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문제 정의
- 본 연구에서는 새로운 항진균물질 발견의 일환으로 황련에서 분리된 단백질성분의 C. a"成如s에 대한 항진균효과를 검사하였다. 다양한 방법으로 획득한 황련단백질을 각각 BCA 단백질 정량방법으로 검사하였을 때, CRP-DS>CRP-60>CRP-WS>CRP-40 순서로 단백질 농도가 측정되었다.
- 본 연구에서는 생물학적 개념의 항생물질에 대한 연구 일환으로 수세기 동안 약용식물로 사용된 황련과 황벽을 선택하여 antifungal peptide 생성여부를 조사하였다. 근경부위를 사용하는 황련과 표피를 약용으로 이용하는 황벽의 대표적 성분은 알칼로이드 계열로 berberine, coptisine, worenine, palmatine, jatrorrhizine 등이 있으며, 이 중에서 가장 활발하게 연구되고 있는 berberinee 항균효과34斯)가 알려져 있다.
제안 방법
- CA-1과 A9 strainsi- 사용하였으며, 이 균주들은 그 특성이 규명된 균주g"로 GYEP(glucose, yeast extract, peptone) 고형배지에 37℃에서 48%간 먼저 배양한 후 GYEP 액체배지에 분주하여 shaker incubator에서 동일한 온도에서 24시간씩 세 번 계대 배양하여 3 徵 8) 사용하였다. 동물실험에서는 배양된 세포를 인산완중용액 (DPBS; Dulbecco's phosphate-buffered saline solution, Sigma, St.
- CRP 내에 혼재한 berberine에 의한 항진균효과 가능성 평가는, Sigma에서 구입한 berberine을 상기 기술한 Aagar Diffusion Assay 방법을 이용하여 항캔디다 효과를 비교 측정하였다. 사용된 berberine 농도는 0.
- 이 방법과정은 다음과 같다. CRPt RPMI 1640 medium(Cambrex, Bio-Whittaker Inc. USA)로 12.8, 6.4, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025 mg/m/ 농도로 순차적으로 희석하여 96 well plates에 100 讨씩 넣은 후 동일한 배양액에 희석한 C. albicanse 각 well에 접종한 후 37℃에서 배양하였다. 양성 대조군은 동일 양의 fluconazole(50 |也!旬)을 well에 CRP 대신 넣어 주었다.
- CRP의 항균효과가 CRP에 잔재된 berberine에 의한 것 인지 확인하기 위해 다양한 berberine 농도에서 항진균효과를 Agar Diffusion Susceptibility 방법으로 측정하여 CRP-DS의 항균효과와 비교하였다. 이 실험에 앞서 H2O2-HC1 반응에 미약한 양성반응을 나타내는 CRP-DS 내의 berberine 잔재여부를 HPLC 방법으로 분석하였을 때, berberine 잔재율은 대략 4% 정도로 검색되었다(Fig.
- 분석결과는 표준품 berberine 을 상기 동일한 방법으로 용출된 결과와 비교 평가하였다. GPC 방법은 GPC 시스템 (GPC PDA RI 040317)을 사용하여 DPBS 용매에 녹인 CRP-DS 시료 200 B를 주입하고 60분 동안 신뢰구간 1.11 에서 용출하는 형성된 Molecular peak의 분자량을 측정하였다. 각 CRP 주줄물의 endotoxin 오염성여부는 LAL endotoxin kit (Timed Gel formation, Sigma)을 사용하여 검색하였다.
- 11 에서 용출하는 형성된 Molecular peak의 분자량을 측정하였다. 각 CRP 주줄물의 endotoxin 오염성여부는 LAL endotoxin kit (Timed Gel formation, Sigma)을 사용하여 검색하였다.
- 각 CRP-DS 내 berberine의 혼재 가능성 조사는 berberine 확인 시약인 HCI-H2O2을 사용하여 조사하였다. 양성대조 약품으로 berberine을 Sigma에서 구입하여 사용하였다.
