[논문]고초균에서 폴리페놀로 유도된 DNA 손상에 대한 폴리페놀산화효소의 억제효과

김안근; 김유경; 강영숙

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Antimutagenic activity of the enzymatic browning reaction products (EBRPs) was investigated by using the spore rec-assay with Bacillus subtilis strains H17 $(rec^+)\;and\;M45 (rec^-)$. The EBRPs tested were prepared from the reactions of five different kinds of polyphenols with polyphenol...

Antimutagenic activity of the enzymatic browning reaction products (EBRPs) was investigated by using the spore rec-assay with Bacillus subtilis strains H17 $(rec^+)\;and\;M45 (rec^-)$. The EBRPs tested were prepared from the reactions of five different kinds of polyphenols with polyphenol oxidase isolated from the leaves Perilla frutescens. In the spore rec-assay, most of the polyphenolic compounds tested showed positive, whereas only their tested compound showed negative respectively. In addition of polyphenol oxidase inhibitors such as cysteine, glutathione and ascorbic acid to the reaction mixtures consisted with the polyphenol oxidase and polyphenols, the mutagenic effects were increased in the spore recassay. These results show that the activity of polyphenol oxidase may play an important role in the reduction of mutagenicity of polyphenols.

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문제 정의

이와 같이 폴리페놀 물질이 산화되어 갈변되면 변이원성이 급격히 저하되는 것으로 보고되어 있다.$ 저자 등은 고초균에서 페놀성 물질에 의한 DNA 손상이 PP。의 작용에 의해 억제 되는 현상은 PPO 효소의 작용으로 페놀성 물질의 감소에 의한 것인지 또는 생성된 갈변물질의 작용에 의한 것인지를 알아보기 위하여 연구에 착수하였다. 폴리페놀 물질 단독과 이들 폴리페놀 화합물이 PPO에 의한 효소반응 결과 생성되는 갈변물질, 또한 폴리페놀 물질 및 PPO에 효소 저해제를 첨가시켜 얻은 결과를 검토하여 고초균의 DNA 손상에 미치는 영향에 대해 일부의 지견을 얻었으므로 보고하고자 한다.
$ 저자 등은 고초균에서 페놀성 물질에 의한 DNA 손상이 PP。의 작용에 의해 억제 되는 현상은 PPO 효소의 작용으로 페놀성 물질의 감소에 의한 것인지 또는 생성된 갈변물질의 작용에 의한 것인지를 알아보기 위하여 연구에 착수하였다. 폴리페놀 물질 단독과 이들 폴리페놀 화합물이 PPO에 의한 효소반응 결과 생성되는 갈변물질, 또한 폴리페놀 물질 및 PPO에 효소 저해제를 첨가시켜 얻은 결과를 검토하여 고초균의 DNA 손상에 미치는 영향에 대해 일부의 지견을 얻었으므로 보고하고자 한다.

