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문제 정의
- NO는 L-arginine, NADPH, 분자산소 등 여러가지 요인들에 의해 NOS로부터 합성되어지는데[12], 현재 외인성 L-arginine 투여의 체내 NO 생성효과에 대한 의견이 분분하고, 고혈압으로 인한 심혈관계 손상 상태에서 운동 중 반응하는 eNOS에 대한 반응과 지질과산화 및 대식세포의 활성정도를 함께 비교분석한 연구는 없었다. 따라서 본 연구는 같은 계열의 WKY 8마리와 SHR 24마리를 대상으로 규칙적인 훈련과 L-arginine 투여가 심혈관계 및 면역계에 미치는 영향을 분석하고자 한다.
- 본 연구는 Wistar-Koyto Rat과 Spontaneously Hypertensive Rat을 대상으로 10주간의 L-arginine 투여와 규칙적인 수영 훈련을 하였을 때, 심박수, 혈압 간조직의 eNOS 활성 및 대식세포의 활성수준을 비교분석하여 고혈압 질환상태에서 심혈관계 및 eNOS 수준에 대한 L-arginine 투여와 훈련의 효과를 규명하는데 목적이 있었다. 결과적으로 고혈압 통제군의 심박수, 혈압, eNOS, 및 대식세포의 활성은 정상군에 비해 현저하게 높은 수치를 보였는데, 이는 고혈압으로 인한 혈관내피세포 손상으로 산화질소 생성기전에 불안정을 초래하여 심혈관계에 부정적인 영향을 주었을 것으로 해석한다.
제안 방법
- 후에 실시하였고, 사료는 부검 12시간 전에 공급을 중단하였지만, 음수는 계속 제공하였다. 실험동물들은 동물 수술실 도착 후, 충분한 안정을 취한 뒤 마취제 에틸에테르를 이용하여 마취시킨 후, 복부를 절개하여 대동맥에서 채혈하였다. 채혈 후 간 조직 0.
- 실험동물의 사육실 내부는 온도 22+2℃, 습도 50+5%, 소음(40~50 Phon이하) 및 조명(12시간 명/암)이 자동적으로 유지되도록 하였으며, 무균음료 및 멸균사료를 자유롭게 섭취시켰다. 훈련군으로 분류된 모든 실험동물은 1주간의 수영 적응훈련기간을 가진 후 적응여부를 가려, 9주간 주당 5일씩 6Q분간 수영훈련을 실시하였다.
- 심박수 및 혈압의 측정은 Muromachi kikai社(日)의 BP Monitor MK-1100을 사용하였다. 체중에 맞는 크기의 코팅 플라스틱 홀더(animal holder)를 선택하여, 몸체를 씌우고 움직임이 없도록 고정시켰으며, 고정된 실험동물은 35笆로 유지되는 플라스틱 체임버에서 최대한 안정을 취할 수 있게 한 후, 측정기에 흘더를 고정시킨 다음, 꼬리에 커프를 연결시켜 측정을 하였다. 측정은 총 6회로 하였으며, 최고치와 최저치를 소거한 후, 4개 결과의 평균치를 자동 계산하였다.
- 체중에 맞는 크기의 코팅 플라스틱 홀더(animal holder)를 선택하여, 몸체를 씌우고 움직임이 없도록 고정시켰으며, 고정된 실험동물은 35笆로 유지되는 플라스틱 체임버에서 최대한 안정을 취할 수 있게 한 후, 측정기에 흘더를 고정시킨 다음, 꼬리에 커프를 연결시켜 측정을 하였다. 측정은 총 6회로 하였으며, 최고치와 최저치를 소거한 후, 4개 결과의 평균치를 자동 계산하였다.
- 실험동물의 사육실 내부는 온도 22+2℃, 습도 50+5%, 소음(40~50 Phon이하) 및 조명(12시간 명/암)이 자동적으로 유지되도록 하였으며, 무균음료 및 멸균사료를 자유롭게 섭취시켰다. 훈련군으로 분류된 모든 실험동물은 1주간의 수영 적응훈련기간을 가진 후 적응여부를 가려, 9주간 주당 5일씩 6Q분간 수영훈련을 실시하였다. 사용된 풀은 70x70x60 cm 규격을 사용하였으며 수온은 실험동물이 수영을 하기에 적당한 25~27℃를 유지하였다.
대상 데이터
- 본 연구의 실험대상은 Spontaneously Hypertensive Rat (SHR) 24마리와 대조군으로서 Wistar-Koyto Rat (WKY) 8마리를 대상으로 크게, 정상군(WKYC, n=8), 고혈압 통제군(SHRC, n=8), 고혈압 투여군(SHRA, n=8) 및 고혈압 훈련 투여군(SHRTA, n=8)으로 분류하였으며, 실험동물의 분류와 특성은 에 나타나 있다.
데이터처리
- 본 실험의 결과는 SPSS 통계 package를 이용하여 기술통계량을 산출하였고, 그룹간의 심박수, 혈압, eNOS 및 대식세포의 변화형태 비교를 위해 일원 분산분석법(Onaway ANOVA) 을 이용하여 분석하였으며 사후 비교는 DUNCAN의 사후검증법으로 검증하였다(p〈.05).