- 구입한 생쥐는 항원조와 공기여과장치가 완비된 청결한 동물사육실 안에서 1주일간 적응시킨 후 사용하였고, 동물사육실의 환경은 온도 20+2℃, 상대습도는 50±10%로 유지하였으며 조명은 12시간 간격으로 밤과 낮을 조절하였다.
- 각 분말화 된 추출물은 냉동고에 보존하며 사용하였다. 단백질 확인과 농도측정은 BCA 시약(Pierce, USA)을 사용하여 즉정하였으며, 이때 BSA(Bovine Serum Albumin; Pierce, USA)를 표준단백질로 사용하여 실험물질과 비교하였다. 분자량측정은 전기영동 방법과 gel-permeation chromatography(GPC) 을 사용하였다.
- 사용하였다. 동물실험에서는 배양된 세포를 인산완중용액 (DPBS; Dulbecco's phosphate-buffered saline solution, Sigma, St. Louis, Mo, USA)으로 세척하여 원하는 세포농도를 hemocytometer로 숫자를 측정하여 DPBS에 희석하여 사용하였다.
- 동물에서 CRP의 항진균효과 검색 이전에 먼저 CRP의 생체 내 독성유무 검사를 하였다. 이 실험에서 BALB/c 생쥐에 CRP 를 복강 내로 투여하고 DPBS를 투여 받은 대초군의 생존률과비교하였다.
- ). 또 다른 방법으로, 감압 농축한 추출물을 멸균증류수 또는 DPBS에용해 한 다음 원심분리로 잔사를 제거한 상등액을 상기 방법으로 투석한 후 동결건조 하였다. 이 경우 물에 용해되는 추출물을 CRP-WS, DPBS에 용해되는 추출물을 CRP-DS로 각각 명칭 하였다.
-
황련단백질(Coptidis Rhizoma Protein)의 추출 및 단백질 분석
분말화 한 황련가루 50 g에 80% methanol(200 mZ)을 가하여 간헐적인 진탕을 하면서 실온에서 3일간 방치하였다. Methanol 로 추출한 상등액을 여과(TOYO No 2.
- 사용된 berberine 농도는 0.1, 0.2, 0.4, 0.6 mg/mZ이였으며 DPBS를이용하여 희석하였다.
- 양성 대조군은 동일 양의 fluconazole(50 |也!旬)을 well에 CRP 대신 넣어 주었다. 성장유무 관찰은 배양 48시간 후에 관찰하여 최소억제농도를 측정하였다. 최소억제농도에서 균의 성장 여부는 일정량의 배양액을 pour plating 방법으로 새 GYEP 고형배지에 접종한 후 colony 형성유무를 측정하였다.
- , Japan)한 후, 용액을 rotary vacuum evaporator(Eyele, Tokyo, Japan)으로 감압 농축하였다. 이 감압 농축한 추출물에 ammonium sulfete# 40%, 또는 60%로 처리한 다음 생성되는 침전물을 수집하여 dialysis tubing [MWCO=8, 000Da(Spectra/ Por, Spectrum Lab. Inc., USA)을 이용하여 멸균한 증류수에 대하여 4℃에서 96 시간 투석 한 후 동결건조(FD-1000, Tokyo, Japan) 하였다(이 추출물을 CRP-40, CRP-60로 명칭 하였음.). 또 다른 방법으로, 감압 농축한 추출물을 멸균증류수 또는 DPBS에용해 한 다음 원심분리로 잔사를 제거한 상등액을 상기 방법으로 투석한 후 동결건조 하였다.
- 독성유무 검사를 하였다. 이 실험에서 BALB/c 생쥐에 CRP 를 복강 내로 투여하고 DPBS를 투여 받은 대초군의 생존률과비교하였다. CRP의 실험용량은 1, 2, 4, 5mg/mouse이었다.
- 성장유무 관찰은 배양 48시간 후에 관찰하여 최소억제농도를 측정하였다. 최소억제농도에서 균의 성장 여부는 일정량의 배양액을 pour plating 방법으로 새 GYEP 고형배지에 접종한 후 colony 형성유무를 측정하였다.