제안 방법

포자 한천 배지의 조제는 8 g의 Difco nutrient broth를 증류수에 완전히 용해한 후 15 g의 Difco bacto agar 를 가하여 autoclave에서 가열 용해하였다. 같은 배지를 2본 조제 하여 용해한 broth agar가 50°C 정도까지 냉각되면 포자 액을 U 당 10 mZ 가해 H₁₇ 및 M45 한천을 각각 조제한 후 plate 상에 10 m/씩 분주하여 H₁₇ 및 M45 포자 한천 배지를 고화시켰다. 고화된 포자 한천 배지 위에 직경 6 mm, 두께 1 mm의 paper disc를 plate당 3개씩 올려놓고 시료 용액을 15 叫, 10 叫 5 也씩 가한 다음 37°C에서 27시간 배양시킨 후 paper disc 주위에 생성된 생육저지대의 직경을 측정하여 M45 균 포자 한천 배지에 생성된 생육저지대와 H₁₇균 포자 한천 배지에 나타난 생육저지대 간의 차이를 계산하여 실험에 사용된 시료가 고초균의 DNA에 미치는 손상정도에 대한 강도로 표시하였다.
같은 배지를 2본 조제 하여 용해한 broth agar가 50°C 정도까지 냉각되면 포자 액을 U 당 10 mZ 가해 H₁₇ 및 M45 한천을 각각 조제한 후 plate 상에 10 m/씩 분주하여 H₁₇ 및 M45 포자 한천 배지를 고화시켰다. 고화된 포자 한천 배지 위에 직경 6 mm, 두께 1 mm의 paper disc를 plate당 3개씩 올려놓고 시료 용액을 15 叫, 10 叫 5 也씩 가한 다음 37°C에서 27시간 배양시킨 후 paper disc 주위에 생성된 생육저지대의 직경을 측정하여 M45 균 포자 한천 배지에 생성된 생육저지대와 H₁₇균 포자 한천 배지에 나타난 생육저지대 간의 차이를 계산하여 실험에 사용된 시료가 고초균의 DNA에 미치는 손상정도에 대한 강도로 표시하였다.
따라서 최근에 Triton X-114를 이용한 temperature-induced phase separation으로서 페놀성 물질과 클로로필이 다량 제거된 latent form의 PPO를 부분정제“也히는 등 다양한 정제법에 대한 연구13, 14)가 계속되고 있다. 이에 본 실험에서는 PPO를 추출하는데 phosphate buffer에 Triton X-114를 3% 첨가하여 35°C 에서 15분간 방치함로서 온도에 따라서 층이 분리되는 정제법을 이용하여 효소가 함유된 상층의 액을 취하여 그 액을 원심 분리하여 효소액으로 사용하였다(I3ble I).
추출한 효소를 기질 특이성 실험에 사용하였던 5종의 폴리페놀 화합물(pyrogallol, 4-methylcatechol, pyrocatechol, t- butylcatechol, gallic acid)과 24시간 동안 최적온도(45°C)에서 반응 시켜 갈변반응액을 얻었다. 이 반응액을 Whatman No.
페놀성 물질로 인한 DNA손상에 있어서 폴리페놀 산화효소 (PPO)의 억제효과를 spore rec-assay 결과를 통해 검토하였다. 폴리페놀 화합물인 pyrogallol, 4-methylcatechol, pyrocatechol, ^-butylcatechol 및 gallic acid 단독으로는 대부분 고초균의 DNA 에 손상을 일으키며, 대체적으로 폴리페놀 농도가 증가함에 따라 생육저지력도 촉진되는 경향을 보였다.

대상 데이터

본 실험에 PPO 효소를 얻는데 사용된 들깨 (Pe成2 frutescens) 잎은 서울 근교에서 채취하여 -70°C에서 보관한 후 사용하였다.
실험에 사용한 시약은 sodium dodesylsulfate, gallic acid (Junsei), bovine serum albumin, t-butylcatechol, tris(hydroxy- methyl)aminomethane, ammonium persulfate, 3-methyl-2- benzo-thiazolinone hydrazone, pyrocatechol, chlorogenic acid, polyvinyl pyrrolidone(PVP), hydrocaffeic acid, 4-nitroquinoline- N-oxide(Sigma), 4-methylcatechol(Aldrich), Nutrient Broth, Bacto agar Beef Extract, Dextrose(Difco)이고, 사용기기는 Ultracentrifuge(Beckman OptimaTM XL-lOOk), Dialysis sacks (Sigma Diagnostics), pH Meter(Mettler Delta 340), Centrifuge (Hanil Supra 2 IK), Freeze Dry System(Labconco), Labo Autoclave(Sanyo), Vortex mixer: Thermolyne MaxiMix U, Multilemp HI, Spectrophotometer(Pharmacia Biotech.), Microcuvettes(Kartell), Waterbath(Buchi Laboratoriums-Technik AG), Microcentrifuge(Hanil Micro-12), Haemacytometer (Superior; Germany), Plate(Becton Dickinson Labware)이며, 기타 시약들은 시판 특급(guaranteed reagent) 및 1급 시약을 사용하였다.
알 수 있었다. 양성 대조물질로는 발암물질로 알려진 4- nitroquinoline-N-oxide를 사용하였고, 효소반응 생성물을 용해하는데 사용한 dimethyl sulfoxide(DMSO)와 효소만의 단독작용을 알아보기 위해 효소를 불활성화 시킨 후 실험한 결과, 이들은 Bacillus subtitis H₁₇ 및 M45 균주에 대해서 아무런 영향도 미치지 않았다(Table III).

데이터처리

모든 시험결과는 평균土표준편차로 표기하였고 통계적 유의성은 Students t-test로 하였으며 p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

이론/모형

단백질의 함량은 bovine serum albumin을 표준품으로 하여 trichloroacetic acid와 Folin-Ciocalteu 시약을 사용하는 TCA- Lowry 법少으로 측정하였다.

