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문제 정의
- CRP의 직접적인 항캔디다 효과 이외에 탐식세포에 의한 항진균효과를 관찰하기 위해 대식세포 (macropha흉es)의 활성화 여부를 검색하였다. CRP를 macrophages에 처리한 다음에 24시간 후에 상등액을 취해 NO 생성을 측정한 결과, CRP는 macrophage를 활성화시켜 NO를 생성하게 하였으며 이 효과는 농도 의존적&로 검색되었다(Fig.
제안 방법
- 026:B6, L-2654, Sigma)를 1 μ以m/ 투여하였고 음성대조군 well에는 DPBS 100 以만을 첨가하였다. 24, 48 시간 배양 후에 세포배양액(100 을 새로운 96-well plate에 각각 넣고 Griess 시약23)을 첨가하여 30분 동안 반응시킨 다음 550 nm 의 파장에서 microplate reader(Winooski, Vermont, USA)로 흡광도 값을 측정하였다. 표준검량곡선은 NaNO2(Chameleon, Osaka, Japaim)을 사용하여 시험군의 NO 생성정도를 비교 측정하였다.
- CRP의 macrophage 활성을 조사하기 위해 NO 생성여부를 본 연구실에서 사용하는 방법으로 이행하였다.2324)간략히 기술하면, RAW 264.
- CRP의 피부캔디다증에 대한 효과를 조사하기 위해 nude mice 에 항호중구 단항체 (RB68C5>를 25 mg/mouse 농도로 정맥주사한 후, 48시간 후에 C. albkans(\ x 107 yeast cells/mouse)와 CRP 100 昭/mouse를 이 생쥐 등부분에 피하주사하고 감염 부위의 크기를 측정하여 CRI를 투여하지 않은 대조군과 비교하였다. 또 다른 실험군으로는 RB68C5 항체로 전처리하지 않고 CRP와 C.
- CRP의 항진균효과의 작용기전 검색을 위해, C. albicws의 주요 병원성인자의한 종류인 균사생성 억제효과를 조사하였다. 균사 유도를 위해 정상생쥐(BALB/c strain)의 혈청을 5%로 GYEP 액체배지에 첨가하고 CRP를 0.
- 成版彻s에 대한 성장억제 효과를 상기 기술한 한천확산방법汎5, 16)으로 검색하였다. CaClg의 농도를 0, 20, 40, 80, 100, 500 mM로 조정한 DPBS에 CRP의 최종농도가 2 mg/m〃卜 되도록 준비하여 사용하였다. 대조군 well에는 DPBS 100 만을 넣었으며 모든 plates는 4℃에서 24시간 배양한 후, 37℃ incubator에서 4&시간 배양하고 성장저지환의 크기를 측정하였다.
- 받는 것으로 보고 된바 있다.以14)본 실험에서는 CRP의 항진균효과가 이온세기의 영향을 받는지 조사하기 위해서 CRP 를 다양한 농도의 칼슘으로 전 처리한 후, C. 成版彻s에 대한 성장억제 효과를 상기 기술한 한천확산방법汎5, 16)으로 검색하였다. CaClg의 농도를 0, 20, 40, 80, 100, 500 mM로 조정한 DPBS에 CRP의 최종농도가 2 mg/m〃卜 되도록 준비하여 사용하였다.
- 간략하게 기술하면, 황련가루 50 g에 80% methanol(200 ml) 을 가하여 간헐적인 진탕을 하면서 실온에서 3일간 방치한 다음 상등액을 수집하여 여과(TOYO No 2. Tbyo Roshi Kaisha, Ltd.., Japan)한 용액을 rotary vacuum evaporator(Eyele, Tokyo, Japan)으로 감압 농축한 후, DPBS를 첨가하여 용해한 액을 dialysis tubing [NIWCO=8, 000 Da(Spectra/Por, Spectrum Lab. Inc., USA)]에 넣고 멸균 증류수에 대하여 4℃에서 96시간 투석한 후 동결건조(FD-1000, Tokyo, Japan) 하였다. 분말화한 CRP 는 -20℃에 보존하며 시용하였다.
