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문제 정의
- 따라서 본 연구는 혈전용해효소 활성이 우수한 균주를 분리하고, 분리, 동정한 강력한 피브린 분해활성을 나타내는 Bacillus sp. 균주로부터 혈전용해효소 생성 조건을 확립 하여 기능성 식품산업 에 이용할 수 있는 기초 자료를 마련 하고자 한다.
제안 방법
- Fibrin plate-J- 80℃에서 30분간 열처 리하여 plasminogen 을 제거 한 plate(plasminogen-free fibrin plate)와 열처 리하지 않은 fibrin plate(plasminogen-rich fibrin plate) 에 조효소액 의 반응을 비교하였다.
- 4) 에 1% 농도가 되게 녹인 osmic acid(OsO4) 용액으로 4℃에서 24시간 동안 처리하여 고정시켰다. 고정된 sample에서 용액을 제거한 뒤에 50, 70, 80, 90 및 95% 에탄올에서 각각 10분간 2회씩 탈수시켰다. 탈수한 뒤에 sample을 임계점 건조기에서 건조하고 platinum coating한 다음 주사 전자 현미경 (SEM, JSM-6700F, JEOL, Tokyo, JAPAN) 으로 형태를 관찰하였다.
- 무기질원의 종류에 따른 균체의 생육 및 효소활성을 측 정하기 위해 이미 수행된 탄소원과 질소원을 이용한 LB배 지의 NaCl을 동일농도의 yeast extract, K2HPO4, KH2PO4, MnSO4, MgSO4, ZnSQ, Cad2, FeSO4 로 대체하고 배양초기 pH를 동일하게 6.8로 조정한 후 30℃에서 18시간 배양한 후 균체의 생육과 효소활성도를 측정하였다.
- 미 량원소의 종류에 따른 혈전용해효소 활성을 비교하기 위해 LB배지 에서 NaCl을 대신에 yeast extract, K2HPO4, KH2PO4, MnSO4, MgSO4, ZnSO4, CaCl2, FeSd를 0.15% 수준으로 대체하여 30℃에서 18시간 배양한 후 원심 분리한 상등액을 이용하여 혈전용해효소 활성을 비교하였다. 혈전 용해효소 활성은 K2HPO4를 사용했을 때 가장 활성이 높았 다(Fig.
- 또한, 분리 Bacillus sp. 배양 시 가장 우수한 fibrinolytic enzyme활성을 나타낸 galactose를 각각 LB배지 에 무첨가, 1%, 2%, 3%, 4% 농도가 함유되도록 하여 30℃에서 18시간 배양한 후 균체의 생육과 효소활성도를 측정하였다.
- 그리고, 전 배양된 분리 미생물 Bacillus sp. 배양액을 각각 3% 농도로 접종하여 30℃ 에서 18시간 배양한 후 균체의 생육과 효소활성도를 측정하였다.
- 분리 균주의 초기 pH변화에 따른 균의 생육과 효소 활성 의 변화를 알아보기 위해 배양배지의 초기 pH를 4~10으로 조절한 후 전 배양액을 3%씩 접종하고 30℃에서 24시간 배양한 후 균체생육과 효소활성도는 다음과 같다(Fig. 3). 배 양배지의 초기 pH 5 ~9까지 균체 생 육은 전체적 으로 양 호하였지만, 효소활성도는 pH 4부터 증가하기 시작하여 pH 6에서 가장 높게 나타났고 초기 pH가 6~8로 조정 후 배양한 결과 혈전용해활성이 우수하였다.
- 분리균주의 탄소원 종류에 따른 혈전용해효소 활성을 비교하기 위해 LB배지에 glucose, starch, sucrose, lactose, galactose를 각각 2%농도로 첨가하여 30℃에서 18시간 배양 한 후 8, 000xg에서 20분간 원심 분리하여 조제되어진 조효 소액을 fibrin plate에 30 pL를 paper disk에 가하여 37℃에서 4시간 후 형성되어진 분해환의 크기를 이용한 혈전용해활 성은 다음과 같다(Fig. 4). 사용되어진 탄소원에 대한 혈전 용해활성은 galactose를 사용하였을 때 가장 높았으며gaiactose농도에 나른 혈전용해활성은 농도에 비례하여 증가하는 경향을 나타내었으며 4%에서 가장 우수하였다(Fig.
