본 연구에서는 우리나라 민속약이나 한방의 약재로 널리 사용되어 온 참쑥 (Artemisia mongolica fishcher)으로부터 추출한 쑥 추출물이 포도상구균 (Staphylococcu aurues)과 유산균 (Lactobacillus spp.)에 대해 선택적 저해 효과를 갖는지 조사하였다. 우선 항균 활성 실험을 통해 포도상구균을 저해하는 우수한 항균력을 가진 유산균 7균주를 선별하였다. 그리고 쑥을 추출한 용매의 종류, 농도 그리고 추출시간을 달리하여 쑥 추출물의 최적 농도 조건을 결정하였다. 생존율을 측정하기 위해 배양액에 각각 3일 동안 용매 $100\%$ (아세톤, 에탄올, 메탄올)로 추출한 쑥 추출물을 $17\%$ 첨가하였고, 이때 항균 활성 있는 유산균 KLB 224은 배양 48시간까지 생존하였다. 그러나 포도상구균은 동일한 조건에서 모두 사멸되었다. 또한 주사전자현미경 관찰을 통해 쑥 추출물이 세포 형태에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, 포도상구균은 세포 형태가 심하게 손상되었지만 유산균은 저해를 받지 않고 세포형태를 유지함을 관찰하였다.
본 연구에서는 우리나라 민속약이나 한방의 약재로 널리 사용되어 온 참쑥 (Artemisia mongolica fishcher)으로부터 추출한 쑥 추출물이 포도상구균 (Staphylococcu aurues)과 유산균 (Lactobacillus spp.)에 대해 선택적 저해 효과를 갖는지 조사하였다. 우선 항균 활성 실험을 통해 포도상구균을 저해하는 우수한 항균력을 가진 유산균 7균주를 선별하였다. 그리고 쑥을 추출한 용매의 종류, 농도 그리고 추출시간을 달리하여 쑥 추출물의 최적 농도 조건을 결정하였다. 생존율을 측정하기 위해 배양액에 각각 3일 동안 용매 $100\%$ (아세톤, 에탄올, 메탄올)로 추출한 쑥 추출물을 $17\%$ 첨가하였고, 이때 항균 활성 있는 유산균 KLB 224은 배양 48시간까지 생존하였다. 그러나 포도상구균은 동일한 조건에서 모두 사멸되었다. 또한 주사전자현미경 관찰을 통해 쑥 추출물이 세포 형태에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, 포도상구균은 세포 형태가 심하게 손상되었지만 유산균은 저해를 받지 않고 세포형태를 유지함을 관찰하였다.
In this study, Artemisia mongolica fischer extract was examined for its possible differential inhibitory activity against pathogenic bacteria including Staphylococcus aureus and Lactobacillus spp. isolated from women's vagina. First, seven lactobacillus spp. were selected based on their in vitro hig...
In this study, Artemisia mongolica fischer extract was examined for its possible differential inhibitory activity against pathogenic bacteria including Staphylococcus aureus and Lactobacillus spp. isolated from women's vagina. First, seven lactobacillus spp. were selected based on their in vitro high anti-staphylococcal activity. Various samples extracted using different concentrations of organic solvents (acetone, ethanol, methanol) were examined for optimal anti-staphylococal activity. When the Artemisia extract obtained using $100\%$ solvents was added to the cell suspension at $17\%$ (vol/vol), Lactobacillus sp. KLB 224 maintained its viability for 48 hr, whereas S. aureus was completely inactivated showing differential antimicrobial activity of the extract. Using scanning electron microscopy the effect of the extract on the cell morphology was observed: S. aureus showed markedly distorted cell morphology while Lactobacillus sp. KLB 224 appeared to remain intact.
In this study, Artemisia mongolica fischer extract was examined for its possible differential inhibitory activity against pathogenic bacteria including Staphylococcus aureus and Lactobacillus spp. isolated from women's vagina. First, seven lactobacillus spp. were selected based on their in vitro high anti-staphylococcal activity. Various samples extracted using different concentrations of organic solvents (acetone, ethanol, methanol) were examined for optimal anti-staphylococal activity. When the Artemisia extract obtained using $100\%$ solvents was added to the cell suspension at $17\%$ (vol/vol), Lactobacillus sp. KLB 224 maintained its viability for 48 hr, whereas S. aureus was completely inactivated showing differential antimicrobial activity of the extract. Using scanning electron microscopy the effect of the extract on the cell morphology was observed: S. aureus showed markedly distorted cell morphology while Lactobacillus sp. KLB 224 appeared to remain intact.
