[논문]체외 배양 체계가 체외수정 및 유전자 미세주입 수정란의 발달에 미치는 영향

박용수; 민관식

체외 배양 체계가 체외수정 및 유전자 미세주입 수정란의 발달에 미치는 영향
Effects of In Vitro Culture Systems on the Development of In Vitro Fertilized or DNA-Microinjected Embryos 원문보기

Reproductive & developmental biology = 한국동물번식학회지, v.29 no.3, 2005년, pp.181 - 186

박용수 (경상북도 축산기술연소) , 민관식 (한경대학교 생명정보통신대학원)

초록
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본 연구에서는 배양 체계(혈청 첨가 TCM199, TALP, CRlaa 및 혈청 미첨가; IVMD101, IVF100, IVMD101)가 체외수정 또는 미세주입된 수정란의 체외 발달에 미치는 효과를 검토하였다. 또한 미세주입에 사용하는 GFP유전자의 양 및 미세주입 수정란에서 형광발현 양상을 검토하였다. 체외수정된 수정란의 $\geq$ 2세포기, 8세포기 및 배반포 도달율이 미세주입 수정란에 비하여 유의하게 높았다. 혈청 미첨가 배지에서의 8세포기 발달율이 수정란의 종류에 관계없이 유의하게 높았으나(p<0.05; $ 3.3\%\;vs.\;15.5\%$ 및 $21.4\%\;vs.\;39.4\%$, respectively), 배반포 도달율은 유사한 경향이었다($2.7\%\;vs.\;2.3\%$ 및 $23.0\%\;vs.\;23.6\%$, respectively). 한편, 2ng/uL 유전자를 미세주입한 수정란의 $\geq$ 2세포기, 8세포기 및 배반포 도달율이 4 및 8ng/uL의 것에 비하여 높은 경향이었다. 미세주입 수정란의 형광발현율은 1세포기가2및 8세포기에 비하여 유의하게 높았으나(p<0.05), 4세포기 및 배반포 단계와는 차이가 없었다.

Abstract ▼ AI-Helper

This experiment was conducted to investigate effects of the two different in vitro production systems, serumcontaining system (IVM, IVF and IVC; TCM199, TALP and CR1aa) and serum-free system (IVM, IVF and IVC; IVMD101, IVMD100 and IVMD101), on the development of in vitro fertilized or DNA-microiniected embryos. We also examined the effect of DNA dosage and its expression pattern in embryos. The DNA used for microinjection was a green fluorescence protein gene. The development rates to $\geq$ 2cell, 8cell and blastocyst stage were significantly higher in vitro fertilized embryos than those in DNA-microinjected embryos. The development rate to the 8-cell stage was significantly higher in serum-free system than in serum-containing system (p<0.05; $3.3\%\;vs.\;15.5\%\;and\;21.4\%$, respectively). The development rates to the blastocyst stage of in vitro fertilzed or DNA-microinjected embryos between two different culture system ($2.7\%\;vs.\;2.3\%\;and\;23.0\%\;vs.\;23.6\%$, respectively) were not different. The development rates of embryos injected 2 ng/uL DNA was higher. than those of embryos injected 4 or 8 ng/uL DNA. The GFP expression rate of 1-cell embryos was significantly higher than that of 2-cell and 4-cell embryos, whereas the rates were not different between 4-cell and blastocyst-stage embryos.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 배양 체계(혈청 첨가 및 혈청 미첨가)가 체외수정 및 미세주입된 수정란의 발달에 대한 효과와 미 세 주입에 사용하는 유전자의 양 및 수정란에서 GFP 유전자의 발현 양상을 검토하였다.
본 연구에서는 배양 체계가 체외수정 및 미세주입된 수 정란의 발달에 대한 효과와 미세주입에 사용하는 유전자의 양 및 유전자 미세주입 수정란에서 GFP 유전자의 발현 양상을 검토하였다.

가설 설정

1,2; a,b,c: Values within column with different superscript differ(P<0.05).

