동해안 특산 해조류의 식품 또는 의약품재료로의 이용가능성을 검토하기 위하여 소화효소(pepsin)로 가수분해한 다음 저분자peptide를 정제하여 여러 가지 기능성을 연구하였다. 쇠 미역, 파래 및 지누아리의 효소가수분해물은 Bio-Rad P2 gel chromatography 상에서 3개의 peptide peak를 나타내었으나 김은 2개의 peak를 나타내었다. 항산화활성은 김 peak 1이 가장 높았으며 그 다음으로 김 peak 2 및 쇠미역 peak 2 순으로 높았다. ACE 저해활성은 김 peak 1, 파래 peak 3 및 peak 2순으로 높았으며, 항갈변활성은 김 peak 1 및 2, 파래 peak 2가 가장 높았으며 그 다음으로 파래 peak 3이 높았다. 항암(종양)활성은 파래 Peak 1이 가장 높았으며 그 다음으로 쇠미역 peak 2, 파래 peak 3, 지누아리 peak 3 순으로 높았다. 전반적으로는 김의 기능성이 가장 뛰어났으며, 이는 가장 높은 단백질함량을 가지고 있는 것도 한 이유라고 판단되며, 앞으로 저분자 peptide의 구조분석 및 아미노산 sequence의 규명도 필요하다고 본다.
동해안 특산 해조류의 식품 또는 의약품재료로의 이용가능성을 검토하기 위하여 소화효소(pepsin)로 가수분해한 다음 저분자peptide를 정제하여 여러 가지 기능성을 연구하였다. 쇠 미역, 파래 및 지누아리의 효소가수분해물은 Bio-Rad P2 gel chromatography 상에서 3개의 peptide peak를 나타내었으나 김은 2개의 peak를 나타내었다. 항산화활성은 김 peak 1이 가장 높았으며 그 다음으로 김 peak 2 및 쇠미역 peak 2 순으로 높았다. ACE 저해활성은 김 peak 1, 파래 peak 3 및 peak 2순으로 높았으며, 항갈변활성은 김 peak 1 및 2, 파래 peak 2가 가장 높았으며 그 다음으로 파래 peak 3이 높았다. 항암(종양)활성은 파래 Peak 1이 가장 높았으며 그 다음으로 쇠미역 peak 2, 파래 peak 3, 지누아리 peak 3 순으로 높았다. 전반적으로는 김의 기능성이 가장 뛰어났으며, 이는 가장 높은 단백질함량을 가지고 있는 것도 한 이유라고 판단되며, 앞으로 저분자 peptide의 구조분석 및 아미노산 sequence의 규명도 필요하다고 본다.
Functional activities of low molecular weight substances purified from pepsin hydrolysates of four different seaweeds; Costaria costata, Enteromorpha prolifera, Grateloupia filicina and Porphyra tenera, were inves-tigated. Each pepsin hydrolysate of Costaria costata, Enteromorpha prolifera, and Grat...
Functional activities of low molecular weight substances purified from pepsin hydrolysates of four different seaweeds; Costaria costata, Enteromorpha prolifera, Grateloupia filicina and Porphyra tenera, were inves-tigated. Each pepsin hydrolysate of Costaria costata, Enteromorpha prolifera, and Grateloupia filicina resulted in three peptide peaks on Bio-Rad P2 gel chromatography pattern, while that of Porphyra tenera showed 2 peaks. Peak 1 of Porphyra tenera showed the highest antioxidative activity followed by peak 2 of Porphyra tenera and peak 2 of Costaria costata in order Peak 1 of Porphyra tenera showed the highest ACE inhibitory activity followed by peak 3 and peak 2 of Enteromorpha prolifera in order. Peak 1 and peak 2 of Porphyra tenera, and peak 2 of Enteromorpha prolifera showed the highest antityrosinase activity followed by peak 3 of Enteromorpha prolifera. Peak 1 of Enteromorpha prolifera showed the highest antitumor activity followed by peak 2 of Costaria costata, peak 3 of Enteromorpha prolifera, and peak 3 of Grateloupia filicina in order. Porphyra tenera showed the highest functional activities, which is thought to be due to its high protein content. Structure and amino acid sequence of low molecular weight peptide of Porphyra tenera should be analyzed in the further study.