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문제 정의
본 연구에서는 우리나라 민속약이나 한방의 약재로 널리 사용되어 온 참쑥 (Artemisia mongolica"s/zc/zer)으로부터추출한 쑥 주출물이 포도상구균 (Staphylococcus aur“es)과 유산균 (Lactobacillus spp.)에 대해 선택적 저해 효과를 갖는지 조사하였다. 우선 항균 활성 실험을 통해 포도상구균을 저해하는 우수한 항균력을 가진 유산균 7균주를 선별하였다.
따라서 본 연구에서는 포도상 구균을 억제하는 항균 활성 유산 균을 선별하고, 쑥 추출물의 최적 농도 조건 결정하여 생균 수 측정 및 세포 형태 관찰을 통해 쑥 추출물이 항균 활성 유산균과 포도상구균에 선택적 저해 효과가 있는지 살펴보았다.
제안 방법
105개의 유산균을 MRS broth에 stock 1%접종하여 16~ 18 h 배양한 뒤, Subculture 1% 접종 후 14-16 h 배양하고 한번 더 Subculture 1% 접종하여 16-18 h 배양하였다. 1.
01 M PB buffer로 3 번 씻고 PB buffer에 남궈서 하루 동안 냉장 보관하였다. 그 후 50%, 70%, 90%, 95%, 100% 에탄올 (2번)로 10분씩 탈수시킨 뒤 하루 이상 자연 건조하였다. 시료는 SEM (Scanning Electron Microscopy, Hitach-4200, Inha univ.
우선 항균 활성 실험을 통해 포도상구균을 저해하는 우수한 항균력을 가진 유산균 7균주를 선별하였다. 그리고 쑥을 추출한 용매의 종류, 농도 그리고 추출시간을 달리하여 쑥 추출물의 최적 농도 조건을 결정하였다. 생존율을 측정하기 위해 배양액에 각각 3일 동안 용매 100% (아세톤, 에탄올, 메탄올)로 추출한 쑥 추출물을 17% 첨가하였고, 이때 항균 활성 있는 유산균 KLB 224은 배양 48시간까지 생존하였다.
포도상 구균은 BHI broth 10 ml에 1% 접종하였고 그 이후 실험은 위와 같은 방법으로 진행하였다. 대조군은 쑥 추출물을 넣지 않은 것과 용매 100% (아세톤, 에탄올, 메탄올)로 8.3%, 12.5%, 17%、心를 각각의 배지에 첨가하였다.
그러나 포도상구균은 동일한 조건에서 모두 사멸되었다. 또한 주사전자현미경 관찰을 통해 쑥 추출물이 세포 형태에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, 포도상구균은 세포 형태가 심하게 손상되었지만 유산균은 저해를 받지 않고 세포형태를 유지함을 관찰하였다.
그리고 쑥을 추출한 용매의 종류, 농도 그리고 추출시간을 달리하여 쑥 추출물의 최적 농도 조건을 결정하였다. 생존율을 측정하기 위해 배양액에 각각 3일 동안 용매 100% (아세톤, 에탄올, 메탄올)로 추출한 쑥 추출물을 17% 첨가하였고, 이때 항균 활성 있는 유산균 KLB 224은 배양 48시간까지 생존하였다. 그러나 포도상구균은 동일한 조건에서 모두 사멸되었다.
)에 대해 선택적 저해 효과를 갖는지 조사하였다. 우선 항균 활성 실험을 통해 포도상구균을 저해하는 우수한 항균력을 가진 유산균 7균주를 선별하였다. 그리고 쑥을 추출한 용매의 종류, 농도 그리고 추출시간을 달리하여 쑥 추출물의 최적 농도 조건을 결정하였다.
Fischer)을 구입하였다. 자연 건조된 쑥 100 g 을 메탄올, 에탄올, 아세톤 90, 95, 100%의 농도별로 400 I戒 사용하여 상온에서 1일 (24시간), 2일 (48시간), 3일 (72시간) 동안 침지하였다. 그 후 감압 여과하여 200 靦의 쑥 추출액을 얻었다.
포도상 구균 0.5%가 접종된 0.7% BHI soft agar 6 ml을 agar plate에 분주하고 굳힌 다음, 쑥을 추출한 용매의 종류 (Acetone, Methanol, Ethanol), 농도 (90%, 95%, 100%)와 추출 일수 (1 일, 2일, 3일)에 따라 plate 위에 각각 spotting하여 12시 간 배양한 후 저해환크기를측정하였고(21), 그 중 최적인 추출일수 3일째인 세 가지 용매의 농도 (100%)를 선택하여 생균 수로 나타내었다.