- 선발된 균주는 NA agar배지에서 37℃에서 24시간 동안 배양 한 후 동정에 사용하였다. 분리된 미생물은 형태학적, 생화학적 특성을 조사한 후, API 50 CHB kit(BioMerieux Co, France)를 이용하여 동정을 실시하였다.
- 전통발효식품인 된장으로부터 높은 활성의 fibrinolytic enzyme를 생산하는 미생물을 수십 종 분리하였다. 산업적 으로 우수한 균종을 선별하기 위하여 분리된 미생물중 fibrinolytic enzyme활성과 성장 속도면에서 가장 우수한 균 주를 선별하여 하였으며, 형태학적, 생화학적 및 생리학적 특성을 조사한 후 Bacillus sp.로 동정되었다.
- 이때 형성된 단일 균락을 선 택하여 fibrin plate에 계 대하였으며 37℃에서 24시 간동안 배양한 후 균락 주변에 투명환을 생성하는 미생물 중 투명 환의 크기로 미생물을 분리하였다. 선발된 균주를 TSB (pancreatic digest of casein 17.0 g, enzymatic digest of soybean meal 3.09 g, dextrose 2.5 g, dipotassium phosphate 2.5 g, sodium chloride 5.0 g/L) 배지에서 액체배양한 후 fibrin plate 에 30 pL를 점 적 하여 fibrinolytic activity 측정하여 최종 선발 하였다.
- 그 하나는 혈액 중 plasminogen을 active type 인 plasmiii으로 변화시켜 plasmiri으로 하여금 fibrin을 분해하도록 하는 plasminogen activator type과 이와 무관하게 효소자체가 직접 혈전을 분해하는 direct active type이 있다. 이에 본 효소의 분해기작을 확인하기 위해 plasminogen-rich fibrin plate 와 plasminogen-free plate를 사 용하였다. 본 혈전용해효소는 plasminogen을 제거한 plasminogen-free plate에서도 plasminogen-rich fibrin plate 와 마찬가지로 활성을 발현하는 결과를 보였다.
- 접종된 삼각 플라스크는 37 ℃, 180 rpm으로 shaking incubator 에서 18시간 배양하여 fibrinolytic enzyme 활성 및 균의 생장정도를 확인하였다.
- 조효소액을 준비하기 위하여 여러가지 복합배지를 이용하여 균의 성장 및 protease활성이 가장 우수한 배지를 선택 하기 위해 MHB, BHI, LB, TSB, NB 배지를 각각 Dif&)사 (USA)에서 구입하여 각 배지 에 표기된 함량으로 각각 500 mL 삼각플라스크에 100 mLS] 부피가 되 게 조제 후 전배양 액을 각각 2%씩 접종하였다.
- 질소원의 종류에 따른 균체의 생육 및 효소활성을 측정 하기 위해 LB배지에 함유되어지는 1%의 trytone을 동일농 도의 peptone, yeast extract, malt extract, NaNOs, (NHQzSd, NHjCl, casein, soybean으로 대체하고 배양초기 pH를 동일 하게 6.8로 조정 한 후 30℃에서 18시간 배 양한 후 균체의 생육과 효소활성도를 측정하였다.
- 질소원의 종류에 따른 혈전용해효소 활성을 비교하기 위하여 LB배지에서 질소원인 1% tryptone 대신에 soybean, yeast extract, malt extract, # NHQ을 동일한 농도 로 대체하여 30℃에서 18시간 배양한 후 원심분리한 상등액 을 이용하여 혈전용해효소 활성을 비교하였다(Fig. 6). 혈전 용해효소 활성은 malt extract를 사용하였을 때 가장 높았으며, 탄소원의 결과에서와 같이 농도에서는 비례적으로 증가하는 경향을 나타내었으며 4%의 농도에서 가장 우수하 였다(Fig.
