE buffei를 사용한 Maniatis 방법[18]에 따랐으며, agarose g이 상에서 분리된 DNA단편은 g인 elution 방법[2디을 이용하여 추출 회수하였다.
Plasmid DNA 분리 정제는 rapid alkaline lysis법[5]과 Spin column kit (IntRon)를 이용하였고, 각종 plasmid를 사용한 형질 전환은 Hanaha미 11] 이 확립한 과정에 따라 실시하였다.
혈전용해효 소 유전자의 염기서열 분석은 Sanger의 dideoxy termination method]24J에 따라 ABI 377A 자동 염기서열 분석기에서 분석하였다.
성능/효과
coli XLLblue에 형질전환시켰다. Ampicillin과 X~galz IPTG가 포함된 선별 배지에서 자란 약 L500여개의 형질전환 체 중에서 혈전용해력을 갖는 하나의 clone이 확인 되었다(Fig. 5). 이 균으로부터 plasmid를 분리하여 insert를 확인하여 본 결과 약 3.
이 재조합 DNA를 BSF-1 으로 명명하였다. BSF-1은 기존에 알려진 혈전용해효 소유전자와는 상동성을 전혀 보이지 않아 새로운 혈전용해효소 유전자임을 알 수 있었다. 이 유전자는 안정성과 높은 생리활성[3]이 입증된 청국의 고초균에서 분리되었다는 점에서 식품 제조 사용 시 위험성을 배제할 수 있으며, 혈전증 및 순환기 계통의 성인병에 대한 예방인자로 사용 가능하리라 판단된다.
BSF너을 함유한 균주의 혈전용해 활성 측정 및 기질특이성 조사 BSF-1 을 함유한 균주의 혈전용해능을 조사하기 위하여 대조구로서 pBSK(-)를 가지고 있는 XLLblue를 사용하여 혈전용해활성과 기질특이성을 조사한 결과 재조합 균주의 배양 상등액(Fig. 9, A)과 초음파 파쇄(Fig. 9, B)에서 혈전분해 활성이 관찰되었다 BSFJ의 활성은 초음파 파쇄물보다 활성은 낮았지만 혈전분해능이 보이는 것을 관찰하였다.이 결과에 의하여 이효소는 세포 외로 분비되는 exotype enzyme임을 알 수 있었다.
subtilis BB-1의 혈전용해동위효소를 확인하기 위하여 12% fibrin-poly- acrylamide gel상에서 전기영동을 실시하였다. Fibrin 분해능을 지닌 단백질 분획은 활성염색법에 의해gel상의 fibrin을 분해하여 Coomassie blue R-250 염색 결과 투명대로서 활성을 가지는 5종류의 혈전용해효소 isozyme band를 Fig. 4와 같이 확인하고 대략적인 분자량은 60, 45, 30, 25, 19 kDa이었다.
국내산 흑두로 제조한 청국에서 혈전용해능이 있는 미생물을 9종 분리 하였으며(Fig. 1), 혈전용해능의 크기를 plasmin 1 unit와 비교 실험을 실시한 결과 Table 2와 같이 BB-1 균 주 가 생성하는 효소가 400%, BB-2는 324%, BB-3, 4는 100%, BB-7은 196%, BB8은 196%, BB-9는 100%로 BB-1 균주의 활성이 가장 높았다. 혈전용해능이 우수한 BB-1의 동정을 위해서 한국미생물 보존센터에 16s rDNA sequence를 의뢰하여 분석 결과 그 유전자의 상동성이 Bacillus subtilise- 99% 유사성을 가지는 것으로 Fig.
0 kb 인 하나의 band를 얻었으며, 염기서열의 결정은 먼저 T7 primer와 T3 primer를 이용하여 양방향으로 염기서열을 확인하고 확인된 후 다시 연속적으로 새로운 primer을 합성하여 확인함으로서 최종적으로 중복되는 연결 순서에 의해 전체적인 염기서열을 결정하였다. 염기서열을 토대로 제한 효소 지도를 작성한 후 PCR을 이용하여 크로닝한 결과 약 2.5 kb 크기의 DNA단편안에 혈전용해효소를 생산하는 유전자가 포함된 클론을 확인하였다(Fig. 6, 7). 이 재조합 DNA를 BSF-1 으로 명명하였다.
5). 이 균으로부터 plasmid를 분리하여 insert를 확인하여 본 결과 약 3.0 kb의 insert 단편을 확인하였다. 이때 CM I으로 절단시 inserts] size와 vector size가 유사하여 vector5] multi cloning site (MCS)에 있는 BamH I으로 절단한 결과 6.
1), 혈전용해능의 크기를 plasmin 1 unit와 비교 실험을 실시한 결과 Table 2와 같이 BB-1 균 주 가 생성하는 효소가 400%, BB-2는 324%, BB-3, 4는 100%, BB-7은 196%, BB8은 196%, BB-9는 100%로 BB-1 균주의 활성이 가장 높았다. 혈전용해능이 우수한 BB-1의 동정을 위해서 한국미생물 보존센터에 16s rDNA sequence를 의뢰하여 분석 결과 그 유전자의 상동성이 Bacillus subtilise- 99% 유사성을 가지는 것으로 Fig. 2, 3과 같이 동정되었다. 따라서 이 균을 Bacillus subtilis BB-1 로 명명하고 한국미생물 보존센터 (KCCM)에 위탁관리시켰으며, 관리번호는 KFCC 11344P이다.