Functional activities of low molecular weight substances purified from pepsin hydrolysates of four different seaweeds; Costaria costata, Enteromorpha prolifera, Grateloupia filicina and Porphyra tenera, were inves-tigated. Each pepsin hydrolysate of Costaria costata, Enteromorpha prolifera, and Grateloupia filicina resulted in three peptide peaks on Bio-Rad P2 gel chromatography pattern, while that of Porphyra tenera showed 2 peaks. Peak 1 of Porphyra tenera showed the highest antioxidative activity followed by peak 2 of Porphyra tenera and peak 2 of Costaria costata in order Peak 1 of Porphyra tenera showed the highest ACE inhibitory activity followed by peak 3 and peak 2 of Enteromorpha prolifera in order. Peak 1 and peak 2 of Porphyra tenera, and peak 2 of Enteromorpha prolifera showed the highest antityrosinase activity followed by peak 3 of Enteromorpha prolifera. Peak 1 of Enteromorpha prolifera showed the highest antitumor activity followed by peak 2 of Costaria costata, peak 3 of Enteromorpha prolifera, and peak 3 of Grateloupia filicina in order. Porphyra tenera showed the highest functional activities, which is thought to be due to its high protein content. Structure and amino acid sequence of low molecular weight peptide of Porphyra tenera should be analyzed in the further study.
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문제 정의
해조류의 생리 활성 에 관한 연구로는 갈조류의 항응고, 항암 및 항AIDS 활성(10, 11), 해조류의 항암 및 항궤양 활성 (12-14), 홍조류의 항응고 활성 (15T8) 등이 보고되었다. 따라서 본 연구에서는 해조류의 식품 첨가제 또는 식품소재로의 개발을 위해 해조류 효소가수분해물을 제조하여 이 들의 기능성 (항산화, 항고혈압, 항갈변(갈변방지 ) 및 항암 활성)을 분석하였다.
가설 설정
1)Means with the same latter in the same column are not significantly different (p<0.05).
제안 방법
4종의 해조류 효소가수분해물을 Bio-Rad P2 gel chro-matography로 정제하였다. 쇠미역, 파래, 지누아리로부터 각각 3개의 peptide peak를 얻었으며, 김으로부터는 2개의 peak를 얻었다(Fig.
Melanin 형성 효소인 tyrosinase 활성을 저 해하여 멜라닌 색소의 생산을 억제하고, 피부에서 활성 산소 생성을 억제하는 효과를 검증하기 위해 해조류 가수분해물의 tyrosinase 억제 활성을 측정하였다. 해조류 효소가수분해물의 tyrosinase 억제활성은 김의 peak 1, 2 및 파래 peak 2에서 10%로 가장 높은 저해활성을 보였으며, 이때의 비활성 역시 김의 peak 1, 2에서 가장 높았다(Table 3).
03% DOPA(3, 4-dihydroxypheny 1 alanine) 1 mL를 가하여 25℃에서 5분간 반응시킨 후 475 nm에서 흡광도를 측정하였다(Di). 가열하여 실활시 킨 효소 처리구(W와 시료 무첨가구(D3)로 동일한 실험을 행하여 저해율을 산출하였다.
고혈압의 원인이 되는 Angiotensin~I 전환효소(ACE)에 대한 해조류 효소가수분해물의 저 해활성을 측정하였다. 김 peak 1이 21%로 가장 높은 ACE 저해활성을 나타내었고, 그 다음으로 파래 peak 3(18%) 및 쇠 미 역 peak 2(15%) 순이었다.
15 mM DPPH 1 mL와 혼합하여 실온에서 30분간 방치 한 다음 520 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 대조구로는 메탄올을 사용하여 DPPH radical 소거 활성을 구하였다.
동해 안 특산 해조류의 식 품 또는 의 약품재료로의 이용 가능성을 검토하기 위하여 소화효소(pepsin)로 가수분해한 다음 저 분자 peptide를 정 제 하여 여러 가지 기능성 을 연구하였다. 쇠미역, 파래 및 지누아리의 효소가수분해물은 Bio-Rad P2 gel chromatography 상에서 3개의 peptide peak를 나타내었으나 김은 2개의 peak를 나타내었다.