- 측정된 질소원 중에서 가장 우수한 fibrinolytic enzyme활 성을 가지는 질소원을 이용하여 무첨가, 2%, 4%, 6%, 8% 농도별로 하여 질소원 농도에 의한 균체의 생육과 효소활성 도를 측정하였다.
- 탄소원의 종류에 따른 균체의 생육 및 효소활성을 측정 하기 위하여 기본배지인 LB배지에 glucose, maltose, sucrose, lactose, galactose를 각각 2%농도로 첨 가하고 배 양액의 pH를 6.8로 조정하였다. 그리고, 전 배양된 분리 미생물 Bacillus sp.
- 고정된 sample에서 용액을 제거한 뒤에 50, 70, 80, 90 및 95% 에탄올에서 각각 10분간 2회씩 탈수시켰다. 탈수한 뒤에 sample을 임계점 건조기에서 건조하고 platinum coating한 다음 주사 전자 현미경 (SEM, JSM-6700F, JEOL, Tokyo, JAPAN) 으로 형태를 관찰하였다.
대상 데이터
- 경상남도 김해시일대의 가정에서 전통발효식품인 된장 으로부터 채집한 시료를 멸균수로 희석한 후 순차적으로 fibin plate 배지에 도말한 뒤 37℃에서 18시간 이상 배양하여 생성된 균주들 중 상대적으로 투명환이 가장 큰 균주를 선별하였다.
- 그런 다음 배양액을 다시 500 mL 삼각 플라스크의 100 mL LB액 체배지에 접종하여 동일한 조건에서 12시간 배양하였다. 지수성장기 말기에 분광광도계 (Spectrophotometer, HP 8452A)를 사용하여 660 nm에서 흡광도를 측정하여 흡광도 (660 nm)가 1.8에 이르렀을 때 이후 실험을 위한 전배양액 으로 사용하였다.
- 혈전용해효소를 분비하는 미생물을 분리하기 위하여 경 상남도 김해시 일대의 가정 에서 전통된장으로부터 시료를 채집하고, 시료 1 g을 100 mL의 멸균증류수에 현탁한 후 NB(Beef extract 3.0g, peptone 5.0 g/L agar plate에 도말하여 37C에서 24시간 배양하였다. 이때 형성된 단일 균락을 선 택하여 fibrin plate에 계 대하였으며 37℃에서 24시 간동안 배양한 후 균락 주변에 투명환을 생성하는 미생물 중 투명 환의 크기로 미생물을 분리하였다.
이론/모형
- Fibrinolytic enzyme 활성 및 균의 생장이 우수한 TSB배지 를 500 mL£] 삼각 플라스크에 100 mL이 되도록 조제하여 동일한 조건에서 18시간 배양 후 10, 000 X g로 20분 동안 원심분리를 실시하고 상등액을 취하여 조효소액으로 하였다. 단백질 정 량은 bovine serum albumin을 표준단백질로 하여 Lowiy법(21)에 따라 측정하였고, 준비된 조효소액은 -20℃에서 냉동보관하면서 사용하였다.
성능/효과
- Fibrinolytic enzyme생산을 위한 최적 배양조건은 초기 pH 6~8일 때 상대활성도가 &)%이상을 나타내었고, 배양 12시간째 에 가장 높은 활성 도를 나타내었다. Fibrin plate를 이용한 혈전용해능을 확인한 결과 높은 혈전용해능을 가지고 있었다. 탄소원으로 galactose를 4% 첨가 하였을 때 가장 우수하였으며, 질소원은 malt extract를 4% 첨가 하였을 때 가장 우수하였다.
- Fibrinolytic enzyme생산을 위한 최적 배양조건은 초기 pH 6~8일 때 상대활성도가 &)%이상을 나타내었고, 배양 12시간째 에 가장 높은 활성 도를 나타내었다. Fibrin plate를 이용한 혈전용해능을 확인한 결과 높은 혈전용해능을 가지고 있었다.