- 이 plates를 4℃에서 24시간 배양한 다음 37℃ incubator에서 48시간 계속 배양한 후 성장저지환의크기를 측정하였다. 한편, CRP를 10 m以m/ 농도로 준비한 용액을 멸균된 시험관에 넣고 100℃로 고정된 수욕조에서 다양한 시간 동안 열처리 한 다음 DPBS로 원하는 농도로 희석하여 항진균효과를 검색하였다.3"39)
- 항진균활성이 CRP-DS 내에 잔재하는 berberine에 기인되는지를 조사하기위해 CRP-DS 내에 잔재하는 berberine양을 정량분석하여 항진균활성을 분석하였다. 이론상 추정할 때, CRP-DS 는 정제과정에서 분자량이 371.
대상 데이터
- 6~7주령의 BALB/c 암컷 생쥐 (Charles River Lab, NY, USA) 를 사용하였으며, 고압 멸균한 filter cages에서 사육하는 동안에 멸균된 사료(Orient, Seoul, Korea) 및 물은 자유롭게 먹게 하였다. 구입한 생쥐는 항원조와 공기여과장치가 완비된 청결한 동물사육실 안에서 1주일간 적응시킨 후 사용하였고, 동물사육실의 환경은 온도 20+2℃, 상대습도는 50±10%로 유지하였으며 조명은 12시간 간격으로 밤과 낮을 조절하였다.
- 또한, 정밀분석을 위해 HPLC 방법을 사용하였다. 사용된 HPLC에서 이동상은 Acetonitrile 0.005 M PIC-B6, 0.1% RA 혼합액(3:7, v/v)을 사용하였으며 CRP(0.2 mg/m/) 10 p/을 Cosmosil 5C18-AR-U(4.6 x 150 mm) 칼럼에 주입한 다음 유속을 0.8 m〃min으로 조절하여 용출액을 파장 345 nm에서 측정하였다. 분석결과는 표준품 berberine 을 상기 동일한 방법으로 용출된 결과와 비교 평가하였다.
- albica炳을 DPBS에 적절한 세포농도(lx 106 cells/m/)로 희석한 후, GYEP 고형배지에 멸균한 면봉으로 도말하고 직경 6 mm 의 well을 만든 다음 이 wells에 다양한 농도의 CRPt 100 pW씩각 well에 넣어주었다. 사용된 농도는 0.5 mg/rn/, 1 mg/m/, 2 mg/ mZ였으며, 시료의 희석은 DPBS를 사용하였다. 대조군 well에는 DPBS 100 B만을 넣었다.
- 을 사용하여 조사하였다. 양성대조 약품으로 berberine을 Sigma에서 구입하여 사용하였다. 또한, 정밀분석을 위해 HPLC 방법을 사용하였다.
- 황련 (Coptidis Rhizoma)과 황벽 (Phellodendri Radix)은 서울 경동시장에서 식품의약품안전청(KFDA)에서 인증된 제품을 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 05 미만일 경우 유의성이 있는 것으로 판정하였다. 동물실험 결과생존률의 통계적 유의성은 Kaplan-Meier lest 방법 (Systat 7.0; New Statistics of Windows; SPSS, Chicago, IL, USA)으로 산출하였다.
- 8 m〃min으로 조절하여 용출액을 파장 345 nm에서 측정하였다. 분석결과는 표준품 berberine 을 상기 동일한 방법으로 용출된 결과와 비교 평가하였다. GPC 방법은 GPC 시스템 (GPC PDA RI 040317)을 사용하여 DPBS 용매에 녹인 CRP-DS 시료 200 B를 주입하고 60분 동안 신뢰구간 1.
- 실험결과는 평균土표준오차(Mean土SE.) 으로 계산하였으며 각 군 간의 유의성은 Student's f-test를 사용하여 P 값이 0.05 미만일 경우 유의성이 있는 것으로 판정하였다. 동물실험 결과생존률의 통계적 유의성은 Kaplan-Meier lest 방법 (Systat 7.