이론/모형
- 배양 후 50 μ1의 stop solu- tion을 넣은 다음, 흡광도 450 nml에서 분석하였다. 대식세포 분석은 Pharmingen社(美)의 R-PE anti-rat Macrophage Subset monoclonal antibody를 사용하였다. 이 항체는 affinity chromatography0]] 의해 조직의 상층(supernatant)으로부터 분리하여 정제한 것으로 최적의 상태조건에서 R-PE와 결합되어 4笆에 보관하여 사용하였다.
- 원심 분리 후 pellet을 RPMI1640으로 2번 washing 한 다음 림프구 100 111와 m Ab 10 ill를 혼합하여 37℃, 5% CO2 항온 항습기에서 20분간 배양 하였다. 반응시킨 샘플에서 대식세포의 활성화를 보기 위해 Becton dickinson社(美)의 유세포 분석기(FACscare)를 이용하여 측정하였고, 측정한 값의 정확한 분석을 위하여 Window Multiple Document Interface for Flow Cytometery (win MDI) software ver. 28을 이용하였으며, mean fluorescence index 값을 이용하였다.
- 심박수 및 혈압의 측정은 Muromachi kikai社(日)의 BP Monitor MK-1100을 사용하였다. 체중에 맞는 크기의 코팅 플라스틱 홀더(animal holder)를 선택하여, 몸체를 씌우고 움직임이 없도록 고정시켰으며, 고정된 실험동물은 35笆로 유지되는 플라스틱 체임버에서 최대한 안정을 취할 수 있게 한 후, 측정기에 흘더를 고정시킨 다음, 꼬리에 커프를 연결시켜 측정을 하였다.
- 우선 eNOS는 R&D社(美)의 eNOS Quantikine Immunoassay kit를 사용하여, Hewlette Packard社(美)의 Elisa를 이용한 UV법으로 분석하였다. 간세포를 slide glass를 이용하여 균 질화시킨 다음, 300xg의 속도로 5분간 원심분리 후, lysis buffer (세포 lxl06/ml 당 1 ml의 buffer 용액)에 넣고, 2~8℃ 에서 1시간 동안 방치하였다.
- 체중은 일정한 시간에 CAS社(韓)의 Computing scale 체중계를 이용하여 측정하였으며, 식이섭취에 의한 체중 변화를 막기 위해 체중측정 1시간 전에 사료와 음료의 섭취를 제한하였다.
- 사용된 풀은 70x70x60 cm 규격을 사용하였으며 수온은 실험동물이 수영을 하기에 적당한 25~27℃를 유지하였다. 투여군으로 분류된 그룹은 Sigma chemical社(美)의 L-arginine을 무균 음료에 2% 농도로 용해하여 ad-libitum 방법으로 투여하였다.
성능/효과
- 본 연구는 Wistar-Koyto Rat과 Spontaneously Hypertensive Rat을 대상으로 10주간의 L-arginine 투여와 규칙적인 수영 훈련을 하였을 때, 심박수, 혈압 간조직의 eNOS 활성 및 대식세포의 활성수준을 비교분석하여 고혈압 질환상태에서 심혈관계 및 eNOS 수준에 대한 L-arginine 투여와 훈련의 효과를 규명하는데 목적이 있었다. 결과적으로 고혈압 통제군의 심박수, 혈압, eNOS, 및 대식세포의 활성은 정상군에 비해 현저하게 높은 수치를 보였는데, 이는 고혈압으로 인한 혈관내피세포 손상으로 산화질소 생성기전에 불안정을 초래하여 심혈관계에 부정적인 영향을 주었을 것으로 해석한다. 하지만 L-arginine 투여와 규칙적인 수영훈련은 심박수, 혈압 및 eNOS 수준을 안정 수준으로 회복하였고, 대식세포의 활성 역시 안정화함으로 심혈관계에 긍정적인 영향력을 미치는 것으로 나타났다.
- 05), 본 연구결과 고혈압군에서 대식세포의 활성이 가장 높았는데, 이는 선행연구와 일치하는 것으로[4] 임상적인 질환이 있는 경우, 항산화 방어기전이 손상됨으로 프리라디칼에 의해서 산화적으로 변형된 LDL과 같은 산화물이 부수적으로 생성되고, 산화된 LDL에 대한 대식세포의 식균작용이 왕성하게 일어나는 것을 의미한다. 규칙적인 훈련을 함으로 지질성분의 프로파일이 개선되어 HDL이 증가함으로 지질과산 화가 억제되고, 대식세포의 활성이 안정화됨을 확인할 수 있다.