포도상 구균과 유산균의 각각 1%를 3일 동안 용매 100% (아세톤, 에탄올, 메탄올)에서 추출한 쑥 추출물을 17% 첨가하고 각각의 배지에 48시간 동안 배양하였다. 그 후 원심 분리를 하여 상등액은 버리고 cell pellet를 분리하였다.
포도상구균과 유산균 KLB 224에 Acetone, Methanol, Ethanol 용매 (100%)에서 3일 동안 추출한 쑥 추출물 8.3%, 12.5%, 17%를 각각 첨가하여 0, 24, 48시간 배양한 뒤 생균 수 측정을 하였다.
항균 활성이 좋은 것으로 선별된 유산균 (KLB 212, 224, 239, 260, 286, 288, 298)을 MRS broth 10 ml에 1% 접종한 후, 용매 100% (아세톤, 에탄올, 메탄올)에서 3일째 추출한 쑥 추출액를 8.3%, 12.5%, 17% v/v 첨가하고, 0, 24, 48시간 배양한 sample 1 ml을 CFU/ml로 하여 생균수를 측정하였다. 포도상 구균은 BHI broth 10 ml에 1% 접종하였고 그 이후 실험은 위와 같은 방법으로 진행하였다.
대상 데이터
그 후 50%, 70%, 90%, 95%, 100% 에탄올 (2번)로 10분씩 탈수시킨 뒤 하루 이상 자연 건조하였다. 시료는 SEM (Scanning Electron Microscopy, Hitach-4200, Inha univ., Incheon, Korea)을 사용하여 관찰하였다(22).
실험에 사용한 배지로서 유산균과 포도상구균은 각각 modified MRS broth 그리고 BHI broth에서 배양하였다.
유산균은 한국 여성 질 내에서 분리한 105개를 사용하였고(20), 병원균으로 포도상구균은 KTCC 25175로 사용하였다. 실험에 사용한 배지로서 유산균과 포도상구균은 각각 modified MRS broth 그리고 BHI broth에서 배양하였다.
4 cm 이었고 유산균의 항균 저해능을 확인할 수 있었다. 이 중 본 연구에서는 유산균 KLB 224를 선택하여 실험하였다.
시료의 제조
제기동의 대한 약재상에서 중국산 쑥 (Artemisia mangolica Fischer)을 구입하였다. 자연 건조된 쑥 100 g 을 메탄올, 에탄올, 아세톤 90, 95, 100%의 농도별로 400 I戒 사용하여 상온에서 1일 (24시간), 2일 (48시간), 3일 (72시간) 동안 침지하였다.
7% BHI soft agar 20 ml에 포도상 구균 1% 접종하고 골고루 잘 섞은 뒤 6 ml을 분주한 다음 20분 건조하고 12시간 동안 혐기성 배양하였다. 포도상구균을 indicator strain으로 하여 저해환의 크기가 가장 큰 7개 균주를 선별하였다.
한국 여성 질 내에서 분리한 105개의 유산균을 포도상구균에 대해 항균 활성 측정 후, 저해환 크기를 비교한 결과 항균력이 우수한 7개 균주인 유산균 KLB 212, KLB 224, KLB 239, KLB 260, KLB 286, KLB 288, KLB 298을 선별하였다. 이때 각각 평균 저해환의 크기는 2.
성능/효과
Acetone, Methanol, Ethanol 쑥 추출물 12.5%를 첨가했을 때 배양 24, 48시간에 따라 Acetone 쑥 추출물에서는 각각 9.0 X 108, 7.8 X 109 CFU/mL로 10’의 생균수가 약간 감소되거나 증가되었고, Methanol 쑥 추출물에서도 각각 8.2 x 108, 2.3 X 107 CFU/mL로 10'의 생균수가 약간 감소되었다. 또한 Ethanol 쑥 추출물에서는 각각 4.
5% not shown). Acetone, Methanol, Ethanol 쑥 추출물 17%를 첨가 했을 경우 대조구와 비교해 볼 때 배양 24시간에서 각각 106, 106, IO, 의 생균수가 감소되었고배양 48시간에는 모두 사멸되었다(Fig. 1). Lee 등에 의하면 포도상구균에 대해 각 농도별로 참쑥 정유를 첨가하여 실험을 실시하였던 바, 각 균주들에게 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교시 200ppm 농도부터 세균 성장 억제가 나타나 항세균효과를 보였다고 보고된 바 있는데(23), 본 실험에서는 참쑥의 Acetone, Methanol, Ethanol 추출물 17%를 첨가했을 때 배양 48시간에서 포도상구균은 모두 사멸되어 항균 효과가 있었다.