이론/모형
- CRP의 최소억제농도(MIC)는 Broth Dilution Susceptibility 방" 법4i菇 측정하였다. 이 방법과정은 다음과 같다.
- 양성대조 약품으로 berberine을 Sigma에서 구입하여 사용하였다. 또한, 정밀분석을 위해 HPLC 방법을 사용하였다. 사용된 HPLC에서 이동상은 Acetonitrile 0.
- 단백질 확인과 농도측정은 BCA 시약(Pierce, USA)을 사용하여 즉정하였으며, 이때 BSA(Bovine Serum Albumin; Pierce, USA)를 표준단백질로 사용하여 실험물질과 비교하였다. 분자량측정은 전기영동 방법과 gel-permeation chromatography(GPC) 을 사용하였다. 전기영동은 본 연구실에서 많이 사용하는 SDS-PAGE 방법40)을 사용하였다.
- 분자량측정은 전기영동 방법과 gel-permeation chromatography(GPC) 을 사용하였다. 전기영동은 본 연구실에서 많이 사용하는 SDS-PAGE 방법40)을 사용하였다.
성능/효과
- Agar Diffusion Susceptibility 방법에 의한 각종 CRP의 C.(沥如is에 대한 항진균효과를 검색한 결과, 대조군 well과 비교하였을 때 CRP-DS가 성장을 최고로 억제하였으며 (FvO.05), 항캔디다 효과가 이미 검증된%)berberine과 동일한 농도에서 비등한 효과를 가지며 CRP-60 보다 생장저지환의 크기가 2배 이상임을 알 수 있었다(Table II). 항진균활성이 가장 우수한 CRP-DS의 경우에 0.
- 8인 berberine0] pore-size가 8, 000 Da 이하인 투석막을 통과하여 제거되어야 하지만 실제로 정제 후 각 CRP들의 정성분석 결과에서 모두 berberine이 존재하였다. Berberine으로 인한 황색 투석액이 모두 소실한 후에, 가장 항균력이 우수한 CRP-DS에 잔재하는 berberine량을 HPLC 방법으로 측정한 결과 약 4%(=8 瞄) 정도의 berberine이 함유되어 있었다. 그러므로 CRP-DS의 항진균효과가 잔재된 berberine 으로 인한 효과인지를 검색하기 위해 다양한 농도의 berberine 의 항진균효과를 비교하였을 때 10ng(0.
- CRP-DS를 열처리한 후, 항진균효과를 검색에서, 10분간 열처리는 거의 영향이 없었으나 30분 또는 60분간 열처리 했을 때, 20%와 40% 정도의 항진균효과가 감소되었다(Table Ⅲ).
- 1). Gel-permeation chromatography 방법으로 분석하였을 때, molecular peak의 분자량은 대략 11.8 KDa 정도로 확인되었다. Endotoxin 검사에서 endotoxin이 검출되지 않았다.
- 3 - Antifungal effect of CRP-DS against disseminated candidiasis. Mice that were given CRP-DS (2 mg/mouse), peritoneally were challenged with C. albicans yeast cells (5 × 105 yeast cells/mouse) by intravenous route, and their survivability was measured. The CRP-treated mice survived longer than control mice that received DPBS during a period of 35-day observation (F<0.
- albicans yeast cells (5 × 105 yeast cells/mouse) by intravenous route, and their survivability was measured. The CRP-treated mice survived longer than control mice that received DPBS during a period of 35-day observation (F<0.01).