- 특히 고혈압 투여 훈련군의 eNOS는 거의 통제군의 수치 가까이 회복을 보여 고혈압 실험동물에게 L-arginine 투여와 규칙적인 훈련이 큰 효과를 보이는 것으로 나타났다. 본 실험결과 고혈압 통제군의 eNOS 활성은 통제군과 비교하여 유의하게 높은 수치를 보였고, L-arginine 투여로 상당한 수치의 감소를 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 고혈압의 경우 내피세포의 기능장애로 NO 생성기전이 훼손되었지만μ2, 13], L-arginine 투여와 훈련에 따라, NO와 연관된 구조적 변화를 통하여 혈관순응이 향상되었으며, 동시에 NO와 endothelin 수준이 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
- 05). 본 실험결과, 고혈압 통제군의 심박수와 혈압은 통제군과 비교하여 유의하게 높게 나타났다. 이는 혈관내피세포의 정상기능이 훼손됨으로 투과성 막으로의 기능이 상실되고, 혈관내막(intima)내 변형된 지단백의 생성으로 혈관직경이 좁아져, 고혈압 증세가 나타난 것을 의미한다.
- 3>에 나타나 있다.<표 3>에 나타나 있듯이 대식세포는 고혈압 통제군에 비해 고혈압 투여군에서 통계적으로 유의한 감소를 나타내었고, 특히 고혈압 훈련 투여군에서 현저한 감소를 보여 거의 통제군에 가까운 수치로 회복됨을 알 수 있었다(P <.05), 본 연구결과 고혈압군에서 대식세포의 활성이 가장 높았는데, 이는 선행연구와 일치하는 것으로[4] 임상적인 질환이 있는 경우, 항산화 방어기전이 손상됨으로 프리라디칼에 의해서 산화적으로 변형된 LDL과 같은 산화물이 부수적으로 생성되고, 산화된 LDL에 대한 대식세포의 식균작용이 왕성하게 일어나는 것을 의미한다. 규칙적인 훈련을 함으로 지질성분의 프로파일이 개선되어 HDL이 증가함으로 지질과산 화가 억제되고, 대식세포의 활성이 안정화됨을 확인할 수 있다.
- 역시 고혈압 투여군에 비해 고혈압 훈련 투여군이 혈압의 감소에 가장 큰 효과를 보였지만 통제군의 값으로 완전히 회복하지 않았다. 이완기 혈압은 고혈압 통제군에 비하여 고혈압 투여군에서 변화를 보이지 않았고, 고혈압 훈련 투여군에서는 통계적으로 유의하게 감소하였다(p<.05). 본 실험결과, 고혈압 통제군의 심박수와 혈압은 통제군과 비교하여 유의하게 높게 나타났다.
- 05). 특히 고혈압 투여 훈련군의 eNOS는 거의 통제군의 수치 가까이 회복을 보여 고혈압 실험동물에게 L-arginine 투여와 규칙적인 훈련이 큰 효과를 보이는 것으로 나타났다. 본 실험결과 고혈압 통제군의 eNOS 활성은 통제군과 비교하여 유의하게 높은 수치를 보였고, L-arginine 투여로 상당한 수치의 감소를 확인할 수 있었다.
- 결과적으로 고혈압 통제군의 심박수, 혈압, eNOS, 및 대식세포의 활성은 정상군에 비해 현저하게 높은 수치를 보였는데, 이는 고혈압으로 인한 혈관내피세포 손상으로 산화질소 생성기전에 불안정을 초래하여 심혈관계에 부정적인 영향을 주었을 것으로 해석한다. 하지만 L-arginine 투여와 규칙적인 수영훈련은 심박수, 혈압 및 eNOS 수준을 안정 수준으로 회복하였고, 대식세포의 활성 역시 안정화함으로 심혈관계에 긍정적인 영향력을 미치는 것으로 나타났다.
- 이는 혈관내피세포의 정상기능이 훼손됨으로 투과성 막으로의 기능이 상실되고, 혈관내막(intima)내 변형된 지단백의 생성으로 혈관직경이 좁아져, 고혈압 증세가 나타난 것을 의미한다. 하지만 L-arginine 투여와 규칙적인 훈련은 심박수와 혈압을 유의하게 낮추며, 비록 이 수치가 통 제군의 수치는 아니더라도 심혈관계 스트레스 감소에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 생각되며 NO 생성기전의 활성화와 맥락을 같이 하는 것으로 여겨진다, 이러한 결과는 109명의 여성을 대상으로 규칙적인 운동이 혈압강하 효과가 있었다는 최근의 연구결과를[13] 반영하는 것으로 보이며, 운동의 혈압강하 효과는 일반인뿐만 아니라 고혈압군에서도 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
- <표 2>에 나타나 있듯이, 심박수의 변화는 고혈압 통제군에 비하여 고혈압 투여군과 고혈압 훈련 투여군이 현저하게 감소하여 통계적으로도 유의한 차이를 나타내었다가 <■05), 특히 고혈압 훈련 투여군에서 가장 큰 감소를 보여 큰 효과를 나타내었지만 통제군의 값으로 회복되지는 않았다. 한편 실험조건에 따른 수축기 혈압은 고혈압 통제군에 비하여 고혈압 투여군과 고혈압 훈련 투여군이 현저하게 감소하여 통계적으로도 유의한 차이를 나타내었다(p<.05). 역시 고혈압 투여군에 비해 고혈압 훈련 투여군이 혈압의 감소에 가장 큰 효과를 보였지만 통제군의 값으로 완전히 회복하지 않았다.
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