제안 방법

한우 동결정액 1개(KPN388)를 실온에서 10초간, 37℃의 항온수조에서 30초간 처리하여 융해한 후 90% percoll (Sigma, P4937) 2mL 용액이 담겨져 있는 15mL 원심분리 관(Corning 430052)에 살며시 놓은 후 700g에서 20분간 원심분리 후 하층부의 정자괴만을 회수하여, 2mL Sperm- TALP 용액으로 350g에서 다시 10분간 원심분리함으로써 정자를 세척하였다. 그리고 정자 농도는 25xl06 spermato- zoa/mL가 되도록 조절하여, 난포란 이 함유되어져 있는 46 “L의 체외수정용 배지에 heparin 2"L 와 정자 2“L를 첨가(최종 정자 농도 1x106 spermatozoa/mL)하여 39℃, 5% COz 배양기에 20시간 배양함으로써 체외수정을 유도하였다.
수정란은 20uL의 10% FBS 첨가 TCM199 배지에 넣고, 도립현미경(Olympus)에서 미세조작 장치(Narishige)를 이용하여 웅성 전 핵 내에 DNA를 미세주입하였다. 미세주입 수정란에서 유전자의 발현 검정은 EGFP filter(EX 488-507; Olympus, Japan) 하에서 하였다(Fig. 2).
체외수정 또는 미세주입된 수정란(배양 1일)은 3mg/mL BSA가 첨가된 체외배양용 배지로 2회 세척한 후 미리 준비한 20uL 배지에 20개씩 넣어 39℃, 5% COz 배양기에 배양하였다. 배양 3 및 5일째에 10% FBS가 첨가된 체외배양용 배지로 교환하여 배양하였다.
3% Hyaluronadise (Sigma, H-4272)를 5분간 처리하여 난구 세포를 제거하였다. 수정란은 10% FBS가 첨가된 ImL TCM199 배지에 넣고 15,000g, 5분간 원심분리하였다. 수정란은 20uL의 10% FBS 첨가 TCM199 배지에 넣고, 도립현미경(Olympus)에서 미세조작 장치(Narishige)를 이용하여 웅성 전 핵 내에 DNA를 미세주입하였다.
수정란은 10% FBS가 첨가된 ImL TCM199 배지에 넣고 15,000g, 5분간 원심분리하였다. 수정란은 20uL의 10% FBS 첨가 TCM199 배지에 넣고, 도립현미경(Olympus)에서 미세조작 장치(Narishige)를 이용하여 웅성 전 핵 내에 DNA를 미세주입하였다. 미세주입 수정란에서 유전자의 발현 검정은 EGFP filter(EX 488-507; Olympus, Japan) 하에서 하였다(Fig.
체외수정 18~19시간째에 수정란을 0.3% Hyaluronadise (Sigma, H-4272)를 5분간 처리하여 난구 세포를 제거하였다. 수정란은 10% FBS가 첨가된 ImL TCM199 배지에 넣고 15,000g, 5분간 원심분리하였다.

대상 데이터

도죽 한우에서 난소를 적줄하여 25 p. g/mL gentamycin (Sigma, G1264)이 첨가된 0.9% 생리식염수(25~28℃)가 들 어있는 보온병에 담아 3시간 이내에 실험실로 운반하였다. 수집된 난소는 penidllin G(Sigma, P3032)가 첨가된 생리식염수로 3~4회 세척하여, 18G 주사침이 부착된 10mL 주사기를 이용하여 직경 2~8mm의 가시 난포로부터 난 포란을 회수하였다.
난소로부터 미성숙 난포란의 회수용 배지는 10mM HE- PES 와 3mg/mL bovine serum albumin(BSA: Sigma, A- 9647)이 첨가된 TALP(HEPES-TALP) 용액이다. 난포란의 체외성숙용 배지는 0.22mg/mL pyruvate(Sigma, P-5280), 10 % fetal bovine serum (FBS: Gibco, 16000-044), Img/ mL follicle stimulating hormone(Sigma, F-8174), 10/zg /mL luteinizing hormone(Sigma, L-9773), lOmg/mL heparin (Sigma, H-3149) 이 각각 첨가된 TCM199(Gibco, 12340-030) 배지를 사용하였다. 체외수정용 배지는 6mg/ mL BSA (Sigma, A-6003) 및 lOmg/mL heparin (Sigma, H- 3149)이 첨가된 IVF-TALP 용액이며, 정자 처리용 배지는 3mg/mL fraction V BSA(Sigma, A-9647) 가 첨가된 Spe- rm-TALP 용액이다.
9% 생리식염수(25~28℃)가 들 어있는 보온병에 담아 3시간 이내에 실험실로 운반하였다. 수집된 난소는 penidllin G(Sigma, P3032)가 첨가된 생리식염수로 3~4회 세척하여, 18G 주사침이 부착된 10mL 주사기를 이용하여 직경 2~8mm의 가시 난포로부터 난 포란을 회수하였다. 회수된 난포란은 실체현미경 하에서 난구 세포 의 부착상태가 치밀한 것만을 선별하여, 50“L의 체외성숙용 배지에 15개 난 포란을 옮겨 20시간 동안 39℃, 5% COi 배 양기에 배양함으로써 체외 성숙을 유도하였다.
체외성숙용 배지는 IVMDIOIeP, IVMD101), 체외수정 및 정자 처리용 배지는 IVF100(IFP, IVF100) 및 체외배양용 배지는 INMD101 을 각각 이용하였다
22mg/mL pyruvate(Sigma, P-5280), 10 % fetal bovine serum (FBS: Gibco, 16000-044), Img/ mL follicle stimulating hormone(Sigma, F-8174), 10/zg /mL luteinizing hormone(Sigma, L-9773), lOmg/mL heparin (Sigma, H-3149) 이 각각 첨가된 TCM199(Gibco, 12340-030) 배지를 사용하였다. 체외수정용 배지는 6mg/ mL BSA (Sigma, A-6003) 및 lOmg/mL heparin (Sigma, H- 3149)이 첨가된 IVF-TALP 용액이며, 정자 처리용 배지는 3mg/mL fraction V BSA(Sigma, A-9647) 가 첨가된 Spe- rm-TALP 용액이다. 한편 체외배양용 배지는 3mg/mL BSA 또는 10% FBS가 첨가된 CRlaa 용액이다.