여 기에 5 mg/mL MTT 용액 20 此를 첨가하고 다시 상기와 같은 조건에서 4시간 더 배양하였으며 이때 대조구로는 증류수를 사용하였다. 배양액을 원심분리(8, 。00 g, 10 min)하여 상징액을 제거하고 각 well당 dimethylsulfoxide(DMSO) 150 UL를 가하여 30분간 교반한 후 ELISA reader(Bio-Tek. Instruments Co., Highland Park, USA)로 550 nm에서 흡광도를 측정하여 다음 식을 이용하여 성장억 제효과 항암 활성을 구하여 세포 독성 활성의 지표로 하였다.
여기에 에틸아세테이트 2 mL를 가하여 15초간 교반한 다음 원심분리(1, 350 xg, 5 min)하여, 상징 액 1 mL를 취하였다. 이 상징 액을 완전히 건조시 킨 뒤 1 M NaCl 3 mL를 가하여 용해한 다음 추출된 hippuric acid 농도를 228 nm에서 흡광도를 측정하여 다음 계산식을 이용하여 ACE 저해활성을 계산하였다.
측정하였다. 즉, 시료를 두 개의 시험관에 각각 0.5 mL 씩 취 하고 증류수 4.5 mL씩 가한 다음, 한 시험 관에 는 Biuret 시 약 1(0.4% CuSO4, 8% NaOH, 0.2% glycerin)을 5 mL 첨가하여 A 반응구로, 다른 시험관에는 Biuret 시약 11(8% NaOH, 0.2% glycerin)을 5 mL 첨가하여 B 반응구로 하였다. Blank는 시료용액 대신 증류수 5 mL를 사용하였으며, 실온에서 2시간 반응시킨 후 545 nm에서 흡광도를 측정하여 peptide-nitrogen 함량을 구하였다.
항갈변 활성 은 Horowitz 등(24)의 방법을 개 량하여, tyro-sine을 산화시켜 멜라닌으로 변화시키는 phenol oxidase의 활성을 저 해하는 능력을 측정하여 항갈변성활성으로 하였다. 즉, 시료용액 1 mL에 0.
해조류에서 추출한 효소가수분해물은 Kunio와 Takahisa (20)의 방법을 다소 수정하여 정제하였다. 즉, 해조류 분말시료 10 g에 증류수 300 mL를 첨가하고 균질화 한 후 1 N HC1 로 pH를 2로 조절하고 pepsin(Sigma, St.
대상 데이터
In vitro 항암실험을 위해 사용된 암세포주는 인체에서 유래한 위암세포인 SNU-1(서울대학교, 서울)을 한국세포주은행(서울, 한국에서 구입하였다. 암세포 SNU-1은 100 unit/mL의 penicillinestreptomycin 및 10% fetal bovine serum(FBS)이 함유된 RPMI 1640배지를 사용하여 37℃, 5% CO incubator에서 배 양하였다.
배 양된 각각의 암세포는 일주일에 2~3회 배지를 교환해주며 75 mL cell culture flask에 5 mL씩 분할하여 주입하고 6~7일.마다 계대배양하면서 실험에 사용하였다. 동물세포에 대한 시료의 암세포 성장 저해 효과는 Carmichael 등(25)의 방법에 따라 3-(4, 5-dimeth~ yllthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltertrazoliumbromide(MTT) 방법으로 측정하였다.
본 실험에 사용한 해조류(쇠미역, 파래, 김, 지누아리)는 2003년 5월 강릉시 안인에서 채 취하여 수세 후 음건하고 분말화한 다음 실험에 사용하였다. 효소가수분해물 정제는 Bio-Rad P2 gel(Bio-Rad Co.
정제하였다. 쇠미역, 파래, 지누아리로부터 각각 3개의 peptide peak를 얻었으며, 김으로부터는 2개의 peak를 얻었다(Fig. 1 및 2). 이러한 결과는 효소 첨가에 의해 고분자 peptide가 분해되어 저분자의 peptide를 생성한 것으로 보이며, 실험에 사용한 Bio-Rad P-2 gele 100 — 1, 800 Da 사이의 분자량을 정제할 수 있기 때문에 Fig.
다음 실험에 사용하였다. 효소가수분해물 정제는 Bio-Rad P2 gel(Bio-Rad Co., California, USA)를 사용하였으며, 실험에 사용한 나머지 시약은 모두 특급을 사용하였다.