- Berberine으로 인한 황색 투석액이 모두 소실한 후에, 가장 항균력이 우수한 CRP-DS에 잔재하는 berberine량을 HPLC 방법으로 측정한 결과 약 4%(=8 瞄) 정도의 berberine이 함유되어 있었다. 그러므로 CRP-DS의 항진균효과가 잔재된 berberine 으로 인한 효과인지를 검색하기 위해 다양한 농도의 berberine 의 항진균효과를 비교하였을 때 10ng(0.1mg berberine/m/)의 berberinee 항진균효과가 없었으며, 심지어는 20|」g(0.2mg berberine/m/)에서 생성된 저지환의 크기도 CRP-DS의 항진균효과로 형성된 저지환의 크기보다 작았다. 이 실험결과로 CRP-DS 의 항진균효과가 berberine类로 기인한 것이 아님을 확인하였다.
- 다양한 방법으로 분리된 황련단백질을 BCA protein assay 방법으로 검색하였을 때, CRP-40, CRP-60 에는 단백질 농도가 대략 9.7%, 32%로 각각 측정되었고 CRP-WS와 CRP-DS에는 16%, 91% 함유되어 있었다(Table 1). CRR40의 단백질 양은 대단히 극소량 검출되었다.
- 이 중에서 CRRDS는 전체 시료의 약 90% 정도로 대부분 단백질로 구성되어 있었다. 단백질 분리과정에서 ammonium sulphate에 의한 단백질 침전 방법을 사용했을 때보다 수용성 부분을 제거한 후 DPBS에 용해하는 부분을 취했을 때 단백질농도가 3배 정도 높았다. 이 황련단백질 (CRP) 시료들을 전기영동으로 검색하였을 때, 단일밴드로 분리되었으며 GPC 방법으로 분자량이 대략 11.
- 동물 생체 내 CRP-DS의 독성검사를 선행한 결과, 최고 5 mg CRP를 투여 받은 생쥐그룹과 음성 대조군 생쥐는 30일 관찰 기간 동안 모두 생존하였다. 이 결과는 CRP-DS는 최고 5 mg에서 독성이 없는 것으로 간주되었다(data not shown).
- 또한 이 항진균효과는 농도 의존성으로 관찰되었다. 동물을 이용한 실험결과를 고찰할 때, CRP-DS 는 전신성 캔디다 감염에 유의성 있는 효과가 있음이 관측되었다.
- 이 실험결과로 CRP-DS 의 항진균효과가 berberine类로 기인한 것이 아님을 확인하였다. 또한, 만약 항진균효과가 berberine 때문이라고 가정한다면, 황련처럼 berberine을 함유하고 있는 황벽을 CRP-DS 추출 방법과 동일한 방법을 사용하여 분리된 단백질 성분에서도 항진균효과가 예상 될 수 있으나, 황련에서 분리된 단백질처럼 그 항균효과가 없었다. 뿐만 아니라, CRP-DS는 열로 처리하였을 때 항균효과가 소실되는 점도 CRP의 항진균효과는 단백질 성분에 의한 것으로 평가된다.
- 이 결과를 근거로 흐}여 CRP-DS2] 캔디다 전신감염 실험에 사용될 농도를 정하였다. 실험결과, 35일간의 관찰기간 동안에 CRP-DS로 투여받은 생쥐그룹의 평균생존율은 26.6± 13.1(평균 土 표준오차)일이었으며, 반면에 대조군 생쥐그룹의 평균생존율은 8.6±1.5일로, CRP-DS를 투여 받은 생쥐그룹은 대조군보다 대략 18일 이상의 생존율이 연장되었다(F<0.01) (Fig. 3).
- 5)는 양이온이많으므로, 본 연구 결과(Table U)에서도 이 경우처럼 이온세기가 커질수록 항진균효과가 감소하는 것으로 보아 황련에서 분리된 단백질도 antimicrobial peptide처럼 작동하는 것으로 확증된다. 연구 결과를 종합하면, 황련에서 분리된 단백질은 최근 antimicrobial peptides로 알려진 새로운 개념의 항생물질로 추정되며 현재, 구체적인 CRP의 항진균 작용기전은 본 연구실에서 조사 중에 있다.