성능/효과

이는 저해제의 첨가에 의하여 기질인 폴리페놀 화합물이 PPO과 반응하여 생성된 o-quinone류중 일부가 환원력을 가진 ascorbic acid에 의하여 다시 DNA 손상을 주는 폴리페놀 물질로 환원되거나 cysteine이나 glutathione 등의 thiol 화합물과 o-quinone°] 2차 반웅물을 생성하기 때문이라고 사료된다. 갈변물질 자체가 DNA 손상 감소 능력이 있는 지를 검토하기 위해 폴리페놀 화합물에 이 화합물의 효소 반응 생성물인 갈변생성물의 농도를 다양하게 변화시켜 첨가하였을 때에도 DNA 손상 정도에는 아무런 변화가 없는 것으로 나타났다.
이상의 실험결과로부터 폴리페놀 화합물 단독일 때보다 이들 페놀성 화합물과 PPO와의 반응 생성물인 경우가 DNA에 대한 손상능력이 낮아지는 것은 효소적 갈변 반응에 의해 폴리페놀 물질의 함량이 감소하기 때문이라고 볼 수 있으며, 또한 폴리페놀 화합물에 이 화합물의 반응 생성물인 갈변생성물의 농도를 달리하여 첨가하였을 때에도 DNA 손상 정도에는 아무런 변화가 없었으므로 폴리페놀 화합물로 인한 DNA 손상을 감소시키는 데는 PPO가 중요한 역할을 한다고 볼 수 있다.
일반적으로 PPO의 기질로 사용되는 5종의 폴리페놀 화합물만을 가한 경우C*ble II)와 폴리페놀1 화합물에 PPO> 각각 반응 시켜 얻은 갈변생성물, 즉 효소반응 생성물(enzymatic reaction product)이 고초균의 DNA에 미치는 손상정도를 검토해 본 결과 (Table III), 기질로 사용된 5종의 폴리페놀 화합물만을 가한 경우에는 Bacillus subtitis H₁₇ 및 M45 균주에 대해서 pyrogallol> 4-methylcatechol > pyrocatechol, t-butylcatechol> gallic acid 순으로 양성을 나타내어 고초균의 DNA에 손상을 주었으나 (Table II), 이들 폴리 페놀 화합물의 효소적 갈변물질들은 t- butylcatechol 에서 약한 양성이 나타나는 것을 제외하고는 전부 음성을 나타내어 ("ble III), PPO를 폴리페놀 화합물에 가하여 갈변물질이 형성되면 DNA 손상을 일으키지 않는다는 것을 알 수 있었다. 양성 대조물질로는 발암물질로 알려진 4- nitroquinoline-N-oxide를 사용하였고, 효소반응 생성물을 용해하는데 사용한 dimethyl sulfoxide(DMSO)와 효소만의 단독작용을 알아보기 위해 효소를 불활성화 시킨 후 실험한 결과, 이들은 Bacillus subtitis H₁₇ 및 M45 균주에 대해서 아무런 영향도 미치지 않았다(Table III).
검토하였다. 폴리페놀 화합물인 pyrogallol, 4-methylcatechol, pyrocatechol, ^-butylcatechol 및 gallic acid 단독으로는 대부분 고초균의 DNA 에 손상을 일으키며, 대체적으로 폴리페놀 농도가 증가함에 따라 생육저지력도 촉진되는 경향을 보였다. 그러나 폴리페놀 화합물들이 PPO의 작용을 받아서 갈변물질로 변한 경우에는 DNA 손상을 거의 일으키지 않았다.
폴리페놀1 화합물과 PPO의 혼합물에 PP。활성 저해물질로 잘 알려져 있는 cysteine, 잉utathione 및 ascorbin acid 등의 항산화제를 각각 세 가지 농도로 첨가하여 DNA 손상을 검토한 결과 저해제에 의해 농도 의존적으로 DNA의 손상이 증가되는 것으로 나타났다(Table IV). 이는 저해제의 첨가에 의하여 기질인 폴리페놀 화합물이 PPO과 반응하여 생성된 o-quinone류중 일부가 환원력을 가진 ascorbic acid에 의하여 다시 DNA 손상을 주는 폴리페놀 물질로 환원되거나 cysteine이나 glutathione 등의 thiol 화합물과 o-quinone°] 2차 반웅물을 생성하기 때문이라고 사료된다.

참고문헌 (16)

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