- albicans를 투여한 대조군 nude mice그룹과 비교하였다. 감염 부위의 크기는 48시간 간격으로 측정하여 검사하였다.
- albicws의 주요 병원성인자의한 종류인 균사생성 억제효과를 조사하였다. 균사 유도를 위해 정상생쥐(BALB/c strain)의 혈청을 5%로 GYEP 액체배지에 첨가하고 CRP를 0.5 mg/ml 농도로 투여한 다음 효 모형 태 (blastoconidia, yeast form) 의 C. albicanse x 106 cells/ m/)를 접종하여 37℃ shaker incubator(150 rpm)에서 1.5~2시간 배양한 후, 200개 이상의 세포를 hemocytometer(Hausser Scientific Horsham, PA, USA)를 사용하여 현미경하에서 균사 형성 유무를 측정하였다. 혈청은 C.
- albica瓜로 유발된 피부캔디다증에 효과가 있는 것으로 사료된다. 그러나, 피부 적용 시에 햇빛에의 노출을 고려하여야 하므로 최소한적으로 CRP의 자외선 노출에 대한 안정성 유무를 조사하였다.
- 분말화한 CRP 는 -20℃에 보존하며 시용하였다. 단백질 함유정도는 BCA시약 (Pierce, USA)을 사용하여 측정하였고, 단백질 순도측정은 이전에 보고한 방법과 동일하게 전기영동 방법과 HPLC 방법을 사용하였으며, 处2)CRP 추출물의 endotoxin 오염성 여부는 LAL endotoxin kit(Timed Gel formation, Sigma)을 사용하여 검색하였다.
- albicans CA-1과 A9 strains'"”)를 사용하였으며, GYEP(glucose, yeast extract, peptone) 고형배지에 37℃에서 48人]간 먼저 배양한 후 GYEP 액체배지에 분주하여 shaker incubator에서 동일한 온도에서 24시간씩 세 번 계대 배양하여以16)사용하였다. 동물실험에서는 배양된 세포를 인산완충용액 (DPBS; Dulbecco's phosphatebuffered saline solution, Sigma, St. Louis, Mo, USA)으■로 세척하여 원하는 세포농도를 hemocytometer로 숫자를 측정하여 DPBS(pH =7.4)에 희석하여 사용하였다.
- albkans(\ x 107 yeast cells/mouse)와 CRP 100 昭/mouse를 이 생쥐 등부분에 피하주사하고 감염 부위의 크기를 측정하여 CRI를 투여하지 않은 대조군과 비교하였다. 또 다른 실험군으로는 RB68C5 항체로 전처리하지 않고 CRP와 C. albicans를 투여한 대조군 nude mice그룹과 비교하였다. 감염 부위의 크기는 48시간 간격으로 측정하여 검사하였다.
- 이 생쥐들은 고압멸균한 filter cages에서 사육하였으며, 멸균된 사료(Orient, Seoul, Korea) 및 물은 자유롭게 먹게 하였다. 사육은 항원조와 공기여과장치가 완비된 청결한 동물사육실 안에서 1주일간 적응시킨 후 사용하였고, 동물사육실의 환경은 온도 22±2℃, 상대습도는 50±10%로 유지하고 조명은 12시간 간격으로 밤과 낮을 조절하였다.
- , Korea) 에서 24, 48시간 동안 배양하였다. 양성대조군 well에는 LPS (pscherichia coli. 026:B6, L-2654, Sigma)를 1 μ以m/ 투여하였고 음성대조군 well에는 DPBS 100 以만을 첨가하였다. 24, 48 시간 배양 후에 세포배양액(100 을 새로운 96-well plate에 각각 넣고 Griess 시약23)을 첨가하여 30분 동안 반응시킨 다음 550 nm 의 파장에서 microplate reader(Winooski, Vermont, USA)로 흡광도 값을 측정하였다.