데이터처리

실험 결과에 대한 통계학적 분석은 z'test와 SPSS 10.0 프로그램 이용한 일원 배치 분산분석을 통한 Duncan's test를 실시하였으며, 유의차는 p<0.05 수준에서 검정하였다.

이론/모형

Min 등(2004)이 사용한 pABWN 동물세포 발현 벡터를 이용하여 E-actin promoter 하류에 Xho I site에 Xhol과 Sal 으로 절단한 GFP 유전자를 삽입하여 GFP 미세주입용 유전자를 구죽하였다(Fig. 1).

성능/효과

7%로서 유사한 경향이었다. 배양체계에 따른 체외수정 수정란의 수정율과 8세포기 발달율은 IVMD 군이 76.4 및 39.4%로서 CRlaa 군의 63.5 및 21.4%에 비하여 유의하 게 높았다(p<0.05). 배반포기 발달율은 23.
7%이고 배반포 단계에서는 25~33%였다(Chan 등, 1999; Murakami 등, 1999; Wang 등, 2001). 본 연구에서는 주입한 DNA가 발현된 수정란의 비율이 총 29.1%로서 이전의 연구보다 높은 경향이었으나, 배반포 단계에서는 33%로서 비슷하였다. Cousens 등(1994) 및 본 연구에서는 미세주입한 DNA의 발현 양상이 배 발달 단계가 진행될수록 낮아지는 경향이었으나, Wang 등(2001)은 반대의 경향이었다.
3과 같다. 총 131개의 미세주입 수정란의 형광색 발현율이 1세포기, 2세포기, 4세포기, 8세포기 및 배반포기에서 각각 51.7, 28.6, 42.9, 30.6 및 33.3%로서, 1세포기의 발현율이 2세포기 및 8세포기의 것보다 유의하게 높았다 0 <0.05).
05). 한편 배양 체계에 따른 미세주입 수정란의 발달율은 수정율은 25.3 및 31.0%로서 비슷하였으나, 8세 포기 발달율은 IVMD 군이 15.5%로서 CRlaa 군의 3.3%보다 유의하게 높았다(p<0.05). 그러나 배반포 발달율은 2.

후속연구

본 연구에서는 배지의 종류에 따른 체외수정 및 미세주입 수정란의 각각 배반포도 달 율은 비슷한 경향으로 Im 등(2004)과는 상이하였다. 그러나 무혈청 배지인 IVMD101 군의 8세포기 도달율이 유의하게 높은 경향인 것은 이 배양체계를 개선한다면 미세주입 수정란의 배양에 효과적으로 사용할 수 있을 것이다. 한편 배 발달율은 Murakami 등(1999)과 본 연구에서 미세주입 수정란의 배반포 도달율이 체외수정란에 비하여 낮았다.
한편 전체적인 발생율은 이전의 연구보다 낮았으나, 배반포 단계에서 형광 발현율은 본 연구가 높은 경향이었다(Menck 등, 1998; Han 등, 1997; Takada 등, 1997). 따라서 형질전환 소 생산에 이용하는 유전자의 양은 발현율과 배 발생을 동시에 보장할 수 있는 적정 농도의 검토가 선행되어야 할 것으로 생각된다 .
미세주입법을 이용한 형질전환 소의 생산 효율성을 향상 시키기 위해서는 무혈청 배지를 이용하는 배양체계와 주입 하는 유전자 종류에 따른 각각의 주입량에 대한 검토가 필요할 것으로 생각된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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