- CRR40의 단백질 양은 대단히 극소량 검출되었다. 이 각종 CRPt 동일한 농도에서 SDS-PAGE 전기영동으로 검색한 결과 모두 29 KDa 이하로 분석되었으며 단일밴드로 규명되었다(Fig. 1). Gel-permeation chromatography 방법으로 분석하였을 때, molecular peak의 분자량은 대략 11.
- 항균효과검색에서 사용된 CRP-DS의 최고농도인 2mg/m/ 농도에서 100 母씩 well에 투여할 경우, CRP-DS에잔재된 berberine 양을 환산하면 100에 약 8 μg 정도가 함유된 것으로 계산된다. 이 결과를 berberine의 항균효과와 비교하면, berberine 10 μg(0.1mg/mZ)에서는 전혀 항균효과가 없으며 40ng(0.4mg/m/)에서 관측된 성장저지환의 크기도 20 mm로 CRP-DS 2mg/mZ에서 형성된 성장저지환보다 25% 이상 더 작음을 알 수 있匸KTable IV).
- 2mg berberine/m/)에서 생성된 저지환의 크기도 CRP-DS의 항진균효과로 형성된 저지환의 크기보다 작았다. 이 실험결과로 CRP-DS 의 항진균효과가 berberine类로 기인한 것이 아님을 확인하였다. 또한, 만약 항진균효과가 berberine 때문이라고 가정한다면, 황련처럼 berberine을 함유하고 있는 황벽을 CRP-DS 추출 방법과 동일한 방법을 사용하여 분리된 단백질 성분에서도 항진균효과가 예상 될 수 있으나, 황련에서 분리된 단백질처럼 그 항균효과가 없었다.
- 항진균활성을 분석하였다. 이론상 추정할 때, CRP-DS 는 정제과정에서 분자량이 371.8인 berberine0] pore-size가 8, 000 Da 이하인 투석막을 통과하여 제거되어야 하지만 실제로 정제 후 각 CRP들의 정성분석 결과에서 모두 berberine이 존재하였다. Berberine으로 인한 황색 투석액이 모두 소실한 후에, 가장 항균력이 우수한 CRP-DS에 잔재하는 berberine량을 HPLC 방법으로 측정한 결과 약 4%(=8 瞄) 정도의 berberine이 함유되어 있었다.
- 8 KDa2^ 추정할 수 있었다. 정제된 CRP-DS, CRP-60, CRP-WS의 항진균활성 검색에서, CRP-DS의 최소억제농도는 대략 50 μ以m2 농도로 관찰되었고 이 농도는 현재 상용되고 있는 fluconazole의 효과와 비견할 수 있는 것으로 사료된다. 또한 이 항진균효과는 농도 의존성으로 관찰되었다.
- 즉, DPBS에 용해하는 CRP-DS(pH=7.4)의 경우에는 양이온이 거의 없는 상태이며, 수용성 CRP-WS(pH=5.5)는 양이온이많으므로, 본 연구 결과(Table U)에서도 이 경우처럼 이온세기가 커질수록 항진균효과가 감소하는 것으로 보아 황련에서 분리된 단백질도 antimicrobial peptide처럼 작동하는 것으로 확증된다. 연구 결과를 종합하면, 황련에서 분리된 단백질은 최근 antimicrobial peptides로 알려진 새로운 개념의 항생물질로 추정되며 현재, 구체적인 CRP의 항진균 작용기전은 본 연구실에서 조사 중에 있다.
- 05), 항캔디다 효과가 이미 검증된%)berberine과 동일한 농도에서 비등한 효과를 가지며 CRP-60 보다 생장저지환의 크기가 2배 이상임을 알 수 있었다(Table II). 항진균활성이 가장 우수한 CRP-DS의 경우에 0.5, 1, 2.0mg/mJ 농도에서 각각 9.0+1.2, 13.0± 1.4, 22.8土 L9 mm로 항균효과는 농도의존성임을 알 수 있었다. Broth Dilution Susceptibility 방법으로 MIC를 측정하였을 때, 대략 50 μg/mZ 농도에서 성장억제가 관찰되었다.
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