- albicansS. 인한 피부질환에 대한 CRP의 효과를 측정하였다. 부수적으로 본 실험에서 제시된 피부 캔디다증 동물모델은 약물의 피부캔디다증 효과검색에 이용될 수 있는 새로운 방법으로 기대된다.
- 즉, DPBS에 용해한 CRI를 멸균 유리시험관에 넣고 UV-lamp 하에서 1, 4, 5, 10시간 동안 조사(exposure)한 후 그 효과를 한천확산방법으로 측정하였다. UV-lamp는 fluorescent-typed lamp(15 Watts; 파장@ 312 nm; Uvitec, Korea)로 시 료와 UV-lamp와의 거리는 20 cm이었으며, 사용된 CRP의 농도는 2 mg/ 血으로 DPBS로 희석하여 사용하였다.
- 24, 48 시간 배양 후에 세포배양액(100 을 새로운 96-well plate에 각각 넣고 Griess 시약23)을 첨가하여 30분 동안 반응시킨 다음 550 nm 의 파장에서 microplate reader(Winooski, Vermont, USA)로 흡광도 값을 측정하였다. 표준검량곡선은 NaNO2(Chameleon, Osaka, Japaim)을 사용하여 시험군의 NO 생성정도를 비교 측정하였다.
- 피부캔디다증에 대한 CRP의 효과를 조사하기 전에, CRP의 피부 적용 시 안정성을 검색하기위하여 CRP를 UV로 처리한 다음에 한천확산방법 9, i5, i6)을 사용하여 항균효과 감소여부를 조사하였다. 즉, DPBS에 용해한 CRI를 멸균 유리시험관에 넣고 UV-lamp 하에서 1, 4, 5, 10시간 동안 조사(exposure)한 후 그 효과를 한천확산방법으로 측정하였다.
대상 데이터
- 본 연구실에 이전의 다른 연구에 많이 사용된 C. albicans CA-1과 A9 strains'"”)를 사용하였으며, GYEP(glucose, yeast extract, peptone) 고형배지에 37℃에서 48人]간 먼저 배양한 후 GYEP 액체배지에 분주하여 shaker incubator에서 동일한 온도에서 24시간씩 세 번 계대 배양하여以16)사용하였다. 동물실험에서는 배양된 세포를 인산완충용액 (DPBS; Dulbecco's phosphatebuffered saline solution, Sigma, St.
- 6~7주령의 BALB/c 암컷생쥐와 암컷 nude mice(CAnN.Cg-Foxnlnu/crl stra曲n)를 Charles River Lab, NY, USA에서 구입하여 사용하였다. 이 생쥐들은 고압멸균한 filter cages에서 사육하였으며, 멸균된 사료(Orient, Seoul, Korea) 및 물은 자유롭게 먹게 하였다.
- 즉, DPBS에 용해한 CRI를 멸균 유리시험관에 넣고 UV-lamp 하에서 1, 4, 5, 10시간 동안 조사(exposure)한 후 그 효과를 한천확산방법으로 측정하였다. UV-lamp는 fluorescent-typed lamp(15 Watts; 파장@ 312 nm; Uvitec, Korea)로 시 료와 UV-lamp와의 거리는 20 cm이었으며, 사용된 CRP의 농도는 2 mg/ 血으로 DPBS로 희석하여 사용하였다. 대조군 well에는 DPBS 100 B만을 넣었으며 모든 plates는 4℃에서 24시간 배양한 다음 37℃ incubator에서 48시간 계속 배양한 후 성장저지환의 크기를 측정하였다.