7 x 108 CFU/mL이었다. Acetone, Methanol, Ethanol 쑥 추출물 8.3%를 첨가했을 때 배양 24, 48시간에 따라 Acetone 쑥 추출물에서는 각각 2.1 X 109, 2.1 X 109 CFU/mL로 10°, 10'의 생균수가 유지되거나 증가되었고, Methanol 쑥 추출물에서도 각각 3.6 x 109, 1.1 X 109 CFU/mL로 10°, 10'의 생균수가 유지되거나 증가되었다. 또한 Ethanol 쑥 추출물에서도 각각 3.
또한 주사전자현미경 관찰을 통해 쑥 추출물이 세포 형태에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, 포도상구균은 세포 형태가 심하게 손상되었지만 유산균은 저해를 받지 않고 세포형태를 유지함을 관찰하였다.
보호 기전으로는 첫째, 점액에 부착하여 병원성 미생물의 유입을 방해하는 장벽을 형성하는 것, 둘째, 세포나 균에서 나오는 효소에 의해 glycogen을 lactic acid로 분해하여 양분으로 섭취하는데, 대사산물인 lactic acid가 질 내의 산도를 일정하게 유지시켜 주는 역할을 한다. 또한 과산화수소 (H2O2)와 bacteriocin 등의 미생물 생장 억제 물질을 생성하여 기회성 감염을 최소화한다고 제시하였다. 셋째, 요로생식기 상피의 수용체에서 병원체와 경쟁하는 것 등이 제시되고 있다.
용매별 쑥 추출물 중 포도상구균에 대해 가장 높은 항균 활성을 보인 쑥 추출물은 참쑥의 Acetone과 Ethanol 추출물이었다. 이때 세가지 용매 (100%)로 3일 동안 추출한 쑥 추출물의 17% v/v를 첨가했을 경우 가장 크게 포도상구균의 생균수는 저해되었다.
한국 여성의 질에서 분리된 유산균 KLB 224는 항균 활성과 쑥 추출물에 의한 생균수 측정 그리고 주사전자현미경 관찰에서 모두 좋은 결과를 나타냈으며 반면 포도상구균은 저해되었다. 위의 결과를 종합해 볼 때 쑥 추출물이 유산균과 포도상구균에 대해 분명한 선택적 저해효과를 갖는 것을 확인하였다.
추출 용매에 의해 저해를 받는지 알아보기 위해 세 가지 용매 100%를 위와 동일한 조건에서 각각 실험한 결과, 전적으로 쑥 추출물 효과에 의해 포도상구균이 저해되는 것이 아님을 알 수 있었고 유산균 KLB 224의 생균 수는 약간 감소하거나 조금 증가하였다(data not shown). 또한 추출 방법을 달리하여 참쑥에서 추출한 정유 성분만을 첨가한다면 더욱 더 억제 효과가 있을 것이다.
포도상구균은 대조구와 비교해 볼 때 Methanol 용매에서 세포 형태가 약간의 타격을 받았으며, 참쑥의 Acetone, Ethanol 추출물에서는 세포 표면이 심하게 찌그러지고 뜯긴 상태로 상당히 세포 형태가 손상되었음을 알 수 있었다(Fig. 3(A)).
3(A)). 하지만 동일한 조건에서 최대 항균 활성을 가지는 균주 중 유산균 KLB 224에 3일째 Acetone, Methanol, Ethanol 용매 (100%)에서 추출한 쑥 추출물 17% (v/v)을 첨가하여 48시간 배양한 뒤 주사전자현미경을 사용하여 세포 형태를 확인한 결과, 유산균은 전체적으로 모두 저해 받지 않고 세포 형태를 유지하였다(Fig. 3(B)).
3(B)). 한국 여성의 질에서 분리된 유산균 KLB 224는 항균 활성과 쑥 추출물에 의한 생균수 측정 그리고 주사전자현미경 관찰에서 모두 좋은 결과를 나타냈으며 반면 포도상구균은 저해되었다. 위의 결과를 종합해 볼 때 쑥 추출물이 유산균과 포도상구균에 대해 분명한 선택적 저해효과를 갖는 것을 확인하였다.
후속연구
감소하거나 조금 증가하였다(data not shown). 또한 추출 방법을 달리하여 참쑥에서 추출한 정유 성분만을 첨가한다면 더욱 더 억제 효과가 있을 것이다.
이로 인해서 정상적인 질의 환경이 유지되고 질 내 숙주 방어 작용이 강화되어 더욱 효과적일 것이다. 앞으로 한국 여성의 질염 치료 방법 및 세정제의 개발에 있어서 중요한 역할을 하게 될 것이다.
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