혈전용해효소 생산의 최적 pH와 온도를 검토한 결과 Fig. 11과 같이 pH 5.0, 온도 35℃에서 가장 높은 활성을 나타내었다. pH 5.
참고문헌 (30)
Astrup, T and S. Hullertz. 1952. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity. The National Danish Society against Rheumatic Disease. 346-351
Astrup, T. and Stermdorff, I. 1956. The plasminogen activator in animal tissue. ACTA physiol. scand., 363 250
Bok-Nan Kim, Jong-Dai Kim, Seung-shi Ham, Yong-Sorn Choi and Sang-Young Lee. 1995. Effects of spice added natto supplementation on the Lipid Metabolism in Rats. J. Korean Soc. Food Nutr., 24(1), 121-126
Bullock, W.O., J. M. Fernandez and J. M. Short. 1987. XL1blue: A high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with beta galactosidase selation. Bio Techiques 5, 376
Birhbion, H. C. and J. Doly. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acid Res. 7, 1513-1523
Fletcher, A. P and Johnson, A. J. 1975. Methods employed for purification of streptokinase., Par. Soc. Exp. Bial. Med., 94, 233
Fujita, M, Hong, K., lto, Y., Misawa, S., Takeuchi, N., Kartya, K and Nishimuro, S. 1995. Transport of nattokinase across the rat intestinal tract. BioI. Pharm Bull. 18, 1194-1196
Fujita, M., Nomura, K., Hong, K., lto, Y., Asada, A and Nishimuro, S. 1993. Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme(nattokinase) in the vegetable cheese natto, a popular soybean fermented food in Japan. Biochem. Biophys. Res. Comm. 197, 1340-1347
Hanahan, D. 1985. Techniques for transformation of E. coli, pp. 109-135. In D. M. Glover(ed.), DNA cloning, vol. I. IRL press, Oxford
Kim YT, Kim WK and Oh HS. 1996. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme producrd from Bacillus sp. strain CK11-4 screened from chungkookjang. Appl Envitronm Microbiolo. 2482-2488
Kim SH. 1998. New trends of studying on potential activities of Doen-jang. Korea Soybean digest, 15(1), 8-15
Kim HK, Kim GT, Kim DK, Choi WA, Park SH, Jeong YK and Kang IS. 1997. Purification abd characterization of a novel fibrinolytic enzyme from Bacillus sp. KA38 originated from fermenter fish. J of Ferment and Bioengin, 84(4), 307-312
Kyu-chum Youn, Dong-Ho Kim, Jang-Ok Kim, Byung-Jun Park, Hong-Sun Yook, Jae-Min Cho and Myung-Woo Byun. 2002, Quality characteristics of the chung kook jang fermented by the mixed culture of Bacillus natto and B. licheniformis. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 31(2), 204-210
Mihara H, Nakajima N and Sumi H. 1993. Characterization of potent fibrinolytic enzyme in earthworm, Lumbicus rubellus. Biosci. Biotech. Biochem, 57(10), 1730
Mihara H, Sumi H, Yonata T, Mizumoto H, Ike da R, Seiki M and Maruyama M. 1991. A novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthqorm, Lumbricus rubellus. Jpn J Physiolo, 41, 461
Maniatis, T., E. F. Fritsch and J. Sambrook. 1989. Molecular cloning A Laboratory Manual. Cold spring Harbor Laboratory, New York
Nakajima, N., Taya, N and Sumi, H. 1993. Potent fibrinolytic enzyme from the lysate of katspwonus pelamis digestive tract (shiokara) : purification and characterization. Biosci. Biotech, Biochem. 57, 1604-1605
Nakamura, T., Yamagata, Y and lchishima, E. 1992. Nucleotide sequence of the subtilisin NTA gene, aprN, of Bacillus subtilis(natto). Biasci. Biotech. Biochem. 56, 1869-1871
Nack-Shick Choi, Kab-Seog Yoon, Jin-Young Lee, KyoungYoen Han and Seung-Ho Kim. 2001. Comparison of three Substrates(casein, fibrin, and gelatin) in Zymographic Gel. J. Biochemistry and Molecular Biology, 34(6), 531-536
Park YD, Kim JW, Min BG, Seo JW and Jeong JM. 1998. Rapid purification and biochemical characteristics of Lumbrokinase III from earthworm for use as a fibrinolytic agent. Biotechnol Lett, 20(2), 169-172
Sumi, H., Seiki, M., Morimato, N., Tsushima, H., Maruyama, M and Mihara, H. 1985. Plasma fibrinolysis after intraduodenal administration of urokinase in rats. Enzyme 33, 121-127
Sumi, H., Hamada, H., Tsushima, H., Mihara, H and Muraki, H. 1987. A novel fibrinolytic enzyme(nattokinase) in the vegetable cheese Natto. a typical and popular soybean food in the japan diet. Experientia. 43, 1110-1111
Toki, N., Sumi, H., Saski, K., Boreisha, I and Robbins, K. C. 1995. Transport of urokinase across the intestinal tract of normal Uman Subjects with Stimulation of synthesis and release of urokinase-type proteins. J. din Ivest., 75, 1212
Yong-Kee Jeong, Woong-Suk Yang, Jeong-Ok Kang, In-Soo Kong, Jeong-Ok Kim. 1995. Fibrinolysis of fermented kimchi. Korean. J. Life Science, 5(4), 203-210
Yoo CK, Seo WS, Lee CS and Kang SM. 1998. Purification and characterization of fibrinolytic enzyme extracted by Bacillus subtilis K-54 isolated from chunggukgang. Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 26, 507-514
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