- 황련(Coptidis Rhizoma)은 서울 경동시장에서 식품의약품안전청(KFDA)에서 인증된 제품을 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과는 평균土표준오차(Mean土S.E.) 으로 계산하였으며, 각 군 간의 유의성은 Students t-test를 사용하여 P 값이 0.05 미만일 경우에 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
성능/효과
- alb诚ms의 성장을 억제하는 항진균효과가 있음이 汤-勿7m와 in-vivo 실험조건하에서 관측된바 있다.9) 분자량이 대략 12 kDa인 황련단백질(Coptidis Rhizoma Protein; CRP)의 항진균효과는 한천확산 감수성테스트방법으로 검색하였을 때 임상에서 상용되고 있는 fluconazole의 효과와 거의 동등한 것2로 판정되었으며, 또한 동물실험에서는 예방효과가 있었다. 部 그러나, CRP의 항균효과는 열에 불안정하여 CRP를 열처리하였을 때는 항균효과가 감소되어 단백질의 특성인 열에 불활성화됨을 알 수 있었다.
- CRP로 처리한 효모형태의 C. albicans를 90분 이후 현미 경하에서 형태변화를 관찰했을 때, CRP로 처리한 C. albicanse 50% 정도의 균사생성이 억제되었고, 균사를 생성한 C. albicans 중에서도 진균사(true hyphae) 생성은 27.5%로 관측된 반면에 DPBS 로 처리한 음성대조군은 거의 90%가 균사를 생성하였다(Table 1). 이는 출아(budding) 실패로 생성되어 균사처럼 보이는 소위가 균사(pseudohyphae) 생성이 CRP로 처리된 실험군이 음성대조군 보다 6배 정도 높아서 CRP의 작용기전은 세포막에 작용하여 성장 번식을 억제하는 것으로 인식된다.
- 검색하였다. CRP를 macrophages에 처리한 다음에 24시간 후에 상등액을 취해 NO 생성을 측정한 결과, CRP는 macrophage를 활성화시켜 NO를 생성하게 하였으며 이 효과는 농도 의존적&로 검색되었다(Fig. 1). 음성대조군의 경우 배양동 안 자연적으로 생성된 NO 농도는 0.
- CRP에 대한 자외선 영향을 검사한 결과, 자외선으로 처리하지 않은 CRP로 처리된 C. 이bicans의 성장억제환의 크기는 대략 27 mm로, 이 크기는 1시간 또는 4시간 동안 자외선으로 조사 (exposure)된 CRP의 항균효과와 비교할 때 차이가 거의 없었으며 , 그 이상의 기간인 5시간 또는 10시간 동안 자외선에 노출한 경우에도 CRP의 항균효과는 거의 변동이 없었다(Eble IV). 이 결과는 CRP가 자외선에 영향을 받지 않는 것으로 평가되어지므로 C.
- albiams로 유발된 피부캔디다증에 효과로 인하여, 음성대조군에 비교할 때 거의 90%의 효과가 있는 것2로 평가되었다. CRP의 피부 적용시 햇빛노출을 고려하여 CRT, 자외선 노출에 대한 안정성 유무를 조사한 결과, CRP의 항진균효과는 자외선에 영향을 받지 않는 것으로 밝혀져서 CRT, 외용적용에 안정한 것으로 고려된다. 본 실험의 부수적인'결과는 본 연구에서 제시된 피부 캔디다증 동물모델은 타 종류 약물의 피부캔디다증 효과검색에 적용가능성이 기대된다.
- CRP의 항진균효과에 대한 이온세기의 영향 조사에서 Ca2+ 이온의 농도가 증가함에 따라 CRP의 항진균효과가 농도 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었다(Eble H). CaCb의 농도가 100mM과 500mM인 경우에는 DPBS만 넣은 음성대조군에 비하여 각각 25%와 45%의 항진균효과가 감소됨을 관찰할 수 있었다.