데이터처리
검사결과에 대한 통계적인 유의성 검정은 SPSS(Statis-tical Packages for Social Science)를 이용하여 Duncan's multiple comparison test로 95% 신뢰도에서 유의 차를 검 증하였다.
이론/모형
ACE 활성 은 Cushman과 Cheung의 방법 (23)으로 측정 하였다. 즉, lung acetone powder(Sigma, St Louis, MO, USA) 1 g 에 400 mM sodium borate buffer(pH 8.
Peptide-nitrogen 함량은 Umemoto(21)의 Biuret법 에 의하여 측정하였다. 즉, 시료를 두 개의 시험관에 각각 0.
각 시료의 l, l-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) radi- cal에 대한 소거 효과는 Blois 방법 (22)으로 측정하여 항산화능의 지표로 삼았다. 즉, 메탄올로 농도를 조정한 시료 4 mL를 취 하고, 0.
마다 계대배양하면서 실험에 사용하였다. 동물세포에 대한 시료의 암세포 성장 저해 효과는 Carmichael 등(25)의 방법에 따라 3-(4, 5-dimeth~ yllthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltertrazoliumbromide(MTT) 방법으로 측정하였다. 즉, 동물세포를 96 well plate에 1x10, cells/weli이 되 게 분주하고 일정농도의 시료 20 虬를 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 96시간 배양하였다.
해조류의 일반성분은 AOACU9)법에 의해 분석하였다. 즉, 수분함량은 상압건조법 , 조지 방은 Soxhlet 추출법 , 조단백질은 micro Kjeldahl법, 조회분은 550℃에서 건식회화법으로 분석하였匸"
성능/효과
항산화활성은 김 peak 1이 가장 높았으며 그 다음으로 김 peak 2 및 쇠미역 peak 2 순으로 높았다. ACE 저 해 활성 은 김 peak 1, 파래 peak 3 및 peak 2 순으로 높았으며, 항갈변활성은 김 peak 1 및 2, 파래 peak 2가 가장 높았으며 그 다음으로 파래 peak 3이 높았다. 항암(종양)활성은 파래 peak 1이 가장 높았으며 그다음으로 쇠 미 역 peak 2, 파래 peak 3, 지 누아리 peak 3 순으로 높았다.
파래 peak 1이 40%로 가장 높은 항암 활성을 나타내었고, 그 다음으로 쇠미역 peak 2(39%), 파래 peak 3(39%) 및 지누아리 peak 3(39%)이 높은 항암활성을 나타내었다. 단위 질량별 비활성 (specific activity)으로 환산한 결과는 지누아리 peak 3이 가장 높은 비활성을 가지는 것으로 나타났으며, 시 료에 따른 유의 적 인 차이는 나타나지 않았다(Table 3). Kim 등(33)은 위 암세포 SNU-638에 대한 해조류 에탄올 추출물의 암세포 억제 연구에서 미역, 파래 및 김의 항암활성 은 각각 73, 75 및 68%로 본 실험의 항암 활성에 비해 아주 높은 항암활성을 보였으나 비활성으로 환산한 결과는 각각 105, 307, 106% .
김 peak 1이 21%로 가장 높은 ACE 저해활성을 나타내었고, 그 다음으로 파래 peak 3(18%) 및 쇠 미 역 peak 2(15%) 순이었다. 단위 질량별 비활성(specific activity)으로 환산한 결과 역시 김 peak 1이 역시 높은 활성을 나타내어 ACE 저해활성도 김 peak 1이 가장 우수한 것으로 나타났다(Table 2). Yeum 등(28)은 ACE 저해 작용에는 단백질의 함량보다는 그 중의 peptide의 종류에 따른 영향이 크다고 보고하였다.
나타내었다. 파래 peak 1이 40%로 가장 높은 항암 활성을 나타내었고, 그 다음으로 쇠미역 peak 2(39%), 파래 peak 3(39%) 및 지누아리 peak 3(39%)이 높은 항암활성을 나타내었다. 단위 질량별 비활성 (specific activity)으로 환산한 결과는 지누아리 peak 3이 가장 높은 비활성을 가지는 것으로 나타났으며, 시 료에 따른 유의 적 인 차이는 나타나지 않았다(Table 3).