- 2와 같다. 균체의 생육은 배양 6시간부터 급격히 증가하기 시작하여 배양 15시간 이후에 최대성장을 나 타내었고 그 이후로 감소하는 경향을 나타내었다. 혈전용 해효소의 활성은 균체 생장과 동일한 형태로 활성을 나타나 기 시작 하였으며, 이는 Ok 등(23)이 보고한 Bacillus sp.
- lichenijbmis를 이용한 protease 생성에 관한 실험에서 탄소원으로 lactose?} 좋았 다고 하여 본 균주의 galactose와 lactose의 결과가 우수한 것과 유사하였으며, Choi 등(25) 및 Lee 등(26)이 재래식 간장에서 분리한 Bacillus subtilis globigii는 탄소원으로 soluble starch 2% 첨가시 효소활성이 첨가한 다른 탄소원에 비해 효소활성이 크게 증가함을 보고한 것과 Kim(27)이 혈전용해효소 생산균주로 분리한 Bacillus sp. 는 glucose, fructose, lactose, sucrose 등 대부분의 단당류와 이당류를 첨가시 효소생성이 억제되었다고 하여 본 실험에서 분리한 균주와 많은 차이를 보였다.
- 3). 배 양배지의 초기 pH 5 ~9까지 균체 생 육은 전체적 으로 양 호하였지만, 효소활성도는 pH 4부터 증가하기 시작하여 pH 6에서 가장 높게 나타났고 초기 pH가 6~8로 조정 후 배양한 결과 혈전용해활성이 우수하였다. 그러나, 배양 후 의 배양액의 pH는 전체적으로 8.
- 분리균주는 Gram staining 결과 양성을 나타내었으며, spore staining에서는 spore가 존재하였고 전자현미경으로 확인한 결과 간균의 형태를 가지고 있었다.(Fig.
- 4). 사용되어진 탄소원에 대한 혈전 용해활성은 galactose를 사용하였을 때 가장 높았으며gaiactose농도에 나른 혈전용해활성은 농도에 비례하여 증가하는 경향을 나타내었으며 4%에서 가장 우수하였다(Fig. 5). 이상의 결과는 Koo 등(24)의 B.
- 전통발효식 품으로부터 분리 된 Bacillus sp. 조효소액 의 혈전용해활성을 fibrin plate를 이용하여 각각 50 yL와 100 pL를 8 mm paper disk 위에 분무하여 37 ℃ 에서 2시간이 지난 후 확인한 결과 분리균에서 우수한 혈전용해활성을 확인할 수 있었으며, Hbnn plate를 이용한 분리 균의 혈전 용해활성은 8시간까지 2시간 간격으로 형성되는 투명환의면적이 비례적으로 증가하는 경향을 나타내었으며. 이는 Lee 등(22)과 Kil 등(17)이 보고한 결과와 일치하였다.
- Fibrin plate를 이용한 혈전용해능을 확인한 결과 높은 혈전용해능을 가지고 있었다. 탄소원으로 galactose를 4% 첨가 하였을 때 가장 우수하였으며, 질소원은 malt extract를 4% 첨가 하였을 때 가장 우수하였다. 무기염은 K2HPO4를 첨가하였을 때 가장 우수한 활성을 나타내었다.
- 6). 혈전 용해효소 활성은 malt extract를 사용하였을 때 가장 높았으며, 탄소원의 결과에서와 같이 농도에서는 비례적으로 증가하는 경향을 나타내었으며 4%의 농도에서 가장 우수하 였다(Fig. 7). 이와 같은 결과는 Kakebina 등(28)이 Bacillus brevis를 이용 시 질소원으로 yeast extract?} 우수하였다고 보고하였으며, Lee 등(26)도 토양으로부터 분리한 alkaline protease 생성균주는 질소원으로 casein을 이용시 가장 높은 효소 생성 효과가 있어다고 보고한 결과와 유사하였다.
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