- 감소함을 확인할 수 있었다(Eble H). CaCb의 농도가 100mM과 500mM인 경우에는 DPBS만 넣은 음성대조군에 비하여 각각 25%와 45%의 항진균효과가 감소됨을 관찰할 수 있었다. 그러므로, 이온세기에 의한 CRP의 효과감소는 기존의 antimicrobial peptide의 작용기전과 유사한 것으로 추정된다 10, 13, 14)
- 7 monocyteemacrophage cell line was treated with various doses of the CRg and NO production from the macrophages were measured with use of Griess reagents. Results showed that NO was produced from the CRP-treated macrophages in a dose-dependent fashion. The LPS used as a positive control resulted in NO production of (14.
- eg C Mbic血S으로 기인한 피부감염증에 대한 억제 효과 여부를 검사하였을 때, CRP를 투여 받은 생쥐군의 감염크기는 CRP 를 투여받지 못한 대조생쥐군에 비교할 때 거의 90% 정도의 감염 부위가 감소되어CP<0.05) 치료효과가 있음을 알 수 있었다 (Table Ⅲ). 또한, RB68C5로 전 처리하고 CRP를 투여 받은 생쥐그룹의 경우에도 CRP를 투여 받지 못한 음성대조군보다 감염 크기가 작으나 통계적으로는 유의성이 없는 것으로 판정되었다 (Bble ID).
- 9) 분자량이 대략 12 kDa인 황련단백질(Coptidis Rhizoma Protein; CRP)의 항진균효과는 한천확산 감수성테스트방법으로 검색하였을 때 임상에서 상용되고 있는 fluconazole의 효과와 거의 동등한 것2로 판정되었으며, 또한 동물실험에서는 예방효과가 있었다. 部 그러나, CRP의 항균효과는 열에 불안정하여 CRP를 열처리하였을 때는 항균효과가 감소되어 단백질의 특성인 열에 불활성화됨을 알 수 있었다.
- 반복 실험에서도 거의 동일한 실험결과가 획득되었다. 결과적으로, CRP는 C. albicszs의 가장 중요한 병원성인자인 균시생성을 방해하여 균의 병원성을 감소시킬 수 있는 것으로 사료된다.
- albicans의 성장을 억제함을 규명한바 있다. 계속적인 연구로 CRP의 C. albicanse 대한 성장억제 기전을 조사하고 C. albicans 로 기인한 피부질환에 대한 CRT© 효과를 조사결과, CRP의 항진균작용 효과는 C. albicansS] 가장 중요한 병원성인자인 균사생성을 방해하여 균의 병원성을 감소시키는 것으로 조사되었다. 또한, macrophages 활성화에 의한 NO 생성이 검색되었다.
- 이에 대한 근거로, 현재 진행 중인 실험에서 CRP가 최소 6 소단위의 peptide로 구성되어 있는 것으로 확인 되었다(unpublished data). 동물실험에서, CRP는 C. albiams로 유발된 피부캔디다증에 효과로 인하여, 음성대조군에 비교할 때 거의 90%의 효과가 있는 것2로 평가되었다. CRP의 피부 적용시 햇빛노출을 고려하여 CRT, 자외선 노출에 대한 안정성 유무를 조사한 결과, CRP의 항진균효과는 자외선에 영향을 받지 않는 것으로 밝혀져서 CRT, 외용적용에 안정한 것으로 고려된다.
- 05) 치료효과가 있음을 알 수 있었다 (Table Ⅲ). 또한, RB68C5로 전 처리하고 CRP를 투여 받은 생쥐그룹의 경우에도 CRP를 투여 받지 못한 음성대조군보다 감염 크기가 작으나 통계적으로는 유의성이 없는 것으로 판정되었다 (Bble ID). 상기 결과는 CRP가 C.
- 또한, RB68C5로 전 처리하고 CRP를 투여 받은 생쥐그룹의 경우에도 CRP를 투여 받지 못한 음성대조군보다 감염 크기가 작으나 통계적으로는 유의성이 없는 것으로 판정되었다 (Bble ID). 상기 결과는 CRP가 C. albica瓜로 유발된 피부캔디다증에 효과가 있는 것으로 사료된다. 그러나, 피부 적용 시에 햇빛에의 노출을 고려하여야 하므로 최소한적으로 CRP의 자외선 노출에 대한 안정성 유무를 조사하였다.