ACE 저 해 활성 은 김 peak 1, 파래 peak 3 및 peak 2 순으로 높았으며, 항갈변활성은 김 peak 1 및 2, 파래 peak 2가 가장 높았으며 그 다음으로 파래 peak 3이 높았다. 항암(종양)활성은 파래 peak 1이 가장 높았으며 그다음으로 쇠 미 역 peak 2, 파래 peak 3, 지 누아리 peak 3 순으로 높았다. 전반적으로는 김의 기능성이 가장 뛰어났으며, 이는 가장 높은 단백질함량을 가지고 있는 것도 한 이유라고 판단되며, 앞으로 저분자 peptide의 구조분석 및 아미노산 sequence의 규명도 필요하다고 본다.
활성을 측정하였다. 해조류 효소가수분해물의 tyrosinase 억제활성은 김의 peak 1, 2 및 파래 peak 2에서 10%로 가장 높은 저해활성을 보였으며, 이때의 비활성 역시 김의 peak 1, 2에서 가장 높았다(Table 3). 피부는 자외선에 노출되면서 tyrosinase의 작용으로 melanosome에서 멜라닌이 합성되어 피부노화가 촉진되 며(30, 31), 이때 생성된 자유 라디 칼은 지질, 단백질, 당 및 핵산을 손상시키고 세포막의 파괴에 관여함으로써 돌연변이 유발 피부암을 포함한 발암, 성인병 및 노화 등을 촉진시키는 원인요소로 알려져 있다(32).
후속연구
해조류, 특히 갈조류의 항암활성은 갈조류에 함유되어 있는 fucoidan, 요오드 및 fucoxanthin 등에 의해 세포의 증식이 억제되기 때문인 것으로 알려져 있다(34). 그러나 본 실험 에서는 홍조류인 지누아리와 김, 녹조류인 파래, 갈조류인 쇠미역의 활성이 유의적인 차가 나타나지 않았으므로, 갈조류 뿐 아니라 녹조류 및 홍조류도 암을 예방 및 치료할 수 있는 가능성이 있는 것으로 생각된다.
피부는 자외선에 노출되면서 tyrosinase의 작용으로 melanosome에서 멜라닌이 합성되어 피부노화가 촉진되 며(30, 31), 이때 생성된 자유 라디 칼은 지질, 단백질, 당 및 핵산을 손상시키고 세포막의 파괴에 관여함으로써 돌연변이 유발 피부암을 포함한 발암, 성인병 및 노화 등을 촉진시키는 원인요소로 알려져 있다(32). 본 실험에서는 비교적 낮은 tyrosinase 억제활성이 측정되었으나 해조류 효소가수분해물이 완전 정제된 물질이 아니므로 완전 정 제과정을 통해 얻어진 산물은 피부의 노화 및 흑화를 방지할 수 있는 원료로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
Krogull 과 Fennema(27)는 질소 화합물인 단백질, peptide 및 아미노산은 자체적으로 산화가 일어나며, pH, 온도, 수분활성 및 산화 촉매제나 저해제의 존재 여부에 따라 항산화활성의 차이가 있다고 보고하고 있다. 본 연구의 해조류 효소 가수분해물에서 추출한 저분자 peptide에서 가장 높은 활성을 나타낸 김 (peak 1)의 KMoe 2.4 μg/mL로 천연 항산화제나 합성 항산화제 인 BHA에 비 중]] 서 는 낮은 활성을 나타내 었지 만, 시 료자체가 100% 완전 정제물이 아니기 때문에 완전 정제된 물질은 이보다 훨씬 높은 IC50 값을 가질 것으로 추정되며, 정제과정 을 통한 분자량 측정 및 아미 노산 조성 에 관한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
항암(종양)활성은 파래 peak 1이 가장 높았으며 그다음으로 쇠 미 역 peak 2, 파래 peak 3, 지 누아리 peak 3 순으로 높았다. 전반적으로는 김의 기능성이 가장 뛰어났으며, 이는 가장 높은 단백질함량을 가지고 있는 것도 한 이유라고 판단되며, 앞으로 저분자 peptide의 구조분석 및 아미노산 sequence의 규명도 필요하다고 본다.
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