- 이bicans의 성장억제환의 크기는 대략 27 mm로, 이 크기는 1시간 또는 4시간 동안 자외선으로 조사 (exposure)된 CRP의 항균효과와 비교할 때 차이가 거의 없었으며 , 그 이상의 기간인 5시간 또는 10시간 동안 자외선에 노출한 경우에도 CRP의 항균효과는 거의 변동이 없었다(Eble IV). 이 결과는 CRP가 자외선에 영향을 받지 않는 것으로 평가되어지므로 C. albica瓜로 유발된 피부감염증에 CRP를 피부에 적용 시 햇빛에의 노출에 안정할 것으로 사료되어 진다.
- 7 cell line이 활성화 되었을 때 탐식작용이 증진되는 것과 비견하면, 탐식 작용의 증대가 추정된다. 한편, 이온세기에 의한 CRP의 효과감소는 기존의 antimicrobial peptide의 작용기전과 유사한 것으로 추정되어, 본 연구에서 최초로 밝혀진 CRP가 antimicrobial peptide의 한 종류로 사료된다. 이에 대한 근거로, 현재 진행 중인 실험에서 CRP가 최소 6 소단위의 peptide로 구성되어 있는 것으로 확인 되었다(unpublished data).
후속연구
- 이 모든 결과를 종합할 때, 황련에서 분리된 단백질은 최근 antimicrobial peptidessl 알려진 새로운 개념의 항생물질의 가능성이 있을 것으로 추정되며, 임상적인 적용가능성이전에 진균기인성 피부질환에 예방차원의 '제제 (예 : 기능성 향장품)로서의 가능성을 제시 할 수 있다. 또한 독성, 昱 인해 부작용이 많은 기존의 항진균제와 병용 사용하여 부작용을 감소시킬 수 있을 것으로 예상된다.
- CRP의 피부 적용시 햇빛노출을 고려하여 CRT, 자외선 노출에 대한 안정성 유무를 조사한 결과, CRP의 항진균효과는 자외선에 영향을 받지 않는 것으로 밝혀져서 CRT, 외용적용에 안정한 것으로 고려된다. 본 실험의 부수적인'결과는 본 연구에서 제시된 피부 캔디다증 동물모델은 타 종류 약물의 피부캔디다증 효과검색에 적용가능성이 기대된다. 이 모든 결과를 종합할 때, 황련에서 분리된 단백질은 최근 antimicrobial peptidessl 알려진 새로운 개념의 항생물질의 가능성이 있을 것으로 추정되며, 임상적인 적용가능성이전에 진균기인성 피부질환에 예방차원의 '제제 (예 : 기능성 향장품)로서의 가능성을 제시 할 수 있다.
- 인한 피부질환에 대한 CRP의 효과를 측정하였다. 부수적으로 본 실험에서 제시된 피부 캔디다증 동물모델은 약물의 피부캔디다증 효과검색에 이용될 수 있는 새로운 방법으로 기대된다.
- 본 실험의 부수적인'결과는 본 연구에서 제시된 피부 캔디다증 동물모델은 타 종류 약물의 피부캔디다증 효과검색에 적용가능성이 기대된다. 이 모든 결과를 종합할 때, 황련에서 분리된 단백질은 최근 antimicrobial peptidessl 알려진 새로운 개념의 항생물질의 가능성이 있을 것으로 추정되며, 임상적인 적용가능성이전에 진균기인성 피부질환에 예방차원의 '제제 (예 : 기능성 향장품)로서의 가능성을 제시 할 수 있다. 또한 독성, 昱 인해 부작용이 많은 기존의 항진균제와 병용 사용하여 부작용을 감소시킬 수 있을 것으로 예상된다.
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